高　麗，曹　麗（中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所，北京海淀100193）

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豬IL-10基因的原核表達純化及功能鑒定

高麗，曹麗
（中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所，北京海淀100193）

摘要：為進一步研究豬IL-10及其生物活性，本研究將豬IL-10基因克隆至原核表達載體pGEX-4T-1，并成功獲得其重組蛋白。用IPTG誘導重組蛋白表達，通過GST-親和柱層析對重組蛋白進行純化，將純化的重組蛋白處理豬肺泡巨噬細胞，顯著抑制PRRSV感染誘導的IL-12表達，將重組蛋白免疫家兔以制備抗血清，然后利用雙向瓊脂擴散方法、Western Blot試驗對抗血清效價、特異性等生物活性進行了檢測。結(jié)果表明，該抗血清具有較高的抗體效價和很好的特異性，可以作為IL-10特異性抗體用于今后的試驗研究。

關(guān)鍵詞：豬IL-10；抗血清

白細胞介素10（IL-l0）是一種重要的多細胞來源的免疫調(diào)節(jié)性細胞因子[1]。IL-10可抑制活化的Thl和NK細胞分泌IFN-γ[2]，并通過誘導BCL-2促進B細胞生存[3]。另外，還可以促進B細胞增殖[4]和向漿細胞分化[5]。IL-10還參與DC細胞的分化發(fā)育及功能[6]。作為內(nèi)源性的免疫抑制因子，IL-l0能抑制機體炎性反應，對某些自身免疫病和移植排異反應具有潛在的預防和治療作用。IL-10對許多急、慢性炎癥反應、自身免疫性疾病和器官移植具有潛在的臨床應用價值。豬IL-10基因人的IL-10相比同源性較高，本研究通過原核表達豬的IL-10基因，制備IL-10的多克隆抗體，為進一步研究豬IL-10的生物學功能提供基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1菌種和質(zhì)粒E.coli DH5α感受態(tài)細胞，BL21感受態(tài)細胞，表達載體pGEX-4T-1，均由本實驗室保存。

1.2IL-10基因的克隆與pGEX-4T-10表達載體的構(gòu)建用TRIZol從豬肺泡巨噬細胞提取總RNA，依據(jù)豬IL-10基因序列（NM_214041）設計引物，上游引物：5′-CGGGATCCATG CCCAGCT?CAGCACTG-3′，下游引物：5′-GGAATTCTGCTTCA GTTCTTCCTCATCTTC-3′，在上游和下游引物中分別加入BamH I和EcoR I酶切位點。取1 μg RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR反應程序: 94℃預變性5 min；94℃變性30 s/51.6℃退火30 s/72℃延伸1 min，32個循環(huán)；72℃終止反應10 min。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行回收，用BamH I和EcoR I雙酶切，與同樣經(jīng)過BamH I和EcoR I的載體pGEX-4T-1連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中。挑取陽性克隆并提取質(zhì)粒，用EcoRV進行酶切鑒定。酶切鑒定正確的質(zhì)粒送測序。

1.3重組IL-10蛋白的原核表達，鑒定與純化將重組質(zhì)粒pGEX-4T-10轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞BL-21，1 mmol/L IPTG誘導表達，于誘導前（0 h）和誘導后1，2，3 h收集菌體，超聲破碎后經(jīng)15%SDSPAGE檢測重組蛋白質(zhì)的表達，隨后用Western-Blot對重組蛋白進行鑒定，對獲得的重組蛋白質(zhì)用GST-親和柱層析進行純化，最后用SDS-PAGE和OD值對純化后的蛋白進行定量。

1.4抗血清制備將0.6 mg純化的重組蛋白免疫家兔，首免時將蛋白溶液與弗氏完全佐劑等體積混勻，背部皮下多點注射，此后與等量的弗氏不完全佐劑混勻，免疫方法同前，每次免疫間隔兩周，第3次免疫1周后耳緣靜脈采血，檢測抗體效價，達標后進行加強免疫，一周后頸動脈插管取血，收集血清檢測效價。

1.5抗血清效價測定用雙向瓊脂糖擴散法檢驗抗體效價，具體如下：在直徑約5.5 cm的培養(yǎng)皿中加入5 mL加熱溶解的1.2%瓊脂糖PBS溶液，膠板約0.5 cm左右，凝固后將畫好的樣本圖襯在培養(yǎng)皿下面按相應位置打孔，孔徑約3 mm，周圍孔距中心約1 cm。將抗原用pH值7.2的PBS稀釋至一定濃度，抗血清則利用連續(xù)2倍稀釋的方法同樣以pH值7.2的PBS梯度稀釋，最終將抗原液加入到中間的小孔，四周則加入陰性對照血清和抗性血清，每孔8 μL。將培養(yǎng)皿蓋蓋好并用封口膜密封，放入濕盒內(nèi)，置于37℃下24～48 h，觀察沉淀線分布。

1.6抗血清在Western-Blot中的應用將重組真核表達載體pcDNA-IL-10轉(zhuǎn)染Hela細胞，裂解細胞收集細胞蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，依次用制備的抗血清（1∶5 000倍稀釋）和HRP標記的山羊抗兔抗體孵育PVDF膜分析IL-10的表達，鑒定抗血清的反應性。

2　結(jié)果

2.1IL-10基因的克隆與鑒定本研究從豬肺泡巨噬細胞中克隆獲得515 bp IL-10基因編碼序列（圖1A），并通過BamH I&EcoR I酶切位點將DNA片段克隆到載體pGEX-4T-1，得到重組載體pGEX-4T-10，用EcoR V酶切驗證，2號克隆切下一條3 500 bp左右和一條2 000 bp左右的條帶，與預期一致，為陽性結(jié)果（圖1B），其余兩株菌均為空載體。將2號菌株進行測序，核酸序列準確無誤，構(gòu)建的載體經(jīng)測序分析，確認插入片段及引物、限制性酶切位點準確無誤。

圖1　IL-10基因的克隆與鑒定

2.2IL-10融合蛋白的原核表達，鑒定及純化將重組表達質(zhì)粒pGEX-4T-10以及空載體pGEX-4T-1轉(zhuǎn)化BL-21感受態(tài)細胞，并用IPTG誘導表達，在誘導前和誘導后不同時間點分別取樣檢測，結(jié)果如圖2A顯示，空載體在27 kD左右有一條明顯的誘導蛋白條帶，為GST蛋白條帶。pGEX-4T-10在46 kD左右也有一條明顯的誘導蛋白條帶，與預期一致，初步判斷是GST-IL-10融合蛋白。用Western-Blot進一步證實表達的蛋白是IL-10（圖2B）。用GST-親和柱層析對蛋白進行純化，結(jié)果（圖2C）顯示，純化后獲得純度較高的目的蛋白，通過SDS-PAGE定量分析和OD595值檢測測定蛋白純化后濃度為2 000 μg/mL滿足后續(xù)試驗要求。

2.3IL-10融合蛋白的功能檢測PRRSV感染豬肺泡巨噬細胞顯著誘導IL-12的表達，而在細胞培養(yǎng)上清中加入不同濃度的IL-10表達產(chǎn)物，則會明顯抑制PRRSV誘導的IL-12的表達（圖3）。

2.4抗血清效價檢測及在Western Blot試驗中的應用將抗血清與100 mg/mL抗原進行瓊脂糖凝膠擴散免疫反應，如圖4A，沉淀線在原液至1∶16間清晰可見，而1∶32處隱約有白色線條，抗血清效價可至少達1∶16，效價較好。

將pcDNA-IL-10轉(zhuǎn)染Hela細胞表達IL-10，收集蛋白用抗血清作為一抗檢測IL-10的表達，結(jié)果顯示（圖4B），裂解蛋白在相應的位置出現(xiàn)了特異性反應條帶，表明所制備的抗血清能夠特異性識別真核細胞表達的IL-10蛋白。

圖2　IL-10融合蛋白的原核表達，鑒定及純化

圖3　IL-10融合蛋白功能驗證

圖4　抗血清特異性檢測

3　討論

豬IL-10基因于1995年被首次克隆[7]，在此之前，國內(nèi)外對人IL-10研究較多，而對豬IL-10的研究相對較少。近年來發(fā)現(xiàn)豬作為一種與人類親緣性比較近的哺乳動物，其體內(nèi)臟器與人類臟器大小相似，如果用動物來制造人類所需臟器，之后再進行器官移植，那么豬無疑是個很好的選擇?；谝陨蟽牲c，再鑒于IL-10的多功能性，對于豬IL-10的研究也越來越廣泛、深入。

本研究應用分子克隆的手段將豬的IL-10的片段插入原核表達載體pGEX-4T-1，利用該載體的GST標簽通過GST-親和柱層析對重組蛋白進行純化，將純化的重組蛋白免疫家兔以制備抗血清，并利用雙向瓊脂擴散方法、Western Blot試驗對抗血清效價、特異性等生物活性進行了檢測，該抗血清具有較高的抗體效價和很好的特異性，可以作為豬IL-10特異性抗體用于今后的試驗研究

參考文獻：

[1] Hedrich C M，Bream J H.Cell type-specific regulation of IL-10 expression in inflammation and disease[J].Immunol Res，2010.47 （1-3）：185-206.

[2] Moore K W，de Waal Malefyt R，Coffman R L，et al.Interleukin-10 and the interleukin-10 receptor[J].Annu Rev Immunol，2001. 19：683-765.

[3] Levy Y，Brouet J C.Interleukin-10 prevents spontaneous death of germinal center B cells by induction of the bcl-2 protein[J] . J Clin Invest，1994.93（1）：424-428.

[4] Rousset F，Garcia E，Defrance T，et al.Interleukin 10 is a potent growth and differentiation factor for activated human B lympho?cytes[J].Proc Natl Acad Sci U S A，1992，89（5）：1890-1893.

[5] Rousset F，Peyrol S，Garcia E，et al.Long-term cultured CD40-activated B lymphocytes differentiate into plasma cells in response to IL-10 but not IL-4[J].Int Immunol，1995，7（8）：1243-1253.

[6] Martin C，Espaillat M P，Santiago-Schwarz F.IL-10 restricts den?dritic cell（DC）growth at the monocyte-to-monocyte-derived DC interface by disrupting anti-apoptotic and cytoprotective autopha?gic molecular machinery[J].Immunol Res，2015，63（1-3）：131-143.

[7] Blancho G，Gianello P，Germana S，et al.Molecular identification of porcine interleukin 10：regulation of expression in a kidney allograft model[J].Proc Natl Acad Sci U S A，1995，92（7）：2800-2804.

中圖分類號：S852.65+1

文獻標志碼：A

文章編號：0529-6005（2016）05-0040-03

收稿日期：2016-02-23

基金項目：國家自然科學基金青年項目（311408）

作者簡介：高麗（1986-），女，助理研究員，博士，從事抗病毒天然產(chǎn)物的篩選與機制研究，E-mail：lgao@implad.ac.cn

通訊作者：曹麗，E-mail：lcao@implad.ac.cn