李自青，趙立峰，劉　宏（1.山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山西大同07009；2.山西大同大學(xué)呼吸病與職業(yè)病研究所，山西大同07009；.天津市北辰區(qū)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，天津北辰00400）

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鹿出血性腸炎病原菌的分離和鑒定

李自青1，2，趙立峰3，劉宏1，2
（1.山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山西大同037009；2.山西大同大學(xué)呼吸病與職業(yè)病研究所，山西大同037009；3.天津市北辰區(qū)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，天津北辰300400）

摘要：通過對(duì)死于出血性腸炎的圈養(yǎng)鹿的病原菌進(jìn)行分離鑒定，為研制產(chǎn)氣莢膜梭菌β-毒素單價(jià)和多價(jià)疫苗奠定基礎(chǔ)。采集山西省內(nèi)不同地區(qū)鹿場因出血性腸炎而死亡鹿的病料32例，經(jīng)病原微生物分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)和血清型鑒定，分離得到C型產(chǎn)氣莢膜梭菌，并測定分離菌所產(chǎn)毒素對(duì)小鼠的最小致死量。PCR擴(kuò)增C型產(chǎn)氣莢膜梭菌β-毒素基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T-J28-C，進(jìn)行酶切鑒定和核苷酸序列分析。結(jié)果32株分離菌中有6株是C型產(chǎn)氣莢膜梭菌，占18.7%；其余均為A型，占81.3%。篩選出毒力最強(qiáng)的菌株J28-C，最小致死量（MLD）為5.0×105CFU/mL。PCR擴(kuò)增和核苷酸序列分析表明，經(jīng)PCR得到了特異性的β毒素基因片段。表明造成山西省鹿出血性腸炎的病原菌為A型和C型產(chǎn)氣莢膜梭菌，以A型為主。

關(guān)鍵詞：出血性腸炎；C型產(chǎn)氣莢膜梭菌；分離；鑒定

產(chǎn)氣莢膜梭菌廣泛存在于土壤、人和動(dòng)物的腸道及糞便中。根據(jù)菌體產(chǎn)生的外毒素，將其分成A、B、C、D、E 5型。A型主要產(chǎn)生α毒素，能引起食物中毒和氣性壞疽，C型主要引起動(dòng)物和人類的壞死性腸炎。產(chǎn)氣莢膜梭菌是動(dòng)物出血性腸炎的主要病原菌[1]，動(dòng)物一旦發(fā)病，死亡率很高，治療效果不理想，因此最有效的方法是采用疫苗預(yù)防。該研究采集32例山西省內(nèi)不同地區(qū)的鹿場因出血性腸炎而死亡鹿病料，進(jìn)行病原體的分離和鑒定，并克隆出C型產(chǎn)氣莢膜梭菌特異的β毒素基因片段，旨在為制備單價(jià)或多價(jià)滅活疫苗奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1死亡鹿病料采集病料共32例，分別來自靈石縣夏門鹿場，昔陽縣大寨鹿場，山西藥物培植場南樊、里冊等鹿場因出血性腸炎而死亡的鹿，收集病死鹿小腸內(nèi)容物置于冰壺，-20℃保存。

1.2動(dòng)物ICR品系小鼠，體重10～12 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.3菌株和分型血清C59-2產(chǎn)氣莢膜梭菌，B、C、D、E產(chǎn)氣莢膜梭菌分型血清，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；受體菌大腸桿菌DH5α，質(zhì)粒載體pMD18-T，購自Promega公司。

1.4分離純化細(xì)菌死亡鹿小腸內(nèi)容物涂片，經(jīng)革蘭染色后用顯微鏡觀察菌體形態(tài)。取疑似產(chǎn)氣莢膜梭菌的菌落接種在血平板上，37℃下恒溫培養(yǎng)18～24 h，觀察在平板上是否出現(xiàn)α、β雙溶血環(huán)。挑取有清晰雙溶血環(huán)的典型菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。

1.5生化試驗(yàn)純培養(yǎng)菌落進(jìn)行生化試驗(yàn)，包括卵磷脂試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、石蕊牛乳發(fā)酵試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、H2S試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)和吲哚試驗(yàn)等。

1.6血清型鑒定試驗(yàn)用分離純化的產(chǎn)氣莢膜梭菌純培養(yǎng)物與分型血清做血清型鑒定試驗(yàn)，鑒定分離菌株的血清型。

1.7毒力測定純化的細(xì)菌培養(yǎng)物取上清液按10-1，10-2，10-3，10-4稀釋，分別尾靜脈注射體重10～12 g小鼠，每組5只，每只0.2 mL（5.0×108CFU/mL），同時(shí)設(shè)立對(duì)照，根據(jù)小鼠死亡情況確定各分離菌的最小致死劑量（minimum lethal dose，MLD）。

1.8分離菌和標(biāo)準(zhǔn)菌株染色體DNA的提取和PCR擴(kuò)增DNA提取按文獻(xiàn)[2]方法進(jìn)行。引物根據(jù)GenBank中的β-毒素基因序列進(jìn)行設(shè)計(jì)[3]。P1：5′-CGCCTGCAGCCAATGATATAGG TAAAAC-3′；P2：5′-CCGGAATTCTTAATAGC TGTTACTTT?GTG-3′。P1和P2上分別有酶切位點(diǎn)Pst I和EcoR I。PCR反應(yīng)條件：96℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，52℃退火40 s，72℃延伸80 s，33個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增片段大小約為700 bp。將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至載體pMD18-T中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-TJ28-C，酶切鑒定正確后進(jìn)行測序。

2　結(jié)果

2.1革蘭染色鏡檢結(jié)果病死鹿腸道取樣均可見一種經(jīng)革蘭染色呈陽性的細(xì)菌，短桿狀、兩端鈍圓、單個(gè)或呈雙排列、有莢膜、粗大正直，有時(shí)在菌體近端或中央觀察到有芽孢，呈現(xiàn)卵圓形，與C型產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)菌株形態(tài)相符（見圖1，圖2）。

圖1　C型產(chǎn)氣莢膜梭菌C59-2菌株形態(tài)

圖2　分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株形態(tài)

2.2細(xì)菌生長特性和菌落的形態(tài)分離菌在血平板上培養(yǎng)后，菌落呈灰白色、圓形隆起、表面光滑、周圍有雙溶血環(huán)、外環(huán)不完全溶血，內(nèi)環(huán)完全溶血；在25℃有氧條件中放置1 h后變成草綠色或灰綠色。分離菌在厭氧肉肝胃酶消化湯試管中生長時(shí)，可見產(chǎn)生大量氣體，液面上有白色泡沫，初步判斷分離菌是產(chǎn)氣莢膜梭菌。

2.3生化試驗(yàn)結(jié)果對(duì)分離的32株菌株的15項(xiàng)生化指標(biāo)測定結(jié)果表明，能發(fā)酵麥芽糖、棉子糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉；明膠液化試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、H2S試驗(yàn)、石蕊牛乳試驗(yàn)、卵磷脂酶試驗(yàn)均為陽性；甘露醇、水楊苷、靛基質(zhì)及吲哚試驗(yàn)為陰性。符合產(chǎn)氣莢膜梭菌的生化和生理特征。

2.4血清型鑒定結(jié)果分離的32株細(xì)菌中，其中6株菌的毒素可以被B、C型抗毒素血清中和，而不能被D、E型抗毒素血清中和，可以確定這6株的血清型是C型，占18.7%。其余26株菌的毒素都能被B、C、D、E型抗毒素血清中和，表明26株菌株的血清型都是A型。

2.5最小致死量測定結(jié)果對(duì)分離的C型產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行毒力測定，篩選出毒力最強(qiáng)菌株，MLD 為10-3稀釋倍數(shù)（5.0×105CFU/mL），命名為J28-C。

2.6PCR擴(kuò)增和序列分析經(jīng)PCR技術(shù)，從C型產(chǎn)氣莢膜梭菌染色體中擴(kuò)增700 bp的β毒素基因片段（見圖3），經(jīng)EcoR I / Pst I酶切后，插入載體pMD18-T相應(yīng)的酶切位點(diǎn)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T-J28-C，經(jīng)EcoRⅠ/ Pst I酶切鑒定（見圖4）和核苷酸序列測定，證實(shí)該克隆質(zhì)粒含有β毒素基因片段，與Hauer報(bào)道的序列一致[3]。

圖3　β毒素基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖4　重組質(zhì)粒pMD18-T-J 28-C的酶切電泳

3　討論

鹿出血性腸炎是以胃腸道出血為主要特征的一種疾病，其發(fā)病較急、病程較短，死亡率非常高[4]。產(chǎn)氣莢膜梭菌5個(gè)毒素型都有致病性，但究竟是由一種還是幾種毒素類型共同作用引起的鹿出血性腸炎觀點(diǎn)還不一致。高文偉[5]等對(duì)山西省鹿出血性腸炎的病料分析發(fā)現(xiàn)，主要由A型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起，代振洲[6]等則認(rèn)為是由C型和D型引起。本試驗(yàn)采集山西省不同地區(qū)鹿場32例因出血性腸炎而死亡鹿的病料，分離培養(yǎng)病原體發(fā)現(xiàn)，有6例為C型產(chǎn)氣莢膜梭菌，占18.7%，其余的為A型，約81.3%。研究結(jié)果表明，山西省內(nèi)引起鹿出血性腸炎流行的病原菌是產(chǎn)氣莢膜梭菌A型和C型，但以A型為主。從而為今后山西省內(nèi)鹿出血性腸炎的綜合防制提供了依據(jù)。

產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素是由B型和C型菌產(chǎn)生的致死性毒素，是引起動(dòng)物和人類腸炎和腸毒血癥的主要致病因子[7]。Schumacher V L等[8]研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷在豬發(fā)生產(chǎn)氣莢膜梭菌C型腸炎的早期階段起著重要作用。許崇波等[9]從C型產(chǎn)氣莢膜梭菌中分別克隆出β1和β2基因，并構(gòu)建了α-β1-β2融合基因，發(fā)現(xiàn)融合蛋白具有較好的免疫原性。本研究從C型產(chǎn)氣莢膜梭菌染色體中成功克隆了β-毒素基因，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMD18-T-J28-C，經(jīng)酶切鑒定和核苷酸序列分析，表明β-毒素的基因結(jié)構(gòu)和編碼序列是正確的。為下一步研制產(chǎn)氣莢膜梭菌β-毒素單價(jià)和多價(jià)基因工程苗奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

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Isolation and Characterization of the Pathogens within Deers Died from Hemorrhagic Enteritis

LI Zi-qing1，2，ZHAO Li-feng3，LIU Hong1，2
（1.Medical College of Shanxi Datong University，Datong，037009，Datong 037009，China；
2.Respiratory and Occupational Disease Research Institute of Shanxi Datong University，Datong 037009，China；
3.The service center for development of aquaculture industry in beechen district in tianjin，Tianjin 300400，China）

Abstract：Isolating and identifying the pathogens within deer died from hemorrhagic enteritis，and providing information for developing beta toxin gene engineering subunit vaccine and bacterial toxin polyvalent vaccine.Samples were collected from 32 cas?es of cervus hemorrhagic enteritis in Shanxi province，and the major microbial pathogen were isolated and examined microscopical?ly，and then identified through serum reaction.A Beta-toxin gene was amplified by PCR and The recombinant plasmid pMD18-TJ28-C was constructed.The recombinant plasmid pMD18-T-J28-C was studied in detail by restriction endonucleases analysis and nucleotide sequencing.The results showed that 6 of 32 isolated were Clostridium perfringens type C，accounting for 18.7%，and the rest were type A，about 81.3%.The most virulent strain J28-C was selected and its minimum lethal dose（MLD）was 5.0×105CFU. Further，PCR and sequence analysis showed that the recombinant pMD18-T-J28-C possessed a positive beta-toxin gene sequenc?es，and a reading frame.Hemorrhagic enteritis in Shanxi province is caused by Clostridium perfringens of type A and C，and type A is the major pathogen.

Key words：Hemorrhagic colitis；Type C Clostridium perfringens；Isolation；Characterization Corresponding author：LIU Hong

中圖分類號(hào)：S852.63

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0529-6005（2016）05-0032-03

收稿日期：2015-05-27

基金項(xiàng)目：大同市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（201361）

作者簡介：李自青（1980-），女，碩士，講師，主要從事分子生物學(xué)與腫瘤免疫學(xué)研究，E-mail：liziqing_1234@163.com

通訊作者：劉宏，E-mail：a-liuhong@163.com