李展城 蔡大可 舒友平 千永香

【摘要】目的：探究丹參水溶性物質(zhì)SA-B對TGF-β1活化細(xì)胞內(nèi)Smad與p38MAPK信號傳導(dǎo)通路的抑制作用。方法：將腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同的藥物，誘導(dǎo)組加入20μg/ml的馬兜鈴酸進(jìn)行誘導(dǎo)；實(shí)驗(yàn)A1、A2、A3組，在誘導(dǎo)組的基礎(chǔ)上分別加入5、10、20μg/ml的丹參水溶性物質(zhì)SA-B；對照組不加任何藥物。細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72h后檢測各組的TGF-β1-mRND水平、培養(yǎng)液中TGF-β1的含量、Smad以及p38MAPK的表達(dá)進(jìn)行，記錄檢測結(jié)果。結(jié)果：誘導(dǎo)組的TGF-β1-mRND水平、TGF-β1蛋白含量分泌與對照組相比，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且實(shí)驗(yàn)組的同期誘導(dǎo)組相比，水平顯著下降（P<0.05）。誘導(dǎo)組的Smad與p38MAPK合成趨勢明顯，而實(shí)驗(yàn)組Smad與p38MAPK的表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢。結(jié)論：丹參的水溶性物質(zhì)-SA-B對TGF-β1活化細(xì)胞內(nèi)Smad與p38MAPK信號傳導(dǎo)通路具有顯著的抑制作用。

【關(guān)鍵詞】丹參水溶性物質(zhì)SA-B；TGF-β1；Smad；p38MAPK

【中圖分類號】R285.5【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2016）09-0018-02

研究發(fā)現(xiàn)，丹參水溶性物質(zhì)SA-B對于TGF-β1活化細(xì)胞內(nèi)Smad與p38MAPK信號傳導(dǎo)通路具有顯著的抑制作用，表明丹參水溶性物質(zhì)SA-B在降低腎組織轉(zhuǎn)化因子-β1（TGF-β1）水平的過度表達(dá)方面，具有顯著的抑制作用[1]。研究采用丹參水溶性物質(zhì)SA-B，并借助馬兜鈴酸誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞TGF-β1，探究丹參水溶性物質(zhì)SA-B對TGF-β1活化細(xì)胞內(nèi)Smad與p38MAPK的抑制作用。

1材料與方法

1.1試劑與藥品丹參水溶性物質(zhì)SA-B（批號：111871-201001，中國藥品生物制品檢定所），實(shí)驗(yàn)時(shí)配置成濃度分別為5、10、20μg/ml的三種試劑進(jìn)行使用。TGF-β1 ELISA試劑盒（美國R&D公司）；抗Smad抗體（美國CST公司）；抗p38MAPK抗體（美國CST公司）。腎小管上皮組織細(xì)胞。

1.2實(shí)驗(yàn)方法將腎小管上皮細(xì)胞用含2%胎牛血清的K-SFM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，取第6～7代細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。當(dāng)細(xì)胞生長到80%融合時(shí)，更換無血清培養(yǎng)液[2]。12h以后進(jìn)行細(xì)胞分組。誘導(dǎo)組加入20μg/ml的馬兜鈴酸進(jìn)行誘導(dǎo)；實(shí)驗(yàn)組：分成A1、A2、A3三個(gè)小組，在誘導(dǎo)組的基礎(chǔ)上分別加入5、10、20μg/ml的丹參水溶性物質(zhì)SA-B；對照組不加任何藥物。觀察不同劑量的丹參水溶性物質(zhì)SA-B對TGF-β1、Smad以及p38MAPK表達(dá)水平的影響。

1.3測定方法①采用熒光定量PCR檢測TGF-β1-mRND水平。②ELISA檢測培養(yǎng)液中TGF-β1的含量，吸取培養(yǎng)液后分析取上清，并按照ELISA試劑盒的說明進(jìn)行操作，采用酶標(biāo)儀讀取吸光度，并計(jì)算TGF-β1的含量。③用免疫印跡法檢測Smad以及p38MAPK的表達(dá)，在細(xì)胞分裂后提取蛋白定量，加入Smad抗體（1∶[KG-*3/5]400）與p38MAPK（1∶[KG-*3/5]400）抗體；過夜以后將HRP標(biāo)記的IgG（1∶[KG-*3/5]500）加入[3]。放置1h后將ECL液加入，顯影后在暗室曝光，最后進(jìn)行圖像分析。以上三種測定方式，分別在每組細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72h后進(jìn)行，記錄檢測結(jié)果。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差（x[TX-*3]±s）的形式表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率（%）表示，用χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1丹參水溶性物質(zhì)SA-B對TGF-β1-mRND水平表達(dá)的影響誘導(dǎo)組的TGF-β1-mRND水平在刺激24、48h后持續(xù)上升，72h有所降低，但仍處于高水平，與對照組相比，P<0.05；實(shí)驗(yàn)組在采用丹參水溶性物質(zhì)SA-B進(jìn)行干預(yù)24、48h后，TGF-β1-mRND水平顯著下降，與誘導(dǎo)組相比，P<0.05；且在48h以后，TGF-β1-mRND的下降水平更加明顯（P<0.05）。見表1。

2.2丹參水溶性物質(zhì)SA-B對TGF-β1蛋白含量的影響誘導(dǎo)組的TGF-β1蛋白含量分泌增加，與對照組相比，P<0.05；在72h有所降低，但仍顯著高于對照組（P<0.05）；而實(shí)驗(yàn)組的TGF-β1蛋白含量與同時(shí)期的誘導(dǎo)組相比，顯著下降。且在48h以后，丹參水溶性物質(zhì)SA-B對TGF-β1的抑制作用隨著用量的增加而加強(qiáng)。見表2。

2.3丹參水溶性物質(zhì)SA-B對Smad與p38MAPK表達(dá)的影響誘導(dǎo)組的Smad與p38MAPK合成趨勢明顯，而實(shí)驗(yàn)組在采用丹參水溶性物質(zhì)SA-B干預(yù)后，Smad與p38MAPK的表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢。且在72h后，Smad與p38MAPK的高表達(dá)持續(xù)下降。見表3 。

3討論

丹參是臨床較為常見的一種藥材，在消炎、抗菌、抗凝血方面，具有顯著的作用，臨床上主要用于心血管系統(tǒng)、神經(jīng)神經(jīng)的保護(hù)[4]。丹參酸是丹參中的水溶性活性成分，其中以丹參酸A和丹參酸B的活性最強(qiáng)，在抗脂質(zhì)過氧化、清除氧自由基、保護(hù)心臟、心腦血管、防治動(dòng)脈粥樣硬化、抗腫瘤等方面有顯著的生物活性，常用于心肌缺血再灌注損傷、心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞等的保護(hù)中。實(shí)驗(yàn)表明，丹參酸B在抑制大鼠心肌缺血再灌注損傷過程中的鈣離子超載、改善血栓素/前列環(huán)素（TXA2/PGI2）平衡系統(tǒng)、減少內(nèi)皮素（ET）及腫瘤壞死因子a（TNF-a）的釋放、降低缺氧/復(fù)氧損傷后內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞間粘附分子的表達(dá)方面具有顯著作用。此外，丹參的水溶性物質(zhì)SA-B對于降低腎組織TGF-β1的過度表達(dá)，抑制腎小管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化與纖維化等具有顯著的作用[5]。研究結(jié)果顯示，丹參的水溶性物質(zhì)SA-B對于降低TGF-β1-mRND表達(dá)、抑制TGF-β1蛋白含量分泌具有顯著的作用，且對于TGF-β1活性細(xì)胞中的Smad與p38MAPK過量表達(dá)也有顯著的抑制作用。

綜上所述，丹參的水溶性物質(zhì)SA-B能夠抑制TGF-β1活化細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量分泌，對于細(xì)胞內(nèi)的Smad與p38MAPK也具有顯著的抑制作用。

參考文獻(xiàn)

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（收稿日期：2016.03.17）