陳忠杰，李利紅，李存法，胡　燕（河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南鄭州450011）

?

槐花多糖對小鼠免疫調(diào)節(jié)作用的試驗(yàn)

陳忠杰，李利紅，李存法，胡燕
（河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南鄭州450011）

摘要：以槐花為試材，研究槐花多糖對小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用。將槐花多糖用生理鹽水配制成一定濃度的溶液，以腹腔注射的方法作用于小鼠，測定小鼠外周血和脾臟淋巴細(xì)胞增殖、腹腔巨噬細(xì)胞活性和免疫器官指數(shù)等指標(biāo)的變化。結(jié)果1.0 mL/d的槐花多糖注射量可以顯著促進(jìn)小鼠外周血和脾臟淋巴細(xì)胞的增殖，提高小鼠巨噬細(xì)胞活性，并促進(jìn)小鼠免疫器官的生長發(fā)育。

關(guān)鍵詞：槐花；多糖；免疫調(diào)節(jié)

槐花（Sophora japonica）又名槐蕊，為豆科植物槐（Sophora japonica L）的干燥花朵及花蕾，前者習(xí)稱為“槐花”，后者習(xí)稱為“槐米”?；被ㄖ泻胸S富的蛋白質(zhì)、脂肪、糖、多種維生素，還含有刀豆酸、槐花二醇、蕓香苷、三萜皂苷、白樺脂醇、葡萄糖醛酸、蘆丁等，使其具有抗氧化性、抗病毒、抗真菌、抗腫瘤、降壓、擴(kuò)冠等作用、降血脂作用、抑制醛糖還原酶作用、致突變作用等很多功能特性［1］。目前，對槐花的研究主要集中在黃酮類化合物上，把槐花作為提取蘆丁的主要原料［2］。槐花的藥理作用多樣，化學(xué)成分復(fù)雜。為合理開發(fā)利用槐花資源，必須對槐花進(jìn)行全面的研究［3］。多糖是自然界和生物體中廣泛存在的物質(zhì)，它是生物體內(nèi)一類重要的大分子，具有提高免疫能力、降血糖、抗腫瘤、抗病毒等功能，是藥理學(xué)研究的新熱點(diǎn)。目前，對槐花多糖功能作用的研究較少，只涉及到其抗氧化［4］和抑菌功能［4］。本實(shí)驗(yàn)旨在研究槐花多糖對小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用，為槐花作為免疫增強(qiáng)藥物的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料昆明種純系小鼠，5周齡，由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

以干洋槐花為材料，用水提法提取槐花多糖。提取工藝為：干槐花→粉碎→過孔徑為0.425 mm篩→乙醚脫脂→干燥后得脫脂樣品→取脫脂樣品，加適量蒸餾水→80℃浸提6 h→離心（4 000 r/min離心15 min）→沉淀加蒸餾水進(jìn)行第2次提?。ㄌ崛?次）→合并4次離心上清液→減壓濃縮→濃縮液中加入乙醇，使其體積分?jǐn)?shù)為80%→沉淀依次用無水乙醇、丙酮和乙醚洗滌→干燥，得粗多糖樣品［3］。

1.2主要試劑淋巴細(xì)胞分離液，上海泛柯實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)；噻唑藍(lán)（MTT），上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)；二甲亞砜（DMSO），成都貝斯特試劑有限公司生產(chǎn)；青霉素、鏈霉素、小牛血清、刀豆蛋白A （ConA）和脂多糖（LPS），均由上海江萊生物科技有限公司生產(chǎn)；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)用生理鹽水將槐花多糖樣品配制成1 mg/mL的溶液供使用。取小鼠48只，隨機(jī)均分為4組。其中三組為試驗(yàn)組，一組為對照組。試驗(yàn)Ⅰ組均每天分別腹腔注射槐花多糖每只0.5 mL，試驗(yàn)Ⅱ組均每天分別腹腔注射槐花多糖每只1 mL，試驗(yàn)Ⅲ組均每天分別腹腔注射槐花多糖每只1.5 mL，對照組Ⅳ組均每天分別腹腔注射生理鹽水每只1 mL，連續(xù)7 d。其他飼養(yǎng)條件均按正常進(jìn)行。在最后一次注射24 h后，每組隨機(jī)抽取6只小鼠腹腔注射8%蛋白胨溶液2 mL，再24 h后進(jìn)行眼眶采血，用500 IU/mL的肝素抗凝，隨后加入等量的D-Hank′s液，測定外周血淋巴細(xì)胞的增值。隨后快速宰殺小鼠，腹腔注射經(jīng)滅菌的D-Hank′s液8 mL，收集腹腔液，測定腹腔巨噬細(xì)胞活性。最后采取脾臟，制備成單個(gè)細(xì)胞懸液，測定脾臟淋巴細(xì)胞的增值。每組所剩6只小鼠在最后一次注射24 h后，測定免疫器官指數(shù)。

1.4檢測指標(biāo)和方法

1.4.1淋巴細(xì)胞增殖測定采用MTT比色法。取上述待測樣本，加入淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞。分別加入96孔培養(yǎng)板，加入適量ConA或LPS，放置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，每孔加入5 mg/mL的MTT 10 μL，繼續(xù)放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，每孔加入DSMO 100 μL溶解細(xì)胞。10 min后于酶標(biāo)儀中檢測A570值。

1.4.2巨噬細(xì)胞活性測定［5］取所收集的腹腔洗液于1 000 r/min離心10 min，用3 mL D-Hank′s液重懸，再離心洗滌1次；用1640完全培養(yǎng)液重懸，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)（1×106/mL）。每組細(xì)胞懸液100 μL，重復(fù)4孔，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，換新鮮1 640培養(yǎng)液。繼續(xù)孵育2 h后，各孔加10 μL MTT，輕搖1 min，溫育4 h，加DMSO，震蕩30 s，測A570值。

1.4.3免疫器官指數(shù)測定將小鼠空腹稱重，用常規(guī)方法宰殺，分離出免疫器官脾臟和胸腺，并測定重量，計(jì)算出免疫器官指數(shù)。免疫器官指數(shù)=器官重g/活體重g。

1.5數(shù)據(jù)處理方法采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，LSD法比較差異顯著值，以P＜0.05為顯著水平。

2　結(jié)果

2.1外周血淋巴細(xì)胞增殖變化槐花多糖對小鼠外周血淋巴細(xì)胞增殖的影響見表1。與對照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組（每只小鼠每天腹腔注射1 mg/mL的槐花多糖溶液0.5 mL），對ConA誘導(dǎo)和LPS誘導(dǎo)的小鼠外周血淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)作用均不明顯（P＞0.05）；試驗(yàn)Ⅱ組（每只小鼠每天腹腔注射1 mg/mL的槐花多糖溶液1.0 mL），能顯著增強(qiáng)ConA誘導(dǎo)的小鼠外周血淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)（P＜0.05），但對LPS誘導(dǎo)的該反應(yīng)作用不明顯（P＞0.05）；試驗(yàn)Ⅲ組（每只小鼠每天腹腔注射1mg/ml的槐花多糖溶液1.5 mL），對ConA誘導(dǎo)和LPS誘導(dǎo)的小鼠外周血淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)均有明顯作用（P＜0.05）。

表1　槐花多糖對小鼠外周血淋巴細(xì)胞增殖的影響

2.2脾臟淋巴細(xì)胞增殖變化槐花多糖對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響見表2。與對照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組均對由ConA誘導(dǎo)的小鼠外周血淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)作用不明顯（P＞0.05），但試驗(yàn)Ⅲ組能顯著增強(qiáng)由ConA誘導(dǎo)的小鼠外周血淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)（P＜0.05）；三個(gè)試驗(yàn)組均對由LPS誘導(dǎo)的小鼠外周血淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)作用不明顯（P＞0.05）。

表2　槐花多糖對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響

2.3腹腔巨噬細(xì)胞活性變化槐花多糖對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用見表3。與對照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞活性的作用不明顯（P＞0.05），而試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅲ組均能顯著提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的活性（P＜0.05）。

表3　槐花多糖對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用

2.4免疫器官指數(shù)變化槐花多糖對小鼠免疫器官指數(shù)的影響見表4。與對照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組對脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響均不明顯（P＞0.05）；試驗(yàn)Ⅱ組對脾臟指數(shù)影響不顯著（P＞0.05），但能顯著提高胸腺指數(shù)（P＜0.05）；試驗(yàn)Ⅲ組能顯著提高脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。

表4　槐花多糖對小鼠免疫器官指數(shù)的影響

3　小結(jié)與討論

淋巴細(xì)胞是白細(xì)胞的一種。由淋巴器官產(chǎn)生，是機(jī)體免疫應(yīng)答功能的重要細(xì)胞成分。通常分為T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞。淋巴細(xì)胞的增殖能力經(jīng)常被用來評價(jià)機(jī)體免疫應(yīng)答水平?；被ǘ嗵怯写龠M(jìn)小鼠淋巴細(xì)胞增殖的作用，但是不同的注射量影響不同。如1.0 mL/d的多糖注射量可以顯著增強(qiáng)由ConA誘導(dǎo)的小鼠外周血淋巴細(xì)胞的增殖，但是0.5 mL/d的注射量作用不明顯。這說明足量的槐花多糖才能達(dá)到較好效果。而且同一注射量對由ConA誘導(dǎo)或由LPS誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖作用也不同。如1.0 mL/d的多糖注射量可以顯著增強(qiáng)由ConA誘導(dǎo)的小鼠外周血淋巴細(xì)胞的增殖，但對由LPS誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖作用則不明顯。這可能是因?yàn)镃onA誘導(dǎo)T細(xì)胞的增殖，而LPS誘導(dǎo)B細(xì)胞的增殖，所以槐花多糖中有效成分的作用機(jī)制不盡相同。

巨噬細(xì)胞也屬于免疫細(xì)胞，但是其屬于不繁殖細(xì)胞群，所以主要考查其活性。槐花多糖可以提高巨噬細(xì)胞活性。試驗(yàn)中，0.5 mL/d的注射量作用不明顯，但是1.0 mL/d和1.5 mL/d的注射量均能顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞活性。同時(shí)，1.0 mL/d的注射量和1.5 mL/d的注射量對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞活性的影響差異不大，說明多糖用量也不是越大越好。

免疫器官的發(fā)育狀況直接影響機(jī)體免疫應(yīng)答水平和抵抗外來微生物的感染和侵入的能力，其絕對重量和相對重量增加，說明機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫機(jī)能增強(qiáng)［6］。一定量的多糖注射量可以促進(jìn)小鼠脾臟和胸腺的生長發(fā)育。但是不同注射量的影響不同。比如1.0 mL/d的注射量能顯著促進(jìn)小鼠胸腺的生長，但是對脾臟影響不明顯。具體機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，一定的槐花多糖注射量可以明顯增強(qiáng)小鼠外周血和脾臟淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)，提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的活性，促進(jìn)小鼠免疫器官的生長發(fā)育，從而提高小鼠免疫力。因此值得進(jìn)一步深入研究和探討，為槐花多糖作為免疫增強(qiáng)藥物的開發(fā)提供更多科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

［1］馬利華.乳酸菌發(fā)酵對槐花營養(yǎng)及抗氧化性的影響［J］.食品工業(yè)科技，2009（4）：200-207.

［2］吳虹霽，蘭昌云，陳媛.槐花的研究進(jìn)展［J］.廣東微量元素科學(xué)，2006，13（6）：1-6.

［3］王麗華，段玉峰，馬艷麗，等.槐花多糖的提取工藝及抗氧化活性研究［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，36（8）：213-217.

［4］胡喜蘭，姜琴，尹福軍，等.正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選槐花多糖的最佳提取工藝及抑菌活性研究［J］.食品科技，2012，37（4）：164-167.

［5］儲岳峰，李祥瑞，胡元亮.9種中藥成分對小鼠免疫細(xì)胞活性的影響［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，27（1）：97-100.

［6］楊小燕，林躍鑫，李焰.銀杏葉對肉雞生長性能免疫功能和血清生化指標(biāo)的影響［J］.中國獸醫(yī)雜志，2007，43（2）：37-39.

中圖分類號：R 282

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號：0529- 6005（2016）03- 0115- 03

收稿日期：2014-09-29

作者簡介：陳忠杰（1978-），男，講師，碩士，從事生物制藥方面的研究，E-mail：chzhji@126.com