魏春華，戴愛玲，李曉華，劉建奎，陳澤銘，楊小燕（龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)福建省高等學(xué)校重點實驗室福建省人畜寄生與病毒性疫病防控工程技術(shù)研究中心，福建龍巖364012）

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福建省豬偽狂犬病病毒新流行株gD、gE基因遺傳變異分析

魏春華，戴愛玲，李曉華，劉建奎，陳澤銘，楊小燕
（龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)福建省高等學(xué)校重點實驗室福建省人畜寄生與病毒性疫病防控工程技術(shù)研究中心，福建龍巖364012）

摘要：為了解福建地區(qū)豬偽狂犬病病毒（PRV）流行毒株的分子生物學(xué)特性與變異規(guī)律。本試驗分離了2011-2013年福建省不同地區(qū)的11株P(guān)RV，并對其gD、gE基因進行遺傳變異分析。結(jié)果表明，福建地區(qū)被檢測的規(guī)?；i場均存在野毒感染，病料接種PK-15細胞均能出現(xiàn)典型的細胞病變，分離的毒株接種家兔能出現(xiàn)典型的偽狂犬病癥狀。PRV gD、gE基因序列分析表明，自2011年福建地區(qū)PRV同源性較高且處于一個獨立的分支，表明福建地區(qū)流行的PRV可能存在一定的抗原變異。

關(guān)鍵詞：偽狂犬病病毒；分離鑒定；gD基因；gE基因；變異

偽狂犬?。≒seudorabies，PR）是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的多種家畜和野生動物的一種高度接觸性傳染病，可導(dǎo)致懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎，哺乳仔豬出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，死亡率達90%以上，并有從單一感染向混合感染擴大的趨勢，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。PRV屬于皰疹病毒科，基因組為線狀雙股DNA，基因組全長約為150 kb，gD糖蛋白為病毒增殖所必需，具有重要的抗原表位，在病毒感染和宿主免疫過程中起著重要作用，也是目前疫苗研究的熱點［1］。gE基因是PRV的主要毒力相關(guān)基因，也是世界動物衛(wèi)生組織（DIE）所規(guī)定基因缺失疫苗的首選缺失基因［3］。

自2011年開始，PRV在福建地區(qū)豬場中出現(xiàn)大面積感染現(xiàn)象，包括免疫了基因缺失苗的規(guī)?；i場，陽性率普遍升高，疫情日趨嚴重。許多發(fā)達國家（如美國，丹麥等）已經(jīng)成功施行PR凈化工程。但為什么現(xiàn)有的疫苗尚不能完全有效地控制福建地區(qū)所有或大部分豬偽狂犬病流行，這是我們亟待解決的一個重大問題。本試驗旨在通過對福建地區(qū)流行毒株的gD、gE基因的分子特征開展研究，初步分析不同病毒株間的感染力和免疫原性的差異，為該地區(qū)豬場的預(yù)防和控制PRV提供參考。

1　材料與方法

1.1病毒樣品2011-2013年在福建地區(qū)無菌采集了臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、腦脊髓炎、敗血癥癥狀、呼吸系統(tǒng)癥狀、流產(chǎn)、死胎、不育為特征的疑似PRV感染豬只的腦、腎臟、脾臟等組織，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要試劑宿主菌細胞DH5α、PK-15細胞由本實驗室保存。PCR相關(guān)試劑、pMD18-T載體、限制性內(nèi)切酶、DNA Marker、組織基因組DNA提取試劑盒，均購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品。

1.3引物設(shè)計參考羅飛（2011）合成gD基因的特異性引物，參考魏春華（2012）和陸芹章（2005）合成gE基因的檢測引物和gE全基因擴增的引物［3-5］。

1.4病毒分離將處理過的病料上清液接種于長成單層的PK-15細胞，PBS輕洗后加入DMEM維持液，每天觀察細胞病變（CPE），當CPE出現(xiàn)80%時收毒，反復(fù)凍融，離心后取上清-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5病毒純化及理化鑒定采用病毒蝕斑純化的方法純化病毒，理化性質(zhì)鑒定參考吳云飛進行［6］。

1.6易感動物接種試驗將經(jīng)純化后的病毒按照一定的比例進行稀釋后接種家兔，對照組接種DMEM維持液。

1.7PRV gD、gE的擴增及測序分析按照TaKa-Ra DNA提取試劑盒說明書提取PRV DNA。gD、gE PCR擴增體系為25 μL反應(yīng)體系：10×Ex PCR Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP 2 μL，DNA模板2 μL，20 mmol/L上下游引物各0.6 μL，Ex Taq DNA聚合酶0.25 μL，用ddH2O補至25 μL。試驗采用降落式PCR方法進行目的片段的擴增。將PRV gD、gE目的基因經(jīng)膠回收后連接至pMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化至DH5α中，經(jīng)PCR和酶切鑒定后，送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，測序結(jié)果采用DNAStar軟件繪制系統(tǒng)遺傳進化樹。

2　試驗結(jié)果與分析

2.1病料檢測將疑似PR的腦、腎組織進行勻漿，按照試劑盒提取病毒DNA，以其為模板，利用PRV gE檢測引物進行PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下觀察可見300 bp左右擴增出一特異條帶，大小與預(yù)期結(jié)果相符（見圖1），表明該豬場存在野毒感染。

圖1　PRV部分福建分離株gE基因的PCR擴增結(jié)果M：Marker DL-2 000；1～6：FJ01-FJ06，respectively；7：陰性對照

2.2病毒的分離在PK-15細胞上盲傳至第3代時，于接毒后第36小時產(chǎn)生明顯CPE，可見細胞腫脹，變圓，呈現(xiàn)明顯的拉網(wǎng)狀，共分離11株FJ01-FJ 11株，其中2011年3株，2012年4株，2013年4株。其中FJ05毒株接種病變?nèi)鐖D2所示。

圖2　A 36 h正常PK- 15細胞?。?00×）

圖2　B　接種FJ 05后36 h CPE（100×）

2.3病毒效價的測定按照Reed-Muench法計算病毒的TCID50為10-6.2～10-7.25/100 μL，均屬于強毒株。

2.4兔體接種試驗結(jié)果在接種40 h后，病兔啃咬注射部位皮膚，繼之體溫下降，四肢麻痹，最后角弓反張，抽搐死亡，對照組兔子正常。

2.5PRV gD、gE基因序列分析利用PCR方法擴增出完整的gD、gE基因編碼序列，克隆到pMD-18T載體進行測序，測序結(jié)果表明，11株P(guān)RV gD彼此間核苷酸和氨基酸的同源性分別為98.2%～99.7%、98.6%～99.5%與參考毒株分別為97.7%～99.7%、98.2%～99.5%，推導(dǎo)的氨基酸序列也都僅在個別位點發(fā)生變異。11株P(guān)RV gE彼此間核苷酸和氨基酸的同源性分別為97.3%～100%、98.4%～100%與參考毒株分別為94.2%～99.7%、94.5%～99.5%，推導(dǎo)的氨基酸序列也都僅在個別位點發(fā)生變異。

利用生物學(xué)軟件MEGA6.06對PRV的gD基因序列進行核苷酸比對的結(jié)果表明，所分離的毒株分為2大群，以FJ02為代表的3株毒株處于一個獨立的分支，其余8株處于同一分支上，其中只有毒株FJ01與疫苗Bartha毒株親緣關(guān)系較近，其余親緣關(guān)系較遠。福建2012年之后流行毒株與2011年福建農(nóng)林大學(xué)分離的毒株FZ親緣關(guān)系較遠，處于不同的分支上（圖3）。gE基因進行核苷酸序列比對，結(jié)果表明，本實驗室分離的毒株分為2大群，以FJ03為代表的9株處于一個相對獨立的分支，與以前分離的參考毒株的親緣關(guān)系較遠，2株與河南2011-2013年分離的毒株親緣關(guān)系較近（圖4）。綜上所述，表明福建流行毒株自2011年可能發(fā)生了變異。

圖3　PRV- gD基因的遺傳進化樹

3　討論

目前國內(nèi)防控PR主要依靠基因缺失苗，許多發(fā)達國家（如美國，丹麥等）通過基因缺失疫苗和鑒別診斷方法已經(jīng)成功施行PR凈化工程。我國借鑒歐盟的經(jīng)驗，成功引起PR基因缺失疫苗Bartha 61，并取得了較好的免疫效果，有效的控制了PR。但是自2011年開始，規(guī)?；i場感染PR日趨嚴重，即使接種了基因缺失疫苗的豬場也發(fā)生PR野毒感染。

圖4　PRV- gE基因的遺傳進化樹

為了更好地了解福建地區(qū)PRV的分子生物學(xué)特性與變異規(guī)律，為以后的該病的防控和新型疫苗的研究提供更加清楚的分子生物學(xué)背景，本試驗對2011-2013年分離出的毒株gD、gE基因進行了克隆和序列分析。結(jié)果表明，11株P(guān)RV-gD基因彼此間核苷酸和氨基酸的同源性分別為98.2%～99.7%、98.6%～99.5%，11株P(guān)RV-gE基因彼此間核苷酸和氨基酸的同源性分別為97.3%～100%、98.4%～100%，表明2011年以來福建地區(qū)PRV變異程度較小，這為福建地區(qū)偽狂犬病的防控提供理論基礎(chǔ)。PRV-gD遺傳進化樹表明，所分離的毒株分為2大群，以FJ02為代表的3株毒株處于一個獨立的分支，其余8株處于同一分支上，其中只有毒株FJ01與疫苗Bartha毒株親緣關(guān)系較近，其余親緣關(guān)系較遠。福建地區(qū)2012年之后流行毒株與2011年福建農(nóng)林大學(xué)分離的毒株FZ親緣關(guān)系較遠，處于不同的分支上，親緣關(guān)系稍遠，表明流行毒株gD基因發(fā)生一定程度的變異。PRV-gE遺傳進化樹表明，本實驗室分離的毒株分為兩大群，除了2株與河南2011-2013年分離的毒株親緣關(guān)系較近、處于同一分支外，其余以FJ03為代表的9株處于一個相對獨立的分支，與以前分離的參考毒株的親緣關(guān)系較遠，推測福建地區(qū)流行的PRV-gE基因可能存在一定的抗原變異，這些病毒株是否形成一個新的流行毒株群，需要進一步研究。常洪濤［7］研究表明，現(xiàn)有的疫苗株能有效的抵御河南新PRV強毒的攻擊，彭金美［8］研究表明，Bartha K 61活疫苗免疫豬僅能誘導(dǎo)對HeN1分離株低水平的中和抗體，部分省份豬場流行的PRV可能存在一定的抗原變異，現(xiàn)有的疫苗能否能對福建地區(qū)流行毒株起到免疫保護，需要動物試驗進一步驗證。

由于PRV野毒在我國豬場長期存在，且隨著豬場養(yǎng)殖管理的改變、環(huán)境因素的變化，增加了PRV野毒的變異性［8-12］。我們應(yīng)加強對該病的分子流行病學(xué)調(diào)查、監(jiān)測及病原變異規(guī)律的研究工作，深入開展致病機制和免疫機理等基礎(chǔ)研究，為我國研發(fā)更具針對性、安全、高效的疫苗提供科學(xué)依據(jù)。

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Genetic variation analysis of thegD and gE geneof new epidemiology of Porcine Pseudorabies Virus in Fujian

WEI Chun-hua，DAI Ai-ling，LI Xiao-hua，LIU Jian-kui，CHEN Ze-ming，YANG Xiao-yan
（College of Life Sciences of Longyan University，Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine and Biotechnology，Engineering Research Center for the Prevention and Control of Zoonosis，Longyan 364012，China）

Abstract：To study the genetic diversity，the molecular epidemiology and phylogenetic relationship of Pseudorabies virus （PRV）in Fujian province，the gD and gE gene in 11 PRV isolated from 2011 to 2013 were sequenced and analyzed.The results showed that PRVs were found in all detected farms，and the isolated virus could cause typical cytopathogenic effect（CPE）in PK-15 cell and the rabbits injected with the isolated virus showed typical symptoms of pseudorabies，such as pruritus，palsy，opisthotonos and death in the end.Sequence alignments of gD and gE indicated that gD and gE genes were highly homologous，which belong to a relatively independent sub-branch in phylogenetic analysis.We speculate that the prevalence of PRVs might have antigenic variation to some extent since 2011 in Fujian province.

Key words：PRV；isolation and identification；gD gene；gE gene；Genetic variation

中圖分類號：S852.65+5

文獻標志碼：A

文章編號：0529- 6005（2016）03- 0015- 03

收稿日期：2014-11-14

基金項目：福建省科技重大專項項目（2014NZ0002-3）；龍巖市科技創(chuàng)新平臺（2013LY07）

作者簡介：魏春華（1983-），女，實驗師，碩士，主要從事分子病原學(xué)研究，E-mail：weichunhua02@163.com

通訊作者：楊小燕，E-mail：lyyxy1988@126.com

Corresponding author：YANG Xiao-yan