曾楊梅，楊　森，段培強(qiáng)，陳紅偉，吳俊偉（西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶榮昌402460）

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苯扎溴銨及土霉素誘導(dǎo)大腸埃希菌耐藥株AcrAB- TolC外排泵調(diào)控基因變異研究

曾楊梅，楊森，段培強(qiáng)，陳紅偉，吳俊偉
（西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶榮昌402460）

摘要：為探討細(xì)菌對(duì)消毒劑和抗菌藥物耐藥性之間的相關(guān)性，本試驗(yàn)分別用亞抑菌濃度苯扎溴銨和土霉素分別對(duì)大腸埃希菌質(zhì)控菌ATCC25922進(jìn)行體外誘導(dǎo)，測(cè)定誘導(dǎo)前后最小抑菌濃度（MIC）的變化；并對(duì)誘導(dǎo)后菌株外排泵調(diào)控基因acrR、marA、soxS、rob進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，檢測(cè)其突變情況。結(jié)果顯示，菌株經(jīng)苯扎溴銨和土霉素誘導(dǎo)后對(duì)苯扎溴銨和土霉素均產(chǎn)生了耐藥性，且誘導(dǎo)后的菌株有相同基因的同一位點(diǎn)發(fā)生突變，marA、soxS所編碼的氨基酸也有同一位點(diǎn)發(fā)生突變，提示大腸埃希菌對(duì)苯扎溴銨及土霉素的交叉耐藥與調(diào)控基因位點(diǎn)的突變有一定相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：大腸埃希菌；外排泵；調(diào)控基因；土霉素；苯扎溴銨

隨著抗菌藥物的廣泛使用，臨床上多重耐藥細(xì)菌不斷出現(xiàn)，細(xì)菌耐藥機(jī)制眾多，包括主動(dòng)外排、改變作用靶位、改變膜通透性等。大腸埃希菌是目前發(fā)現(xiàn)外排泵最多的一種細(xì)菌，其中AcrAB -TolC是大腸埃希菌最主要的、占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的多藥外排系統(tǒng)［1］。同樣，由于消毒劑的廣泛使用，細(xì)菌對(duì)消毒劑亦會(huì)產(chǎn)生耐藥性。已有相關(guān)報(bào)道表明［2-4］，亞抑菌濃度的消毒劑能誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥，且由消毒劑誘導(dǎo)耐藥的菌株可對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥。本試驗(yàn)通過(guò)用苯扎溴銨和土霉素分別對(duì)大腸埃希菌質(zhì)控株ATCC25922進(jìn)行體外誘導(dǎo)，檢測(cè)誘導(dǎo)后菌株對(duì)苯扎溴銨和土霉素的多重耐藥性，并對(duì)誘導(dǎo)后菌株的AcrABTolC外排泵調(diào)控基因acrR、marA、soxS、rob進(jìn)行測(cè)序分析，進(jìn)一步探究細(xì)菌對(duì)消毒劑與抗菌藥物耐藥之間的相關(guān)性，以期為臨床正確使用消毒劑和抗菌藥物提供理論指導(dǎo)。

1　材料與方法

1.1藥品土霉素，含量為87.4%；批號(hào)：130105，購(gòu)自石家莊華曙制藥集團(tuán)；苯扎溴銨，含量為5%；批號(hào)：130201，購(gòu)自四川金山制藥有限公司。

1.2菌株大腸埃希菌質(zhì)控菌株ATCC25922，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，批號(hào)：20120517；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，批號(hào)：20120719，均購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.4儀器設(shè)備LRH-150型生化培養(yǎng)箱；SWCJ-1F超凈工作臺(tái)；YXQ-LS-50SⅡ型高壓蒸汽滅菌鍋；數(shù)顯穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀。

1.5體外抑菌試驗(yàn)測(cè)定土霉素和苯扎溴銨對(duì)質(zhì)控菌株的MIC。將土霉素溶解，配成5 120 μg/ mL溶液，苯扎溴銨配成0.512%溶液，過(guò)濾除菌后，備用。每次試驗(yàn)藥液均現(xiàn)配現(xiàn)用。采用試管二倍稀釋法進(jìn)行MIC測(cè)定。若第1次試驗(yàn)未能測(cè)出相應(yīng)的MIC，則調(diào)整藥物濃度。

1.6亞抑菌濃度苯扎溴銨/土霉素誘導(dǎo)大腸埃希菌參照張靜等［3］的方法用亞抑菌濃度苯扎溴銨/土霉素誘導(dǎo)大腸埃希菌質(zhì)控菌，獲得耐藥性穩(wěn)定的菌株AB和AO。

1.7苯扎溴銨/土霉素誘導(dǎo)后菌株的MIC測(cè)定方法同1.5。

1.8對(duì)誘導(dǎo)后菌株AB和AO外排泵調(diào)控基因acrR、marA、soxS、rob的PCR擴(kuò)增及基因測(cè)序。

根據(jù)GenBank中大腸埃希菌相應(yīng)基因序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，其相關(guān)信息見(jiàn)表1，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以大腸埃希菌DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。將PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

表1　PCR引物序列

2　結(jié)果

2.1苯扎溴銨及土霉素對(duì)誘導(dǎo)前后的大腸埃希菌MIC測(cè)定苯扎溴銨及土霉素對(duì)誘導(dǎo)前后大腸埃希菌的MIC如表2所示，AB和AO對(duì)苯扎溴銨和土霉素均高度耐藥。

表2　苯扎溴銨及土霉素對(duì)誘導(dǎo)前后大腸埃希菌的MIC值（μg/mL）

2.2目的基因測(cè)序結(jié)果將AB和AOacrR、marA、soxS、rob基因測(cè)序結(jié)果與質(zhì)控菌相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)，得到堿基及氨基酸突變情況見(jiàn)表3。AB和AO的各基因序列與質(zhì)控菌比均有不同程度的突變，且導(dǎo)致所編碼的部分氨基酸序列也發(fā)生了突變。

3　分析與討論

3.1消毒劑和抗菌藥物之間存在多重耐藥由表2可以看出，經(jīng)苯扎溴銨/土霉素誘導(dǎo)的菌株可同時(shí)對(duì)苯扎溴銨和土霉素產(chǎn)生耐藥。亞抑菌濃度的抗菌藥物可以誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥，而在低濃度消毒劑持續(xù)作用下，細(xì)菌的自身耐受性會(huì)發(fā)生變化而產(chǎn)生生理適應(yīng)性耐藥，細(xì)菌對(duì)抗菌藥物和消毒劑的耐藥機(jī)制有相似之處，許多介導(dǎo)細(xì)菌消毒劑耐藥的機(jī)制同樣可介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥，如主動(dòng)外排泵表達(dá)亢進(jìn)、膜通透性改變等。

3.2體外誘導(dǎo)的耐藥大腸埃希菌外排泵調(diào)控基因突變細(xì)菌的主動(dòng)外排系統(tǒng)在細(xì)菌的耐藥過(guò)程中起著重要的作用。大腸埃希菌是主動(dòng)外排泵最多的一種細(xì)菌，其中AcrAB-TolC是其最主要的、占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的多藥外排泵，對(duì)細(xì)菌多藥耐藥起著重要作用。其表達(dá)受多種調(diào)控因子的調(diào)控，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的主要調(diào)控因子有AcrR、MarA、SoxS、Rob等。

由表3可知，誘導(dǎo)后耐藥菌株的acrR、marA、soxS、rob基因均發(fā)生了堿基突變，且突變具有一定的一致性，部分調(diào)控基因所編碼的氨基酸序列也發(fā)生了改變。

AB和AO的同一調(diào)控基因在相同位點(diǎn)有堿基突變：acrR 585位（T→C），soxS 275位T缺失，marA 9位（C→A），rob有6個(gè)相同位點(diǎn)的基因發(fā)生一致突變。AB和AO的marA和soxS所編碼的氨基酸序列也有在同一位點(diǎn)發(fā)生突變。這些調(diào)控基因突變對(duì)大腸埃希菌的藥物敏感性均會(huì)產(chǎn)生影響。Ruzin［5］曾指出，marA和soxS都是轉(zhuǎn)錄時(shí)的催化劑，其突變可使AcrAB的表達(dá)增加，導(dǎo)致菌體內(nèi)藥物外排作用增強(qiáng)。Poole等［6］曾報(bào)道AcrAB-TolC外排泵在最低水平表達(dá)時(shí)主要受AcrR的負(fù)向調(diào)控，acrR基因的無(wú)意義突變使acrAB基因的表達(dá)水平可能提高2倍。Miller等［7］也指出在大腸埃希菌中rob的無(wú)意義突變可增加其對(duì)有機(jī)溶劑的敏感性?？赏茰y(cè)大腸埃希菌對(duì)苯扎溴銨及土霉素的耐藥機(jī)制具有相似性且與AcrAB-TolC調(diào)控基因變異有一定的相關(guān)性。

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表3　各基因的堿基序列及氨基酸序列突變情況

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Study on the Mutation of AcrAB- TolC Efflux Pump Regulator Genes of Resistant Escherichiacoli Induced inVitroby Benzalkonium bromideor Oxytetracycline

ZENG Yang-mei，YANG Sen，DUAN Pei-qiang，CHEN Hong-wei，WU Jun-wei
（Department of Veterinary Medicine，Southwest University，Rongchang Campus，Chongqing 402460，China）

Abstract：To explore the correlation of resistance between disinfectants and antimicrobial drugs，Escherichia coli control strain was separately induced in vitro by sub-inhibitory concentration of benzalkonium bromide and oxytetracycline，and the change of MIC before and after induction was determined.The mutations of acrR，marA，soxS and rob that are regulator genes of AcrAB-TolC efflux pump were determined by PCR amplification and sequencing . The results showed that the induced strains produced resistance against both benzalkonium bromide and oxytetracycline.And there were mutations occurred at the same site on the same gene of the two induced strains.The change of amino acid sequence that encoded by marA and soxS was nearly the same.These results suggest that one multi-drug resistant reason of the two induced strains is probably the mutations of the AcrAB-TolC efflux pump regulator genes.

Key words：Escherichia coli；efflux pump；regulator gene；oxytetracycline；benzalkonium bromide Corresponding author：WU Jun-wei

中圖分類號(hào)：S852.65+2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0529- 6005（2016）03- 0013- 02

收稿日期：2014-11-21

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31372483）

作者簡(jiǎn)介：曾楊梅（1989-），女，碩士生，研究方向?yàn)楂F醫(yī)藥理學(xué)與藥物制劑，E-mail：530265641@qq.com

通訊作者：吳俊偉，E-mail：wjw999@163.com