李　琳，陳瑞愛，，劉紅波，梁梅蘭，張顯浩，賀東生（.農(nóng)業(yè)部動物疫病防控生物技術(shù)與制品創(chuàng)制重點實驗室肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司，廣東肇慶526238；2.華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣東廣州50642；3.華南家禽疫病防控與產(chǎn)品安全協(xié)同創(chuàng)新中心，廣東廣州50640）

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2011- 2014年山東省H9亞型禽流感病毒HA基因遺傳變異分析

李琳1，陳瑞愛1，2，3，劉紅波1，梁梅蘭1，張顯浩1，賀東生2，3
（1.農(nóng)業(yè)部動物疫病防控生物技術(shù)與制品創(chuàng)制重點實驗室肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司，廣東肇慶526238；2.華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣東廣州510642；3.華南家禽疫病防控與產(chǎn)品安全協(xié)同創(chuàng)新中心，廣東廣州510640）

摘要：對2011-2014年山東26個H9亞型AIV毒株的HA基因進行測序分析。結(jié)果顯示，所有毒株均屬于h9.4.2.5亞分支，與疫苗株GD/SS/94、SD/6/96、SH/F/98的核苷酸相似性為88.0%～91.5%。HA裂解位點均只有一個堿性氨基酸（R），符合低致病性AIV的特征。所有毒株在234位發(fā)生了谷氨酸Q→亮氨酸L的突變，呈現(xiàn)出典型的人流感病毒受體結(jié)合特性。所有毒株在313-315位均新增1個潛在糖基化位點，且部分毒株在145-147位出現(xiàn)新潛在糖基化位點NGT。結(jié)果表明，山東省H9亞型AIV基因已發(fā)生較大變異，因此需要加強禽類生產(chǎn)貿(mào)易的監(jiān)測和生物安全措施，及時更新疫苗毒株，控制H9亞型AIV的傳播。

關(guān)鍵詞：H9；AIV；HA；進化分析；變異

禽流感（Avain Influenza，AI）是A型流感病毒引起的一種傳染性疾病綜合征。根據(jù)病毒表面糖蛋白血凝素基因（Haemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（Neuraminidase，NA）基因可劃分17個HA亞型和9個NA亞型。H9亞型AIV為低致病性AIV的代表亞型，是我國主要的流行毒株之一，其在免疫壓力下變異加快，出現(xiàn)了多個基因亞型［1-3］。本研究測序分析了2011-2014年山東省26個毒株的HA基因序列，旨在了解各毒株間遺傳變異情況和流行規(guī)律，為該亞型AIV預(yù)防及疫苗候選株的篩選提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1病毒26個毒株均從有呼吸道癥狀和低死亡率的免疫雞群發(fā)病雞中分離鑒定。

1.2HA基因測序參照TaKaRa公司的RNA提取和RT-PCR一步法試劑盒說明書擴增HA基因。擴增引物（1.7kb）：H9F：5′-CAGTCAAAATGGAGACAATATCACT-3′；H9R：5′-ATACAAATGTTGCATCTGCAAG-3′；由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。RT-PCR擴增程序：50℃，94℃預(yù)變性3 min；94℃45 s，53℃45 s，72℃2 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化克隆后送英濰捷基公司測序。

1.3HA基因序列比對和遺傳變異分析采用Lasergene 7.1軟件對HA基因序列編輯翻譯、核苷酸和氨基酸序列相似性、受體結(jié)合位點以及裂解位點等比較分析；將HA肽序列提交Center for Biological Sequence Analysis online server 1.0（http:// www.cbs.dtu. dk/services/NetNGlyc/），對潛在糖基化位點進行預(yù)測。利用MEGA4.0軟件ClustalW方法Align比對后截齊序列，通過Neighbor-joining運算方法，進行Bootstrap 1000次重復運算，對HA基因繪制進化樹。

2　結(jié)果

2.1核苷酸和氨基酸相似性分析結(jié)果顯示，毒株間核苷酸最低相似性為92.6%，而與疫苗株核苷酸相似性為88.0%～91.5%。見表1。

表1　26個毒株及3個疫苗株的HA基因的核苷酸和氨基酸序列相似性比較

圖1　H9亞型AIV毒株HA基因的遺傳變異分析▲：毒株序列；●：疫苗株序列

2.2HA基因遺傳變異分析見圖1，本試驗所有毒株均屬于h9.4.2.5亞分支，是近年來中國的優(yōu)勢流行亞分支，疫苗株GD/SS/94、SD/6/96、SH/F/98則屬于h9.4.2.3亞分支。測序毒株與疫苗株雖分屬于不同的基因亞型，但均屬于h9.4.2分支。未發(fā)現(xiàn)G1-like和Y439-like分支，表明當前的流行毒株具有同一起源［1，3］，因此采用疫苗接種預(yù)防H9亞型AIV感染是有利的。

2.3HA蛋白關(guān)鍵位點的氨基酸殘基分析見表2，所有毒株HA裂解位點的氨基酸均只有一個堿性氨基酸（R），符合低致病性禽流感病毒的特征。多數(shù)毒株抗原位點氨基酸出現(xiàn)了明顯變異。SD/P614832F101/12出現(xiàn)了T206N（相當于H3亞型的T198N）的氨基酸變異。SD//ZH-3/13等10個毒株（10/26）出現(xiàn)了S145N（相當于H3亞型的S133N）的氨基酸變異，形成了1個潛在糖基化位點NGT。SD//ZH-3/13等8個毒株（8/26）出現(xiàn)了N201D（相當于H3亞型的N193D）的氨基酸變異。所有毒株均在234位（相當于H3亞型的226位）發(fā)生了谷氨酸Q→亮氨酸L的突變，呈現(xiàn)出典型的人流感病毒受體結(jié)合特性。所有毒株新增313-315（NCS）的潛在糖基化位點，SD//ZH-3/13 等10個毒株（10/26）在145-147（NGT）有一個新的潛在糖基化位點。SD/P614832F101/12則在206-208（NDT）有一個新的潛在糖基化位點。

3　討論

H9亞型AIV在宿主免疫壓力下不斷發(fā)生基因變異，因此，選擇抗原與流行毒株對應(yīng)的疫苗，才能獲得較好的免疫效果。本試驗所有毒株均是從免疫雞群分離得到，再次證實某些H9新毒株可導致免疫雞感染和排毒［4］，現(xiàn)有疫苗難以完全抵御流行毒株的感染。所有毒株均屬于h9.4.2.5亞分支，因此，制備新疫苗時候選毒株應(yīng)來自h9.4.2.5亞分支，并通過動物試驗對疫苗的免疫保護效力進行評估。

HA蛋白上第226位等氨基酸是關(guān)鍵的受體結(jié)合位點，且糖基化位點在病毒傳染性、與受體的結(jié)合能力及保護病毒關(guān)鍵蛋白表位免遭免疫攻擊方面起到重要作用。本試驗所有毒株谷氨酸Q均已經(jīng)變異為亮氨酸L，說明226位氨基酸Q變異為亮氨酸L愈加明顯，呈現(xiàn)出典型的人流感病毒受體結(jié)合特性。部分毒株出現(xiàn)了N201D的氨基酸變異，提示對禽類受體的親和力有下降趨勢。所有毒株在313-315位均新增1個潛在糖基化位點，此位點在HA蛋白裂解位點附近，可能影響到HA鏈的裂解，對病毒的特性產(chǎn)生影響。部分毒株在145-147位出現(xiàn)新潛在糖基化位點NGT，顯示隨著時間推移NGT糖基化位點愈加明顯。據(jù)報道，此糖基化位點NGT可導致病毒不與抗H9亞型AIV的HA單抗發(fā)生反應(yīng)［5］，同時也可導致H9禽流感變異株對SPF雞及雞胚、細胞的致病性增強［6］。病毒HA蛋白上的抗原位點氨基酸變異以及糖基化位點增加是否對病毒致病性和抗原性有影響則需進一步的研究。

本試驗結(jié)果表明，山東H9亞型AIV基因已發(fā)生較大變異，需要加強禽類生產(chǎn)貿(mào)易的生物安全措施，并及時更新疫苗毒株，以更好地控制H9亞型禽流感。

表2　H9亞型AIV的HA裂解位點、抗原位點和HA氨基酸序列潛在糖基化位點分析

參考文獻：

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Genetic variation and phylogenetic analysis of haemagglutinin geneof avian influenza viruses in Shandong Provincefrom 2011 to 2014

LI Lin1，CHEN Rui-ai1，2，3，LIU Hong-bo1，LIANG Mei-lan1，ZHANG Xian-hao1，HE Dong-sheng2，3
（1.Key Laboratory of Biotechnology and Bioproducts Development for Animal Epidemic Prevention，Ministry of Agriculture，Zhaoqing Dahuanong Biological Medicine Co.，Ltd.，Zhaoqing 526238，China；2.College of Veterinary Medicine，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China；3.South China Collaborative Innovation Center for Poultry Disease Control and Product Safety，Guangzhou 510640，China）

Abstract：The HA genes were amplified and sequenced from 26 isolates of H9 subtype Avian Influenza Virus（AIV）in Shandong Province.Phylogenetic analysis indicated that all isolates belonged to the lineage h9.4.2.5.And they had 88.0～91.5%of nucleotide identity to 3 widely used vaccine strains GD/SS/94，SD/6/96 and SH/F/98.No consecutive basic amino acids insertion was found in the HA cleavage sites，showing the characteristic feature of low-pathogenic AIV . All the isolates had the substitution Q226L.Additional potential glycosylation site at residues 313-315（NCS）was found in all these isolates，and 9 of 17 strains isolated in 2013 and 2014 in 145-147 had new potential glycosylation sites NGT . Our results demonstrated that lineage h9.4.2.5 was more dominant than other lineages as it harbored more viruses that widely distributed in Shandong Province in recent years.Updated vaccine and increased veterinary biosecurity on poultry farms and trade markets need to prevent and control avian influenza.

Key words：H9；AIV；hamagglutinin；phylogenetic analysis；variation

中圖分類號：S852.65

文獻標志碼：A

文章編號：0529- 6005（2016）03- 0010- 03

收稿日期：2014-11-14

基金項目：廣東大華農(nóng)動物保健品股份有限公司科研項目（03-63C201206-4）

作者簡介：李琳（1979-），女，獸醫(yī)師，本科，從事家禽傳染病學研究，E-mail：mulian9618905@qq.com

通訊作者：賀東生，E-mail：Dhe@scau.edu.cn

Corresponding author：HE Dong-sheng