高傳龍，袁靜，李琴，楊琴，李松，周培，叢林

（安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，安徽合肥230022）

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特異性抑制轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶1活性對妊娠期糖尿病孕婦外周血單核細(xì)胞炎癥通路的影響*

高傳龍，袁靜，李琴，楊琴，李松，周培，叢林

（安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，安徽合肥230022）

摘要：目的探討特異性抑制轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶1（TAK1）活性的變化對妊娠期糖尿病（GDM）孕婦外周血單核細(xì)胞炎癥通路的影響。方法選取GDM孕婦及正常孕婦各30例，采集外周靜脈血，分離單核細(xì)胞和血漿。依據(jù)細(xì)胞加藥組別的不同，分為LPS刺激組（L組）、脂多糖組（LPS組）、TAK1抑制劑組（LT組）、TAK1抑制劑組（T組）及空白對照組（W組），培養(yǎng)、加藥后Western blot檢測TAK1及核轉(zhuǎn)錄因子-κB （NF-κB）蛋白的表達(dá)量，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血漿中LPS濃度及各組炎癥因子［白介素-1（IL-1）、白介素-10（IL-10）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）］水平，比較各組結(jié)果的差異，探討TAK1的作用。結(jié)果GDM孕婦與正常孕婦比較，血漿LPS濃度升高；TAK1及NF-κB蛋白表達(dá)量增加，炎癥因子（IL-1、IL-10、TNF-α）水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各小組間比較，L組相較于其他組的TAK1、NF-κB蛋白表達(dá)量增加，炎癥因子（IL-1、IL-10、TNF-α）表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；正常孕婦中，LT組、T組、W 組NF-κB蛋白表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），LT組、T組未檢測到TAK1明顯表達(dá)，可檢測到W組少量表達(dá)，LT組相對于T組，TNF-α、IL-1、IL-10表達(dá)水平升高（P＜0.05），LT組、T組與W組上清炎癥因子表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；GDM孕婦中，LT組、T組、W組TAK1及NF-κB蛋白表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），LT組相對于T組，TNF-α、IL-1、IL-10表達(dá)水平升高（P＜0.05），Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，TAK1、NF-κB蛋白表達(dá)量與炎癥因子（IL-1、IL-10、TNF-α）水平呈正相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論TAK1可能參與GDM孕婦外周血單核細(xì)胞炎癥通路的形成，抑制TAK1的活性，可以下調(diào)通路下游關(guān)鍵介質(zhì)NF-κB及炎癥因子的表達(dá)。

關(guān)鍵詞：妊娠期糖尿?。谎装Y通路；脂多糖；轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶1；核轉(zhuǎn)錄因子-κB；炎癥因子

近年來，妊娠期糖尿?。╣estational diabetes mellitus，GDM）發(fā)病率呈逐年上升趨勢，其近、遠(yuǎn)期并發(fā)癥給母兒健康帶來嚴(yán)重的危害［1-2］，目前認(rèn)為GDM的發(fā)病可能與免疫炎癥及胰島素抵抗（Insulinresistance，IR）有關(guān)［3］。許多研究表明，GDM患者體內(nèi)多種炎癥因子水平升高［4］。叢林等［5］的研究同樣表明，脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激后的GDM孕婦外周血單核細(xì)胞中，核轉(zhuǎn)錄因子-κB （nuclear transcription factor-κB，NF-κB）相關(guān)炎癥通路介導(dǎo)的炎癥因子高表達(dá)，可能參與GDM的發(fā)病，但是關(guān)于如何調(diào)控GDM孕婦外周血單核細(xì)胞炎癥通路中炎癥因子高表達(dá)，還有待進(jìn)一步研究。在人類B細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶1 ［transforming growth factor（TGF）-β-activating kinase 1，TAK1］參與LPS/Toll樣受體/NF-κB介導(dǎo)的炎癥通路的中間環(huán)節(jié)［6］，蛋白特異性抑制劑（5Z-7-Oxozeaenol）可選擇性抑制TAK1的磷酸化活性，進(jìn)而抑制NF-κB的表達(dá)［7］。所以本研究選擇5Z-7-Oxozeaenol做為TAK1抑制劑，通過選擇性抑TAK1活性，觀察LPS誘導(dǎo)的GDM孕婦外周血單核細(xì)胞炎癥通路中，TAK1、NF-κB及炎癥因子的表達(dá)，探討TAK1活性變化對該通路的影響。

1　資料與方法

1.1一般資料

選取2014年10月8日-2015年5月8日在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科門診產(chǎn)檢，并行葡萄糖耐量試驗(yàn)（oral glucose tolerance test，OGTT）檢查的適齡孕婦，詳細(xì)詢問病史、家族史、生育史及孕期檢查報(bào)告。標(biāo)本收取階段各選取30例正常孕婦和GDM孕婦。所有納入者需排除免疫炎癥、感染性疾病及其他妊娠期并發(fā)癥；正常孕婦組和GDM孕婦組年齡22～34歲，平均（27.97±2.34）歲，孕周為24～28周，平均（26.13±0.61）周；正常孕婦組排除妊娠期糖尿病高危因素；GDM孕婦組符合2010年IADPSG妊娠期糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)［8］。

1.2標(biāo)本采集

選擇符合實(shí)驗(yàn)要求的孕婦，空腹采集靜脈血5ml，置于滅菌肝素鈉抗凝管中。將人淋巴細(xì)胞分離液加入滅菌管，緩慢加入混勻的血標(biāo)本，1 500 r/min低速離心后提取懸浮淋巴細(xì)胞，分離血漿存放于-20℃冰箱備用。將提取的懸浮淋巴細(xì)胞置于滅菌干管中，加入生理鹽水洗滌，2 000 r/min離心。洗滌提純后用淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并用臺(tái)盼藍(lán)測定細(xì)胞活力，調(diào)整細(xì)胞濃度至6×106個(gè)/ml，接種于加入含雙抗細(xì)胞培養(yǎng)基的24孔板中，放入37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3標(biāo)本分組和處理

培養(yǎng)24 h后每份標(biāo)本分為4份，依據(jù)加藥組別的不同分為4組：LPS（1μg/ml）刺激組（L組）、LPS （1μg/ml）和TAK1抑制劑5Z-7-Oxozeaenol （1μmol）組（LT組）、TAK1抑制劑5Z-7-Oxozeaenol （1μmol）組（T組）及空白對照組（W組），調(diào)整各小組培養(yǎng)液總體積為1 ml，培養(yǎng)24 h后分別收集上清和細(xì)胞置于-20℃冰箱中保存。

1.4主要試劑

人淋巴細(xì)胞分離液購自上海華精生物高科技有限公司，LPS、臺(tái)盼藍(lán)試劑購自美國Sigma公司，細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Gibco公司，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（enhanced chemiluminescence，ECL）顯影液、細(xì)胞裂解液（radio immunoprecipitation assay，PIRA）、Western Blot檢測常用試劑、山羊抗小鼠二抗購自美國RD公司，小鼠抗人TAK1抗體、小鼠抗人NF-κB抗體、β-actin購自美國Cell Singnaling公司，LPS試劑盒購自廈門鱟試劑公司，酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司。

1.5實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1LPS檢測取備用血清，按照鱟試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5.2細(xì)胞因子檢測ELISA法檢測上清炎癥因子［白細(xì)胞介素-1（Interleukin-1，IL-1）、白細(xì)胞介素-10 （Interleukin-10，IL-10）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）］濃度，按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，取培養(yǎng)上清液100μl，加入酶標(biāo)板孔內(nèi)，依次加入各種試劑，酶標(biāo)儀492 nm波長處讀值。

1.5.3Western blot檢測TAK1及NF-κB蛋白的表達(dá)將收集的細(xì)胞樣本按組分別加入含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液［含RIPA裂解液∶苯甲基磺酰氟=99∶1］冰上裂解細(xì)胞提取總蛋白，超聲后的懸液4℃、14 000 r離心10 min。取上清加5×蛋白上樣緩沖液，煮沸10min，樣品置入-20℃冰箱冷凍保存。調(diào)整各組蛋白為同濃度，各組取等量蛋白上樣。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，洗膜，放入1∶1 000稀釋的TAK1抗體、NF-κB抗體和肌動(dòng)蛋白（β-actin）中4℃過夜孵一抗，洗膜，放入1∶1 000稀釋的二抗37℃孵育2 h，洗膜，ECL顯影液顯影。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較用方差分析，方差齊時(shí)，兩兩比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。各小組組內(nèi)相關(guān)性分析用Pearson相關(guān)分析，Image軟件分析顯影后圖像，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1血漿LPS檢測結(jié)果

GDM組血漿LPS（0.82±0.33）EU/ml，高于正常組［（0.52±0.43）EU/ml］，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.795，P=0.010）。

2.2各組炎癥因子檢測結(jié)果比較

2.2.1GDM孕婦與正常孕婦外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)液上清炎癥因子水平比較GDM孕婦與正常孕婦外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)液上清炎癥因子（IL-1、IL-10、TNF-α）表達(dá)水平比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明GDM孕婦各小組［加入LPS（L組）、LPS和TAK1蛋白特異性抑制劑（LT組）、TAK1蛋白特異性抑制劑（T組）、空白對照組（W組）］炎癥因子表達(dá)水平均高于高于正常孕婦組。見圖1～4。

圖1　加入LPS（L組）培養(yǎng)后，GDM孕婦與正常孕婦外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)液上清炎癥因子比較

2.2.2正常孕婦外周血單核細(xì)胞加藥或培養(yǎng)后，各組培養(yǎng)液上清炎癥因子水平比較正常孕婦中，L組及其他組上清細(xì)胞因子（IL-1、IL-10、TNF-α）表達(dá)水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。L組上清細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1、IL-10）表達(dá)水平高于LT、W、T組，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（TNF-α：t=3.061、3.949和4.998，P=0.003、0.000和0.000；IL-1：t=3.840、5.057和6.460，P=0.000；IL-10：t=2.380、4.256和4.854，P=0.000）。W組與T組、LT組上清炎癥因子水平，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），W組與T組、LT組上清炎癥因子表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

圖2　空白對照組（W組）培養(yǎng)后，GDM孕婦與正常孕婦外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)液上清炎癥因子比較

圖3　加入TAK1蛋白特異性抑制劑（T組）培養(yǎng)后，GDM孕婦與正常孕婦外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)液上清炎癥因子比較

圖4　加入LPS和TAK1蛋白特異性抑制劑（LT組）培養(yǎng)后，GDM孕婦與正常孕婦外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)液上清炎癥因子比較

2.2.3GDM孕婦外周血單核細(xì)胞加藥或培養(yǎng)后，各組培養(yǎng)液上清炎癥因子比較GDM孕婦中，L組及其他組上清細(xì)胞因子（IL-1、IL-10、TNF-α）表達(dá)水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。L組上清細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1、IL-10）表達(dá)水平高于LT、W、T組，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（TNF-α：t =3.318、3.566和4.840，P =0.002、0.001 和0.000；IL-1：t =3.866、4.439和6.513，P =0.000；IL-10：t =2.513、3.621和3.696，P =0.015、0.001和0.000）。W組與T組、LT組上清炎癥因子水平比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），W組與T組、LT組上清炎癥因子表達(dá)水平水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表1　正常孕婦外周血單核細(xì)胞加藥或培養(yǎng)后，各組培養(yǎng)液上清炎癥因子比較（n=30，pg/ml，±s）

注：1）與L組（加LPS）比較，P＜0.01；2）與W組（空白對照組）比較，P＞0.05；3）與T組（加抑制劑）比較，P＞0.05；4）與T組（加抑制劑）比較，P=0.012

組別　TNF-α　IL-1　IL-10 L組　10.01±1.00　 17.11±1.33　 5.04±0.80 LT組　9.28±0.841）2）3）　15.6±1.701）2）4）　4.55±0.801）2）3）W組　9.00±0.971）　15.19±1.611）　4.24±0.641）T組　8.85±0.791）2）　13.97±1.451）2）　4.09±0.631）2）F值　9.697　14.577　9.439 P值　0.000　0.000　0.000

表2　GDM孕婦外周血單核細(xì)胞加藥或培養(yǎng)后，各組培養(yǎng)液上清炎癥因子比較（n=30，pg/ml，±s）

表2　GDM孕婦外周血單核細(xì)胞加藥或培養(yǎng)后，各組培養(yǎng)液上清炎癥因子比較（n=30，pg/ml，±s）

注：1）與L組（加LPS）比較，P＜0.01；2）與W組（空白對照組）比較，P＞0.05；3）與T組（加抑制劑）比較，P＞0.05；4）與T組（加抑制劑）比較，P=0.019；5）與L組（加LPS）比較，P=0.012

組別　TNF-α　IL-1　IL-10 L組　11.03±0.99　 19.36±1.49　 6.15±1.04 LT組　10.23±0.881）2）3）　17.55±2.091）2）4）　5.47±1.062）3）5）W組　10.10±1.041）　17.31±2.031）　5.20±0.981）T組　9.79±0.991）2）　16.36±2.031）2）　4.92±0.861）2）F值　8.787　12.677　5.915 P值　0.000　0.000　0.000

2.3各組蛋白表達(dá)量比較

2.3.1GDM孕婦與正常孕婦外周血單核細(xì)胞TAK1蛋白表達(dá)量比較①GDM孕婦（L組、LT組、T組、W組）與正常孕婦TAK1蛋白表達(dá)量比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t =2.341、1.968、1.436和1.795，P=0.000），GDM孕婦不同處理組TAK1蛋白表達(dá)量均增加；②正常孕婦中，L組及其他各小組檢測到的TAK1蛋白表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.982，P=0.000），L組的TAK1蛋白表達(dá)量高于其余各組。加入TAK1抑制劑5Z-7-Oxozeaenol組（T組和LT組）未檢測到TAK1的表達(dá)，空白對照組（W組）僅檢測到TAK1的少量表達(dá)；③GDM孕婦中，L組及其他各小組檢測到的TAK1蛋白表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.573，P=0.000），L組的TAK1蛋白表達(dá)量高于其余各組。見表3和圖5。

2.3.2GDM孕婦與正常孕婦各組外周血單核細(xì)胞NF-κB蛋白的表達(dá)量比較①GDM孕婦（L組、LT組、T組、W組）與正常孕婦NF-κB蛋白表達(dá)量比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.573、1.362、1.036和1.495，P=0.000），GDM孕婦單核細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)量高于正常孕婦；②正常孕婦中，L組及其余各組檢測到的NF-κB表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.068，P=0.000），L 組NF-κB表達(dá)量高于其余各組。W組與T組、LT組檢測到的NF-κB表達(dá)量比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；③GDM孕婦中，L組及其余各組檢測到的NF-κB表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.915，P=0.000），L組NF-κB表達(dá)量高于其余各組。見表4和圖6。

表3　GDM孕婦與正常孕婦外周血單核細(xì)胞干預(yù)培養(yǎng)后，各組TAK1蛋白表達(dá)量比較（n=30，±s）

表3　GDM孕婦與正常孕婦外周血單核細(xì)胞干預(yù)培養(yǎng)后，各組TAK1蛋白表達(dá)量比較（n=30，±s）

注：1）與L組（加LPS）比較，P=0.000；2）與T組（加抑制劑）比較，P＞0.05

組別　GDM孕婦TAK1　　正常孕婦TAK1 L組　2.79±0.79　2.06±0.78 LT組　1.54±0.751）2）　0.00±0.001）W組　1.39±0.641）2）　0.41±0.271）T組　1.31±0.551）　0.00±0.001）F值　2.573　1.982 P值　0.000　0.000

圖5　TAK1蛋白顯影后圖像

2.4GDM孕婦與正常孕婦外周血單核細(xì)胞TAK1 及NF-κB蛋白表達(dá)量與上清炎癥因子水平的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，TAK1與NF-κB蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)=0.463，P=0.002）；TAK1蛋白表達(dá)量與上清炎癥因子水平（TNF-α、IL-1、 IL-10）呈正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)=0.367、0.542和0.427，P=0.016、0.002和0.025）；NF-κB蛋白表達(dá)量與上清炎癥因子水平（TNF-α、IL-1、IL-10）呈正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)=0.561、0.329、0.336，P =0.024、0.010和0.035）。

圖6　NF-κB蛋白顯影后圖像

表4　GDM孕婦與正常孕婦外周血單核細(xì)胞干預(yù)培養(yǎng)后，各組NF-κB蛋白表達(dá)量比較（n=30，±s）

表4　GDM孕婦與正常孕婦外周血單核細(xì)胞干預(yù)培養(yǎng)后，各組NF-κB蛋白表達(dá)量比較（n=30，±s）

注：1）與L組（加LPS）比較，P＜0.01；2）與T組（加抑制劑）比較，P＞0.05；3）與LT組（加抑制劑）比較，P＞0.05

組別　GDM孕婦NF-κB　　正常孕婦NF-κB L組　1.96±0.92　1.25±0.59 LT組　1.51±0.671）2）　0.79±0.451）2）W組　1.35±0.731）2）3）　0.83±0.561）2）3）T組　1.19±0.661）　0.48±0.301）F值　1.915　1.068 P值　0.000　0.000

3　討論

GDM孕婦相對于正常孕婦，體內(nèi)多種炎癥因子水平升高［4］，可能存在慢性亞臨床炎癥狀態(tài)［9］，目前IR同樣被認(rèn)為可能是一個(gè)慢性亞臨床炎癥過程，包括TNF-α、IL-1等在內(nèi)的炎癥因子介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)炎癥反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，該炎癥因子可能通過某些途徑，使胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻，從而誘發(fā)IR［10-11］。雖然炎癥可能與GDM發(fā)病相關(guān)，但是上述炎癥因子升高的機(jī)制及其相關(guān)通路的激活和調(diào)控，還有待進(jìn)一步探討。

叢林等［5］研究認(rèn)為，LPS可通過LPS-TLR4-NF-κB炎癥通路刺激炎癥因子IL-1、TNF-α等的轉(zhuǎn)錄釋放，引起致炎因子IL-1、TNF-α和抗炎因子IL-10水平升高，可能參與GDM的發(fā)病。本研究結(jié)果顯示，GDM孕婦血漿LPS濃度在基礎(chǔ)狀態(tài)下高于正常孕婦，因此筆者推測，LPS可能通過刺激炎癥因子（IL-1、TNF-α）的釋放，加劇GDM孕婦體內(nèi)炎癥的進(jìn)程。而在有關(guān)糖尿病的研究中，IL-1和TNF-α分別與IL-1R、TNF-R受體結(jié)合后，同樣可以激活類似的炎癥通路，進(jìn)而釋放炎癥因子［6］（IL-1、TNF-α），因此LPS、TNF-α、IL-1等致炎因子及炎癥因子便可相互作用，使GDM患者體內(nèi)的炎癥狀態(tài)持續(xù)存在，并通過多種途徑引起慢性低度炎癥的循環(huán)和胰島素抵抗。而抑制炎癥因子的釋放，阻斷通路的循環(huán)有可能緩解IR，從而為GDM的治療提供新的路徑。

有關(guān)TAK1的研究中，有研究表明，在LPS刺激誘導(dǎo)的NF-κB相關(guān)的炎癥通路中，通過有效地抑制TAK1的活性，可以阻止其下游IKK復(fù)合物的活化，從而阻止NF-κB入核，抑制炎癥因子的釋放［12］。但是關(guān)于TAK1在GDM孕婦炎癥通路中的研究尚未見報(bào)道。本研究中GDM孕婦與正常孕婦外周血單核細(xì)胞在相同培養(yǎng)刺激條件下，GDM孕婦外周血單核細(xì)胞的TAK1及NF-κB蛋白表達(dá)量和炎癥因子（IL-1、IL-10、TNF-α）的表達(dá)水平均升高，提示GDM孕婦體內(nèi)可能存在TAK1/NF-κB相關(guān)的炎癥通路激活狀態(tài)。LPS刺激組的炎癥因子、蛋白TAK1 和NF-κB表達(dá)量相較于其他組明顯增加，而在加入LPS的同時(shí)，加入TAK1選擇性抑制劑5Z-7-Oxozeaenol的條件下，TAK1和NF-κB蛋白表達(dá)量及炎癥因子水平均下降，說明LPS可以誘導(dǎo)TAK1/NF-κB/炎癥因子的高表達(dá)。同時(shí)在抑制TAK1活性的情況下，其下游介質(zhì)NF-κB和炎癥因子的表達(dá)也明顯下調(diào)，且TAK1/NF-κB/炎癥因子的表達(dá)呈正相關(guān)，表明TAK1可能參與并調(diào)控GDM孕婦外周血單核細(xì)胞TAK1/NF-κB/相關(guān)炎癥通路的形成。

不僅在LPS誘導(dǎo)的炎癥通路中，在IL-1和TNF-α等誘導(dǎo)的炎癥通路中，TAK1也發(fā)揮重要作用，有研究認(rèn)為，當(dāng)IL-1、TNF-α和LPS分別與受體包膜上不同受體結(jié)合后，可觸發(fā)TAK1/NF-κB相關(guān)的炎癥通路，從而啟動(dòng)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄［13］。所以抑制TAK1活性不僅可以抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥通路，還可能抑制LPS激活的IL-1和TNF-α相關(guān)的炎癥通路，發(fā)揮其對GDM炎癥發(fā)病機(jī)制中一些炎癥通路的抑制作用，阻斷炎癥通路的循環(huán)。但是這僅僅是一些猜想，還需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，TAK1可能參與LPS誘導(dǎo)的GDM孕婦外周血單核細(xì)胞炎癥通路的形成，且可以通過TAK1的環(huán)節(jié)下調(diào)炎癥因子的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)的進(jìn)程。目前，存在不少有關(guān)TAK1的抗炎機(jī)制的研究，但大多集中在細(xì)胞層次和動(dòng)物模型中，筆者的研究也僅限于機(jī)制的研究，僅希望能為GDM的治療提供新的思路。

參考文獻(xiàn)：

［1］Schneider S，Bock C，Wetzel M，et al. The prevalence of gestational diabetes in advanced economies［J］. J Perinat Med，2012，40（5）: 511-520.

［2］Alfadhl EM. Gestational diabetes mellitus［J］. Saudi Med J，2015，36（4）: 399-406.

［3］Li YY，Xiao R，Li CP，et al. Increased plasma levels of FABP4 and PTEN is associated with more severe insulin resistance in women with gestational diabetes mellitus［J］. Med Sci Monit，2015，21: 426-431.

［4］Yu J，Zhou Y，Gui J，et al. Assessment of the number and function of macrophages in the placenta of gestational diabetes mellitus patients［J］. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2013，33（5）: 725-729.

［5］叢林，李從青，袁靜，等. LPS-TLR4-NF-κB通路在妊娠期糖尿病、正常孕婦及育齡婦女外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)［J］.現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2010，19（11）: 820-822.

［6］He B，Santamaria R，Xu W，et al. The transmembrane activator TACI triggers immunoglobulin class switching by activating B cells through the adaptor MyD88［J］. Nat Immunol，2010，11（9）: 836-845.

［7］Wu J，Powell F，Larsen NA，et al. Mechanism and in vitro pharmacology of TAK1 inhibition by（5Z）-7-Oxozeaenol［J］. ACS Chemical Biology，2013，8（3）: 643-650.

［8］Metzger BE，Gabbe SG，Persson B，et al. International association of diabetes and pregnancy study groups recommendations on the diagnosis and classification of hyperglycemia in pregnancy［J］. Diabetes Care，2010，33（3）: 676-682.

［9］Pantham P，Aye IL，Powell TL. Inflammation in maternal obesity and gestational diabetes mellitus［J］. Placenta，2015，36（7）: 709-715.

［10］Shah A，Mehta N，Reilly MP. Adipose inflammation，insulin resistance，and cardiovascular disease［J］. JPEN J Parenter Enteral Nutr，2008，32（6）: 638-644.

［11］Odegaard JI，Chawla A. Mechanisms of macrophage activation in obesity-induced insulin resistance［J］. Nat Clin Pract Endocrinol Meta，2008，4（11）: 619-626.

［12］Ear T，F(xiàn)ortin CF，Simard FA，et al. Constitutive association of TGF-beta-activated kinase 1 with the lkappaB kinase complex in the nucleus and cytoplasm of human neutrophils and its impact on downstream processes［J］. J Immunol，2010，184（7）: 3897-3906.

［13］Odegaard JI，Chawla A. Connecting type 1 and type 2 diabetes through innate immunity［J］. Cold Spring Harb Perspect Med，2012，2（3）: 1-18.

（童穎丹 編輯）

Influence of specifical inhibition of TAK1 activity in inflammatory pathway of mononuclear cells in peripheral blood of pregnant women with gestational diabetes mellitus*

Chuan-long Gao，Jing Yuan，Qin Li，Qin Yang，Song Li，Pei Zhou，Lin Cong
（Prenatal Diagnosis Center，the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei，Anhui 230022，China）

Abstract:Objective To investigate the influence of changes of TGF-β-activated kinase 1（TAK1）activity in the inflammatory pathway of mononuclear cells in the peripheral blood of pregnant women with gestational diabetes mellitus（GDM）. Methods Totally 30 GDM pregnant women and 30 normal pregnant women were selected. Peripheral venous blood was drawn，and mononuclear cells and plasma were separated. They were divided into lipopolysaccharide（LPS）-stimulation group（L group），LPS and TAK1-inhibitor group（LT group），book=10,ebook=15TAK1-inhibitor group（T group）and control group（W group）. After culture，Western blot was used to detect the expressions of TAK1 and NF-κB，and ELISA was used to detect the plasma concentration of LPS and the expression levels of inflammatory factors（IL-1，IL-10 and TNF-α）. The differences between GDM and normal pregnant women were compared and the effect of TAK1 was explored. Results Compared with the normal pregnant women，the plasma LPS concentration，the expression levels of inflammatory factors（IL-1，IL-10 and TNF-α），TAK1 and NF-κB increased in the GDM pregnant women（P＜0.05）. Compared with other groups，the expression levels of TAK1，NF-κB and inflammatory factors（IL-1，IL-10 and TNF-α）significantly increased in the L group（P＜0.05）. In the normal pregnant women，the expression levels of NF-κB had no statistical differences（P＞0.05）among the T group，the LT group and the W group；no obvious expression of TAK1 was detected in the LT group or the T group while a small amount of TAK1 expression was detected in the W group；compared with the T group，the expression levels of inflammatory factors（TNF-α，IL-1 and IL-10）significantly increased in the LT group（P＜0.05）. In the GDM pregnant women，the LT group，the T group and the W group had no statistical differences in the expression levels of TAK1 or NF-κB（P＞0.05）；compared with the T group，the expression levels of inflammatory factors（TNF-α，IL-1 and IL-10）significantly increased in the LT group（P＜0.05）. The Pearson correlation analysis showed that the expression levels of TAK1 and NF-κB were positively correlated with inflammatory factors（IL-1，IL-10 and TNF-α）（P＜0.05）. Conclusions TAK1 may be involved in the formation of the inflammatory pathway of mononuclear cells in the peripheral blood of GDM pregnant women. Inhibition of TAK1 activity can down-regulate the expressions of downstream key mediators such as NF-κB and inflammatory factors.

Keywords:gestational diabetes mellitus；inflammatory pathway；lipopolysaccharide；transforming growth factor（TGF）-β-activated kinase 1；NF-κB；inflammatory factor

中圖分類號：R587.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.07.003

文章編號：1005-8982（2016）07-0009-06

收稿日期：2015-11-13

*基金項(xiàng)目：安徽省自然科學(xué)基金（No：1208085MH172）

［通信作者］叢林，E-mail：conglin1957@163.com