伍棟 鮑光輝湖南省常德市第一人民醫(yī)院口腔科 常德 415000

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細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控牙周膜細(xì)胞成骨分化的研究

伍棟 鮑光輝
湖南省常德市第一人民醫(yī)院口腔科 常德 415000

［摘要］目的探索細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是否參與調(diào)控牙周膜細(xì)胞的成骨分化。方法取體外培養(yǎng)的第3代牙周膜細(xì)胞進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)分為空白對照組、成骨誘導(dǎo)組和實(shí)驗(yàn)組（在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入10 nmol·Lˉ1ERK1/2磷酸化的抑制劑PD98059）。培養(yǎng)1周和3周后通過定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）、堿性磷酸酶（ALP）染色和茜素紅染色檢測其成骨能力。結(jié)果成骨誘導(dǎo)可促進(jìn)牙周膜細(xì)胞中ERK1/2的磷酸化。培養(yǎng)1周后，抑制ERK1/2的磷酸化可上調(diào)成骨標(biāo)志物Runx2、ALP和骨鈣蛋白（OCN）的表達(dá)，與成骨誘導(dǎo)組相比較，OCN的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Runx2、ALP的表達(dá)差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。培養(yǎng)3周后，實(shí)驗(yàn)組牙周膜細(xì)胞成骨標(biāo)志物Runx2、ALP和OCN的表達(dá)仍較成骨誘導(dǎo)組高，ALP染色和鈣結(jié)節(jié)形成較成骨誘導(dǎo)組強(qiáng)，其中Runx2、ALP的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），OCN的表達(dá)差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論ERK 1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了調(diào)控體外培養(yǎng)的牙周膜細(xì)胞的成骨分化。

［關(guān)鍵詞］ERK1/2；牙周膜細(xì)胞；成骨

細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signalregulated kinase，ERK）1/2是絲裂原激活蛋白激酶（mito-gen-activated protein kinase，MAPK）家族的一個(gè)成員，是一種重要的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子［1］。與細(xì)胞增殖、分化和凋亡密切相關(guān)［1-2］。在間充質(zhì)細(xì)胞的成骨分化過程中，已有研究［3］報(bào)道： ERK1/ 2對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞等細(xì)胞的成骨分化具有重要的調(diào)控作用。牙周膜細(xì)胞包含有牙周膜間充質(zhì)干細(xì)胞，是牙周組織及骨組織工程重要的細(xì)胞來源［4］。有研究顯示： ERK1/2參與了牙周膜細(xì)胞的增殖調(diào)控，但其在牙周膜細(xì)胞成骨分化中的作用尚未見報(bào)道。本研究擬探討 ERK1/2信號(hào)通路是否對牙周膜細(xì)胞的成骨分化具有調(diào)控作用，以期為牙周組織和骨組織工程提供新的靶點(diǎn)和思路。

1　材料和方法

1.1材料

PD98059（Merck公司，德國），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（Hyclone公司，加拿大），磷酸化ERK1/2一抗（CST公司，美國），達(dá)爾貝科改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)液（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）（Gibco公司，美國），磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（Gibco公司，美國）、胰蛋白酶（Sigma公司，美國）、Trizol試劑（Invitrogen公司，美國），聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物（上海生工生物工程公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒、定量PCR試劑盒（TaKaRa公司，日本），茜素紅（Sigma公司，美國），堿性磷酸酶（alka-line pho-sphatase，ALP）染色試劑盒（江蘇海門市碧云天生物技術(shù)研究所），顯微鏡（Nikon公司，日本）。

1.2方法

1.2.1牙周膜細(xì)胞的培養(yǎng)選擇至湖南省常德市第一人民醫(yī)院口腔科因正畸需要拔除的健康人的前磨牙為研究對象，年齡15～24歲（平均年齡18.1歲）。牙齒拔除后立即用含有雙抗的PBS清洗。無菌條件下用銳利刀片刮取牙根中1/3牙周膜組織，剪成約1 mm3大小的碎塊，然后把組織塊均勻地放置在10 cm培養(yǎng)皿的DMEM液滴里，每個(gè)液滴放8～10塊組織，再加蓋四角涂有凡士林的蓋玻片，最后加入含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的FBS的DMEM培養(yǎng)基中，于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，每4～5 d換液1次。待細(xì)胞生長達(dá)80%融合時(shí)，胰酶消化細(xì)胞，傳代后繼續(xù)培養(yǎng)。本研究中用3代細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)。

1.2.2免疫組織化學(xué)染色用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基或含10 nmol·Lˉ1PD98059的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)15 min后，牙周膜細(xì)胞用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛室溫固定20 min，PBS洗滌后用0.25%的triton-100透膜。接下來用3%的FBS室溫封閉60 min，然后加入磷酸化ERK1/2（phosphorylated ERK1/2，pERK1/2）一抗，4 ℃過夜。PBS洗滌后滴加辣根過氧化物酶標(biāo)志的二抗，室溫孵育1 h后二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木精染核，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

1.2.3 牙周膜細(xì)胞的成骨誘導(dǎo) 取第3代牙周膜細(xì)胞按照每毫升為5×104個(gè)的密度接種于6孔板，用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液（含有15%的FBS、0.8 mol·L-1地塞米松、0.01 mol·L-1β-甘油磷酸鈉、50 mg·L-1抗壞血酸的DMEM高糖培養(yǎng)基）進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)3周。

實(shí)驗(yàn)分組如下。1）成骨誘導(dǎo)組：牙周膜細(xì)胞用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)3周。2）實(shí)驗(yàn)組：牙周膜細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中加入10 nmol·Lˉ1的PD98059（ERK1/2磷酸化抑制劑）。PD98059的加入方法如下：在進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)以前加入常規(guī)DMEM培養(yǎng)基，按10 nmol·Lˉ1的濃度加入PD98059后培養(yǎng)2 h，然后去除常規(guī)培養(yǎng)基，換含有10 nmol·Lˉ1PD98059的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，此后用含有10 nmol·Lˉ1PD98059的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基持續(xù)換液培養(yǎng)3周。3）空白對照組：用常規(guī)DMEM培養(yǎng)的牙周膜細(xì)胞。

1.2.4定量PCR培養(yǎng)1周和3周的牙周膜細(xì)胞分別用PBS漂洗后加入1 mL Trizol試劑，吹打細(xì)胞至溶解后加入三氯甲烷（氯仿）400 μL，冰上放置10 min。12 000 ×g離心15 min后吸取上層液，加入1 mL異丙醇，室溫放置10 min。12 000 ×g離心15 min，離心后棄上清，加入用焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水配置的75%的乙醇1 mL洗滌沉淀。12 000 ×g離心5 min后棄上清，沉淀用適量DEPC水溶解。用紫外分光光度計(jì)測定RNA總濃度和純度，A260/280＞1.8可用于實(shí)驗(yàn)。然后用PrimeScript RT reagent kit按照說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 10 s，-80 ℃保存。

將cDNA模板加入Eppendorf實(shí)時(shí)熒光定量PCR（fluorescent quantitive polymerase chain reaction，qPCR）反應(yīng)系統(tǒng)，檢測培養(yǎng)的牙周膜細(xì)胞成骨標(biāo)志物Runx2（runt-related transcription factor 2）、ALP和骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）的mRNA表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)過程簡述如下：在96孔PCR板中，每孔加入20 μL反應(yīng)體系，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)平行孔，不同批次之間數(shù)據(jù)以內(nèi)參基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehy-drogenase，GAPDH）為基準(zhǔn)調(diào)整基線。Runx2、ALP、OCN和GAPDH的引物序列和反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)［5-6］中所用序列，反應(yīng)條件為95 ℃（20 s）-60 °C（15 s）-72 °C（20 s），共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)處理方法按Eppendorf公司說明書進(jìn)行。

1.2.5ALP染色培養(yǎng)3周的牙周膜細(xì)胞用PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌。按照說明書配制5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽（5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate，BICP）和四唑硝基藍(lán)（tetranitroblue tetrazolium chloride，NBT）混合染色工作液，加入適量BCIP/NBT染色工作液，室溫避光孵育30 min。除BCIP/NBT染色工作液，用蒸餾水洗滌，終止顯色反應(yīng)，掃描儀掃描。

1.2.6 茜素紅染色 培養(yǎng)3周的牙周膜細(xì)胞用PBS清洗，然后用95%乙醇固定30 min，去除乙醇，加入0.1%的茜素紅染色液，室溫下染色30 min。用PBS清洗，掃描儀掃描。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行成組t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1成骨誘導(dǎo)對牙周膜細(xì)胞中ERK1/2磷酸化的影響

圖1　原代牙周膜細(xì)胞　 顯微鏡　× 400Fig1　Primary human periodontal ligament cells　 microscope　× 400

圖2　pERK1/2免疫組織化學(xué)染色　 顯微鏡　× 400Fig2　Immunohistochemical staining of pERK1/2　 microscope　× 400

本研究應(yīng)用組織塊法成功培養(yǎng)了人牙周膜細(xì)胞，牙周膜細(xì)胞呈梭形、多角形（圖1）。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：牙周膜細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)后pERK1/2染色較對照組增強(qiáng)（圖2A）。這提示其可能參與牙周膜細(xì)胞在體外的成骨分化。而加入10 nmol·Lˉ1PD98059（ERK1/2磷酸化抑制劑）后，pERK1/2染色較成骨誘導(dǎo)組的牙周膜細(xì)胞減弱（圖2B），說明該抑制劑能抑制牙周膜細(xì)胞中ERK1/2的磷酸化。

2.2ERK1/2信號(hào)通路對牙周膜細(xì)胞成骨分化的影響

牙周膜細(xì)胞在體外經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)1周和3周后分別進(jìn)行成骨標(biāo)志物的qPCR檢測，結(jié)果顯示：成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)1周后牙周膜細(xì)胞的ALP和Runx2的表達(dá)較對照組明顯增加，OCN的mRNA表達(dá)較對照組有增高，但增加的量不如ALP和Runx2。加入PD98059后，ALP和Runx2的表達(dá)較成骨誘導(dǎo)組明顯升高（P＜0.01），骨橋蛋白（osteopontin，OPN）的表達(dá)也高于成骨誘導(dǎo)組（P＜0.05）（圖3）。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)3周后，牙周膜細(xì)胞的ALP和Runx2的表達(dá)較對照組仍然要高，但較培養(yǎng)1周時(shí)有降低，而OCN的mRNA表達(dá)較對照組明顯增加。加入PD98059后，ALP和Runx2的表達(dá)較成骨誘導(dǎo)組增高（P＜0.05），而OPN的表達(dá)較成骨誘導(dǎo)組明顯增高（P＜0.01）（圖3）。 ALP染色結(jié)果也顯示成骨誘導(dǎo)可增強(qiáng)牙周膜細(xì)胞的ALP活性，而抑制ERK1/2信號(hào)通路會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)牙周膜細(xì)胞中ALP的活性。茜素紅染色結(jié)果和ALP染色的結(jié)果相似，也顯示抑制ERK1/2信號(hào)通路會(huì)促進(jìn)牙周膜細(xì)胞形成鈣結(jié)節(jié)（圖4）。這些結(jié)果提示：ERK1/2信號(hào)通路參與了牙周膜細(xì)胞的成骨分化。

圖3　成骨標(biāo)志物的定量PCR檢測Fig3　qPCR results for osteogenic markers

圖4　各組ALP染色和茜素紅染色的結(jié)果Fig4　ALP staining and alizarin red staining results in different groups

3　討論

ERK1/2是MAPK家族的一員，是一個(gè)重要的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，參與了許多細(xì)胞生物學(xué)活動(dòng)如成骨、成軟骨分化等［1］。在間充質(zhì)細(xì)胞的成骨分化方面，現(xiàn)有研究表明ERK1/2信號(hào)通路對間充質(zhì)細(xì)胞成骨分化的調(diào)控作用十分復(fù)雜且存在一些爭議，部分研究發(fā)現(xiàn)ERK1/2信號(hào)通路對間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化起正向調(diào)控作用，而另外一些研究則認(rèn)為ERK1/2信號(hào)通路對充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化呈負(fù)向調(diào)控作用［7-10］。這些研究結(jié)果存在爭議可能是與相關(guān)基因的表達(dá)量、表達(dá)時(shí)序存在差異，或與細(xì)胞的類型相關(guān)，也或者是緣于上游的調(diào)控因子存在差異；因此，雖然ERK1/2的小分子抑制劑十分豐富，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值，但如何在牙周組織或骨組織工程中發(fā)揮作用尚無定論。本研究中筆者發(fā)現(xiàn)：成骨誘導(dǎo)可促進(jìn)牙周膜細(xì)胞中ERK1/2的磷酸化，而抑制ERK1/2磷酸化會(huì)促進(jìn)成骨分化。這提示ERK1/2信號(hào)通路對牙周膜細(xì)胞的成骨分化具有重要的調(diào)控作用。以往也有研究［11］表明一些基因突變可使ERK1/2過度磷酸化進(jìn)而引起顱頜面發(fā)育異常如顱縫早閉等，這也進(jìn)一步說明ERK1/2信號(hào)通路對顱頜面組織尤其是骨組織的發(fā)育具有十分重要的調(diào)控作用，其也提示研究者通過對ERK1/2信號(hào)通路的操作有可能是防治臨床上相關(guān)疾病或促進(jìn)顱頜面骨組織/牙周組織再生的有效辦法。

牙周膜細(xì)胞包含部分間充質(zhì)干細(xì)胞，其具有多向分化潛能，近年來受到廣泛關(guān)注［4］。體內(nèi)、外研究［4］表明：牙周膜干細(xì)胞能分化為成脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞等，是牙周組織和骨組織再生的重要細(xì)胞來源。牙周膜干細(xì)胞的成骨分化是一個(gè)復(fù)雜的過程，許多分子如骨形態(tài)發(fā)生蛋白7、雌激素、表皮生長因子等參與了這一調(diào)控過程［12-14］。本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)：ERK1/2在體外是負(fù)向調(diào)控牙周膜細(xì)胞的成骨分化。ALP和Runx2是生物礦化和成骨細(xì)胞分化成熟的重要早期標(biāo)志物。OCN 是由分化成熟的成骨細(xì)胞合成，是細(xì)胞骨向分化的晚期標(biāo)志物［15］。本研究顯示：抑制ERK1/2可促進(jìn)ALP、Runx2和OCN的表達(dá)，提示ERK1/2對牙周膜細(xì)胞的早期和晚期分化可能都有影響。由于筆者在實(shí)驗(yàn)中是從成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)開始持續(xù)加入ERK1/2的抑制劑，因此在不同時(shí)間點(diǎn)加入抑制劑，以及持續(xù)時(shí)間的長短等可能會(huì)對牙周膜細(xì)胞的成骨分化具有不同的效果，需要設(shè)計(jì)更為復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步的研究，并在體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證，從而為臨床上牙周組織再生或骨組織工程提供更為合理的應(yīng)用方案。

總之，牙周膜細(xì)胞成骨分化是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，受到許多分子的調(diào)控和體內(nèi)外環(huán)境的影響。ERK1/2是調(diào)節(jié)牙周膜細(xì)胞成骨分化的重要因子，但ERK1/2抑制劑的選擇、持續(xù)時(shí)間、體內(nèi)外差異以及調(diào)控的具體機(jī)制仍需要進(jìn)行深入的研究，其將有望為臨床應(yīng)用提供新的靶點(diǎn)、思路和重要的參考依據(jù)。

4　參考文獻(xiàn)

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（本文編輯王姝）

Extracellular signal-regulated kinase 1/2 signal pathway regulates the osteogenic differentiation of periodontal ligament cells

Wu Dong，Bao Guanghui.（Dept.of Stomotology，Changde First People’s Hospital in Hunan Province，Changde 415000，China）

［Abstract］ObjectiveThis study aims to explore whether the extracellular signal-regulated kinase（ERK） 1/2 signaling pathway could regulate the osteogenic differentiation of periodontal ligament cells.MethodsThe human periodontal ligament cells from the third passage were divided into three groups，namely，black control group，osteogenic induction group，and experimental group（10 nmol·L-1PD98059，an inhibitor of ERK1/2 phosphorylation，was added in the osteogenic medium）.One or three weeks after culture，the osteogenic capability of the periodontal ligament cells was evaluated using quantitative polymerase chain reaction（qPCR），alkaline phosphatase（ALP） staining，and alizarin red staining.Results Osteogenic induction promoted ERK1/2 phosphorylation.One week after culture，inhibition of ERK1/2 phosphorylation up regulated the expression of Runx2，ALP，and osteocalcin（OCN） in periodontal ligament cells.Statistically significant differences were found in OCN and the osteogenic induction group（P＜0.05），and statistically significant differences were found in ALP and Runx2（P＜0.01）.Three weeks after culture，the expression of Runx2，ALP，and OCN remained higher in the experimental group than in the osteogenic induction group.In addition，strong ALP staining and more calcium nodule formation were observed in the periodontal ligament cells of the experimental group.Statistically significant differences were found in ALP and Runx2（P＜0.05），and statistically differences were found in OCN（P＜0.01） .Conclusion The ERK1/2 signal pathway could regulate the osteogenic differentiation of periodontal ligament cells in vitro.

［Key words］ERK1/2；periodontal ligament cell；osteogenesis

［收稿日期］2015-05-14；［修回日期］2015-11-05

［作者簡介］伍棟，主治醫(yī)師，碩士，Email：dong_wu1983@163.com

［通信作者］伍棟，主治醫(yī)師，碩士，Email：dong_wu1983@163.com

［中圖分類號(hào)］Q 55

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A［doi］ 10.7518/gjkq.2016.03.004