李國(guó)平，王鈺蓉，鄭詩(shī)雪，莊歡歡

（武夷學(xué)院生態(tài)與資源工程學(xué)院，福建武夷山354300）

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見(jiàn)血清總生物堿提取工藝的優(yōu)化

李國(guó)平，王鈺蓉，鄭詩(shī)雪，莊歡歡

（武夷學(xué)院生態(tài)與資源工程學(xué)院，福建武夷山354300）

摘要：利用加熱回流法提取見(jiàn)血清總生物堿，以生物堿含量為考察指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)考察料液比、提取溫度、提取時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)4個(gè)因素對(duì)總生物堿提取率的影響，并通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定提取見(jiàn)血清總生物堿的最佳工藝參數(shù)，結(jié)果表明：見(jiàn)血清生物堿的最佳提取工藝條件為料液比1∶25，提取溫度90℃，提取時(shí)間2.5 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%；在此工藝條件下，見(jiàn)血清總生物堿的含量達(dá)到2.34%。

關(guān)鍵詞：生物堿；見(jiàn)血清；正交試驗(yàn)；加熱回流法；提取率

見(jiàn)血清（Liparis nervosa）屬于蘭科羊耳蒜屬，為地生或者附生草本，分布于福建、江西、浙江、湖南、臺(tái)灣、廣東、廣西及西南地區(qū)［1］。全草含生物堿，味苦、性涼，有涼血止血、清熱解毒的功效［2-3］。有關(guān)見(jiàn)血清的研究尚不多，主要集中在見(jiàn)血清的生藥鑒定［4］、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［5］、化學(xué)成分［6-7］和藥理作用［8-9］等。趙穎等［10］通過(guò)色譜法確定見(jiàn)血清生物堿為吡咯里西啶類(lèi)生物堿，董艷芳等［11］的研究表明見(jiàn)血青總生物堿具有較強(qiáng)的抑菌活性和抗氧化性，宋芹等［12］對(duì)見(jiàn)血清的止血作用進(jìn)行了科學(xué)評(píng)價(jià)，認(rèn)為見(jiàn)血清止血活性突出，是亟待開(kāi)發(fā)的止血新藥資源。見(jiàn)血清的止血效果與其生物堿含量相關(guān)，如何高效提取其總生物堿且保持生物堿的特性及品質(zhì)對(duì)于該藥材的綜合開(kāi)發(fā)利用具有重要的意義。文旭等［13］曾利用超聲波輔助法研究了見(jiàn)血清生物堿的提取工藝，本文應(yīng)用常規(guī)加熱回流法，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出最佳的提取工藝條件，為見(jiàn)血清止血藥的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

藥材：見(jiàn)血清全草，采自福建武夷山山區(qū)，洗凈后自然風(fēng)干，再放入烘箱中于65℃下烘干48 h，粉碎，過(guò)0.5 mm篩備用。

主要試劑：苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品、無(wú)水甲醇、乙酸乙酯、95%乙醇、鹽酸、氨水等均為分析純。

主要儀器：UV-3000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海美普達(dá)儀器有限公司）、R205B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）、pH-100精密酸度計(jì)（長(zhǎng)沙科儀儀器設(shè)備有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 生物堿的提取

稱(chēng)取5 g預(yù)處理好的藥材至圓底燒瓶中，置于加熱回流提取器中，按照單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)中設(shè)置的不同條件分別進(jìn)行提取，將乙醇提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得浸膏。向該浸膏中加入100 mL，0.6 moL/L鹽酸，振蕩溶解，使其充分反應(yīng)30 min，過(guò)濾；濾液用氨水調(diào)到pH=11，用100 mL乙酸乙酯分2次萃取。再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)，萃取液濃縮蒸干后，用無(wú)水甲醇定容至25 mL，用移液槍精密吸取50 μL到10 mL容量瓶中，用無(wú)水甲醇定容至10 mL備用。

1.2.2 生物堿定量測(cè)定

見(jiàn)血清中生物堿屬于吡咯里西啶類(lèi)的化合物，目前尚無(wú)見(jiàn)血清生物堿標(biāo)準(zhǔn)品，故本研究選擇苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照品。經(jīng)對(duì)苦參堿標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，表明在波長(zhǎng)220 nm處吸收值最大，故選擇220 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。精確稱(chēng)取苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品3.20 mg，置于25 mL容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，稍稍振動(dòng)使其溶解均勻，得到質(zhì)量濃度為0.128 mg/mL的儲(chǔ)備液；取儲(chǔ)備液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL于10.00 mL容量瓶中配制成質(zhì)量濃度為0.012 8、0.025 6、0.038 4、0.051 2、0.064 0 mg/mL的梯度溶液，在波長(zhǎng)220 nm下測(cè)定吸光值，作吸光度（y）對(duì)濃度（x）的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖（圖1），得到回歸方程為y=0.03x-0.000 4，表明苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品在質(zhì)量濃度為0.013 0～0.065 0 mg/mL的范圍內(nèi)與其吸光度呈良好的線性關(guān)系。

圖1 見(jiàn)血清生物堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線

按1.2.1 制備見(jiàn)血清提取液并測(cè)定吸光度，根據(jù)下式計(jì)算見(jiàn)血清總生物堿的含量（mg/g）。

式中：A為吸光度；m為見(jiàn)血清干粉質(zhì)量。

1.2.3 生物堿提取工藝的優(yōu)化

1.2.3.1 單因素試驗(yàn)

試驗(yàn)選擇料液比、提取溫度、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)這4個(gè)單因素，考察各因素不同水平（如表1）對(duì)見(jiàn)血清總生物堿含量的影響，每次試驗(yàn)均重復(fù)3次。

表1 單因素試驗(yàn)因素水平表

1.2.3.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，分別選取較優(yōu)因素水平，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，進(jìn)一步考察料液比、提取溫度、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)見(jiàn)血清總生物堿含量的影響，以此優(yōu)化其提取工藝。選取因素水平如表2。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 料液比對(duì)見(jiàn)血清總生物堿提取含量的影響

在提取溫度60℃、提取時(shí)間1.0 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%的條件下，不同料液比對(duì)見(jiàn)血清總生物堿提取含量的影響如圖2。由圖2可知，總生物堿含量隨料液比值的升高而逐步提高，料液比為1∶25時(shí)，總生物堿含量達(dá)最高，當(dāng)料液比大于1∶25時(shí)，總生物堿含量趨于降低?？紤]到過(guò)高的提取料液比會(huì)增加后續(xù)操作的難度，且造成試劑浪費(fèi)，因此，選擇料液比1∶15、1∶20、1∶25作為正交試驗(yàn)中的料液比的3個(gè)水平。

圖2 料液比對(duì)總生物堿提取效果的影響

2.2 提取溫度對(duì)總生物堿提取含量的影響

在料液比1∶15、提取時(shí)間1.0 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%的條件下，不同提取溫度對(duì)總生物堿提取含量的影響如圖3。如圖3所示，當(dāng)提取溫度為40～60℃時(shí)，總生物堿的提取含量變化曲線趨于平緩，提取得率不高。當(dāng)提取溫度達(dá)到70℃時(shí)，總生物堿的提取含量達(dá)到最高，超過(guò)70℃后，總生物堿提取含量迅速降低但高于40～50℃時(shí)的提取得率。因過(guò)高的溫度會(huì)致使乙醇揮發(fā)速度加快，影響見(jiàn)血清總生物堿的溶出效果；此外，溫度過(guò)高，總生物堿不穩(wěn)定，容易分解，影響見(jiàn)血清總生物堿的提取含量。故選用70、80、90℃作為正交試驗(yàn)中提取溫度的3個(gè)水平。

圖3 提取溫度對(duì)總生物堿提取效果的影響

2.3 提取時(shí)間對(duì)總生物堿提取含量的影響

在實(shí)驗(yàn)條件為料液比1∶15、提取溫度60℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%時(shí)，不同提取時(shí)間對(duì)總生物堿提取含量的影響如圖4。由圖4可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，見(jiàn)血清總生物堿的提取含量逐漸增加；當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)2.0 h后，總生物堿的提取含量開(kāi)始降低。這可能是由于提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，雜質(zhì)的浸出量也增加，從而影響生物堿的提取效果，因此，在正交試驗(yàn)中選用1.5、2.0、2.5 h作為提取時(shí)間的3個(gè)水平。

圖4 提取時(shí)間對(duì)總生物堿提取效果的影響

2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總生物堿提取含量的影響

在實(shí)驗(yàn)條件為料液比1∶15，提取溫度60℃，提取時(shí)間1.0 h時(shí)，不同提取時(shí)間對(duì)總生物堿提取含量的影響如圖5。如圖5所示，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，總生物堿的提取含量為最高；隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的進(jìn)一步升高，總生物堿的提取含量降低。這可能是因?yàn)殡S著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，一些醇溶性雜質(zhì)的溶出量也增加，從而影響了生物堿的提取，因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、50%、60%作為正交試驗(yàn)中的3個(gè)水平。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總生物堿提取效果的影響

2.5 最佳提取工藝的優(yōu)化

以料液比、提取溫度、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)作為考察因素，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，對(duì)見(jiàn)血清總生物堿提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如表3。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

極差分析結(jié)果表明：對(duì)見(jiàn)血清總生物堿提取含量影響最大的因素是提取時(shí)間，其次為提取過(guò)程中的料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度。由此可確定最佳的提取工藝條件為A3B3C3D2，即料液比1∶25，提取溫度90℃，提取時(shí)間2.5 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%。在此條件下做驗(yàn)證試驗(yàn)，見(jiàn)血清總生物堿含量為2.34%。

3 結(jié)論

見(jiàn)血清是武夷山地區(qū)道地藥材，品質(zhì)佳，藥效確切，其藥用價(jià)值與其總生物堿含量密切相關(guān)。本研究以乙醇為提取劑，采用加熱回流的方法提取見(jiàn)血清總生物堿，通過(guò)單因素試驗(yàn)考察對(duì)料液比、提取溫度、提取時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)這4個(gè)因素對(duì)見(jiàn)血清總生物堿提取含量的影響，再通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出提取見(jiàn)血清總生物堿的最優(yōu)工藝條件為：料液比1∶25，提取溫度90℃，提取時(shí)間2.5 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，在此條件下提取見(jiàn)血清總生物堿，含量達(dá)2.34%。該提取工藝操作過(guò)程簡(jiǎn)單，設(shè)備成本低，工藝成熟度高，有一定的應(yīng)用前景，可為見(jiàn)血清生物堿的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：葉麗娜）

A Study on Optimization for Extracting Total Alkaloids from Liparis Nervosa

LI Guoping，WANG Yurong，ZHENG Shixue，ZHUANG Huanhuan

（SchooL of EcoLogy and Resource Engineering，Wuyi University，Wuyishan，F(xiàn)ujian 35430）

Abstract:In order to increase the extraction efficiency of totaL aLkaLoids from Liparis nervosa，the infLuences of the ratio of materiaL to soLvent，extraction temperature，extraction time and ethanoL concentration on the yieLd of totaL aLkaLoids by using heating refLux method were studied in this paper. Based on the singLe factor experiments，the optimum extraction technoLogy was determined by orthogonaL design.The optimum extraction conditions were obtained as foLLows∶the ratio of materiaL to soLven 1∶25，extraction temperature 90℃，extraction time 2.5 h and ethanoL concentration 50%. Under the optimized extraction conditions，the content of totaL aLkaLoids in Liparis nervosa herb that coLLected from Wuyishan district was 2.34%.

Key words:aLkaLoid；Liparis nervosa；orthogonaL test；heating refLux method；extraction efficiency

中圖分類(lèi)號(hào)：Q946.88

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1674-2109（2016）03-0001-04

收稿日期：2015-08-22

基金項(xiàng)目：福建省林業(yè)科學(xué)研究項(xiàng)目（閩林科［2013］5號(hào)）；福建省科技廳戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)重點(diǎn)項(xiàng)目（2014N0030）；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201310397008、201410397006）。

作者簡(jiǎn)介：李國(guó)平（1966-），男，漢族，教授，主要從事植物多樣性保護(hù)與可持續(xù)利用研究。