陳紅彩，游 杏，丁 當(dāng)，趙 沖，游春平

（仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510225）

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白掌根腐病生防菌的篩選與鑒定

陳紅彩，游 杏，丁 當(dāng)，趙 沖，游春平

（仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510225）

摘 要：采用對(duì)峙培養(yǎng)法，從土壤中篩選出對(duì)白掌根腐病菌有拮抗作用的2株細(xì)菌菌株C3和S1；通過(guò)盆栽防治試驗(yàn)，結(jié)果顯示2株拮抗細(xì)菌C3和S1對(duì)白掌根腐病的防效分別為55%和50%；通過(guò)16SrDNA序列分析，拮抗細(xì)菌菌株C3和S1與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的序列相似性達(dá)99%；通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株C3與枯草芽孢桿菌在同一分支上，而菌株S1不在同一分支上。因此，初步將拮抗細(xì)菌菌株C3和S1分別鑒定為枯草芽孢桿菌和芽孢桿菌（Bacillus sp.）。

關(guān)鍵詞：白掌；根腐?。簧谰?；鑒定

近年來(lái)，我國(guó)花卉種植規(guī)模越來(lái)越大，產(chǎn)業(yè)化水平越來(lái)越高，出現(xiàn)了多方位、多層次、多行業(yè)發(fā)展花卉的新局面?；ɑ墚a(chǎn)業(yè)已成為重要的農(nóng)業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)之一。然而，日趨嚴(yán)重的土傳病害（如白掌根腐病、紅掌根腐病、蘭花根腐病和疫病等）已成為限制花卉產(chǎn)業(yè)發(fā)展和花農(nóng)收入的一個(gè)重要因素。高檔盆花是廣東省花卉產(chǎn)業(yè)的優(yōu)勢(shì)花卉之一，在“十一五”期間發(fā)展迅猛，產(chǎn)值和出口創(chuàng)匯均位列花卉產(chǎn)業(yè)之首。國(guó)蘭和紅掌均勢(shì)廣東主栽的高檔盆花，其中國(guó)蘭種植面積達(dá)733.3 hm2，占國(guó)內(nèi)國(guó)蘭種植面積50%以上；紅掌盆花年產(chǎn)約500萬(wàn)盆，約占全國(guó)紅掌盆花總產(chǎn)量的60%。白掌盆花年產(chǎn)約400萬(wàn)盆，約占全國(guó)白掌盆花總產(chǎn)量的20%。據(jù)項(xiàng)目組前期調(diào)查，腐爛病是這兩種盆花的重要病害，常造成植株黃化枯萎，發(fā)病嚴(yán)重的大棚發(fā)病率可達(dá)30%，給生產(chǎn)和花農(nóng)收入造成嚴(yán)重影響。由于此病為土傳病害，目前生產(chǎn)上主要通過(guò)化學(xué)農(nóng)藥處理栽培基質(zhì)來(lái)防治。但是，由于可供使用的化學(xué)農(nóng)藥種類不多，長(zhǎng)期反復(fù)使用導(dǎo)致病原菌抗藥性增強(qiáng)，藥劑防效降低、使用量增加。目前已有一些生防制劑用于農(nóng)作物病害的防治，但還沒(méi)有開發(fā)出用于花卉病害防治的生防制劑，因此開發(fā)出用于花卉病害防治的生防制劑具有重要的實(shí)現(xiàn)意義。

1　材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

BPDA培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨瓊脂）配方參照龔國(guó)淑等的方法［1］；PDA和PD培養(yǎng)基配方參照方中達(dá)的方法［2］；白掌根腐病菌（Cyliadroclsdium sp.）由仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 拮抗細(xì)菌篩選 于仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院校園中選取1 g土樣，加入1 000 mL蒸餾水中。采用劃線稀釋法［3］，在含BPDA平板上進(jìn)行分離、純化，獲得大量細(xì)菌菌株。將細(xì)菌菌株與白掌根腐病菌在PDA平板上進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)，挑選拮抗效果較好的拮抗細(xì)菌。

1.2.2 生防菌篩選 在PD培養(yǎng)液中震蕩培養(yǎng)48 h的拮抗細(xì)菌噴淋于白掌苗（株高約20 cm）根部，對(duì)照為不噴淋拮抗細(xì)菌，每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15株。培養(yǎng)48 h后再接種白掌根腐病菌（在小麥粒上培養(yǎng)7 d），將處理過(guò)的白掌盆栽苗置于28℃溫室中培養(yǎng)，15 d后觀察防治效果。

1.2.3 細(xì)菌菌株鑒定 將純化的生防菌株送至上海立菲生物技術(shù)有限公司進(jìn)行16S rDNA序列分析，將病菌16S rDNA序列在GenBank（登錄http://.ncbi.nlm.nih.gov）中進(jìn)行Blast比對(duì)，分析序列相似程度。利用MEGA4.0軟件的Clustal W程序進(jìn)行精確比對(duì)，采用Neighbor-joining法［4］，將GenBank中序列相似度較高的細(xì)菌與病原菌構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析病原菌的歸屬。

2　結(jié)果與分析

2.1 生防菌篩選

從土壤中分離出C1、C2、C3、C4、S1等5個(gè)細(xì)菌菌株，并與白掌根腐病菌（Cyliadroclsdium sp.）進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)，結(jié)果顯示，菌株C3與菌株S1對(duì)白掌根腐病菌生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。

在PD培養(yǎng)液中震蕩培養(yǎng)48 h的拮抗細(xì)菌噴淋于白掌苗根部，培養(yǎng)48 h后再接種白掌根腐病菌，15 d后觀察拮抗菌防治效果，結(jié)果顯示，拮抗菌株C3和S1對(duì)白掌根腐病的防治效果分別為55%和50%。

2.2 生防菌株C3和S1的分子鑒定

2.2.1 生防菌株C3的分子鑒定結(jié)果 在GenBank上進(jìn)行16S rDNA序列比對(duì)，與該菌株C3的16S rDNA序列（圖1）相似度達(dá)99%的細(xì)菌均為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）或未定種的芽孢桿菌（Bacillus sp.），利用Genestar、DNASP和Mega5軟件構(gòu)建菌株C3與相關(guān)細(xì)菌16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果（圖2）顯示，菌株C3與枯草芽孢桿菌在同一分支上，因此，初步將菌株C3鑒定為枯草芽孢桿菌。

2.2.2 生防菌株S1的分子鑒定結(jié)果 在GenBank上進(jìn)行16S rDNA序列比對(duì)，與該菌株S1的16S rDNA序列（圖3）相似度達(dá)99%的細(xì)菌有8株枯草芽孢桿菌、1株龍舌蘭芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）和2株未定種的芽孢桿菌（Bacillus sp.），利用Genestar、DNA-SP和Mega5軟件構(gòu)建菌株S1與相關(guān)細(xì)菌16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，菌株C3與枯草芽孢桿菌和舌蘭芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）不在同一個(gè)分支（圖4），因此，初步將菌株C3鑒定為芽孢桿菌（Bacillus sp.）。

圖1　菌株C3的16S rDNA序列

圖2　病原菌菌株C3與相似種的16S rDNA分子系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3　菌株S1的16S rDNA序列

圖4　病原菌菌株S1與相似種的16S rDNA分子系統(tǒng)發(fā)育樹

3　討論

白掌根腐病是一種土傳病害，這類病害難以防治，包括化學(xué)防治措施，而且化學(xué)藥劑容易造成環(huán)境污染，因此開發(fā)環(huán)境友好、防效較高的生防制劑具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究獲得對(duì)白掌根腐病防效分別為55%和50%的生防菌株C3和S1。關(guān)于細(xì)菌的鑒定方法，利用16S rDNA擴(kuò)增測(cè)序技術(shù)鑒定細(xì)菌與其它細(xì)菌鑒定方法比較，具有高效、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，己成為微生物分類學(xué)中最重要的方法，但是同一屬內(nèi)不同種細(xì)菌的16S rDNA序列高度保守，有時(shí)僅僅根據(jù)16S rDNA序列相似性難以進(jìn)行種水平上的鑒定，現(xiàn)在許多人通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對(duì)微生物在種水平上進(jìn)行鑒定［5-8］。通過(guò)16S rDNA序列分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，初步將生防菌株C3和S1鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和芽孢桿菌（Bacillus sp.）?？莶菅挎邨U菌作為生防菌已開發(fā)出許多產(chǎn)品，如Kodiak（GB03）、Subtilex（MBI600）、Serenade（QST713）和Taensa（FZB24），我國(guó)開發(fā)的亞寶、百抗、麥豐寧、紋曲寧、康地蕾得等。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)于芽孢桿菌各方面應(yīng)用的研究日益增多，枯草芽孢桿菌作為一種生防細(xì)菌越來(lái)越引起人們的關(guān)注［9-10］。而經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌是土壤和植物微生態(tài)區(qū)系的優(yōu)勢(shì)生物種群，許多性狀優(yōu)良的菌株表現(xiàn)出對(duì)多種植物病原菌的拮抗抑制作用［11］，對(duì)糧食、蔬菜和水果等病害有較好的防治效果［12］。本研究獲得的生防菌株C3和S1在盆栽試驗(yàn)中具有一定的防治效果，但對(duì)于大田防治效果如何還有待進(jìn)一步試驗(yàn)。

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（責(zé)任編輯楊賢智）

Screening and identification of biocontrol bacteria against root rot of Spathiphyllum kochii caused by Cylindroclasdium sp.

CHEN Hong-cai， YOU Xing， DING Dang， ZHAO Chong， YOU Chun-ping

（College of Agronomy， Zhongkai University of Engineering and Agriculture， Guangzhou 510225，China）

Key words：Spathiphyllum kochii；root rot disease；biocontrol bacteria；identification

Abstract：Two antagonistic bacterial strains C3 and S1 against the pathogen of root rot of Spathiphyllum kochii were isolated from horticultural soil by using confront culture， their control efficiencies on root rot of S.kochii reached to 55% and 50%， respectively.Based on analysis of 16S rDNA sequences， similarity between strain C3 or S1 and Bacillus subtilis was 99.9%.Through construction of phylogenetic tree between antagonistic strains and their related strains from GenBank， strain C3 and Bacillus subtilis were on the same clade， but strain S1 and B.subtilis were not on a clade， so，antagonistic strain C3 and S1 were preliminarily identified as Bacillus subtilis and Bacillus sp.， respectively.

中圖分類號(hào)：S482.2+92

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1004-874X（2016）01-0089-04

收稿日期：2015-09-21

基金項(xiàng)目：國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新基金（KK1133065）

作者簡(jiǎn)介：陳紅彩（1994-），女，助教，E-mail：370549533@qq.com

通訊作者：游春平（1962-），男，博士，教授，E-mail：1309497194@qq.com