林陽(yáng)彥王 沫楊 勇邱春明歐群雄何 佩李炳坤. 佛山市南海區(qū)第三人民醫(yī)院泌尿外科（廣東佛山　5844）；. 南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院泌尿外科

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尿道上皮細(xì)胞/片狀多孔絲素蛋白支架復(fù)合物修復(fù)兔尿道缺損的實(shí)驗(yàn)研究*

林陽(yáng)彥1王 沫1楊 勇1邱春明1歐群雄1何 佩1李炳坤2
1. 佛山市南海區(qū)第三人民醫(yī)院泌尿外科（廣東佛山258244）；2. 南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院泌尿外科

摘要目的 探索用尿道上皮細(xì)胞/片狀多孔絲素蛋白支架復(fù)合物修補(bǔ)長(zhǎng)段尿道缺損的可行性及效果。方法 取雄性新西蘭兔（2.5kg）27只，隨機(jī)分成3組： 實(shí)驗(yàn)組：尿道上皮細(xì)胞/多孔絲素蛋白支架復(fù)合物組（n＝9）；對(duì)照組Ⅰ：假手術(shù)組（n＝9）；對(duì)照組Ⅱ：尿道缺損組（n＝9）。三組共同飼養(yǎng)4周和16周后，分別對(duì)手術(shù)部位行病理學(xué)檢查，8周后分別進(jìn)行膀胱尿道造影、尿動(dòng)力檢測(cè)（尿道測(cè)壓）和病理檢測(cè)。結(jié)果 27只兔實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)一例死亡。對(duì)照組Ⅰ術(shù)后4、8及16周，尿道組織結(jié)構(gòu)無(wú)明顯區(qū)別，尿道上皮細(xì)胞均勻覆蓋，層數(shù)約4～5層，排列規(guī)則，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞。對(duì)照組Ⅱ術(shù)后4、8及16周瘢痕形成，組織質(zhì)地堅(jiān)韌，腔壁纖維化形成，可見(jiàn)大量的纖維組織及成纖維細(xì)胞，黏膜缺損；實(shí)驗(yàn)組術(shù)后4周時(shí)可見(jiàn)較多炎癥細(xì)胞，材料表面細(xì)胞黏附，層數(shù)約6～8層，絲素蛋白復(fù)合體發(fā)生扭曲，術(shù)后8周片狀多孔絲素蛋白支架降解成碎片狀，組織均勻覆蓋；術(shù)后16周尿道上皮細(xì)胞排列均勻，層數(shù)約4～5層，無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)較多血管，與對(duì)照組Ⅰ相似。術(shù)后8周，對(duì)照組I膀胱尿道造影顯示尿道黏膜連續(xù)性好，管腔光滑，管徑均勻。對(duì)照組Ⅱ造影片顯示尿道黏膜連續(xù)性的中斷，管腔毛糙，尿道管徑變細(xì)，呈現(xiàn)尿道狹窄的表現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)組膀胱尿道造影提示尿道黏膜的連續(xù)性良好，管腔稍毛糙，管徑與對(duì)照組I基本一致。尿道測(cè)壓：實(shí)驗(yàn)組術(shù)后8周手術(shù)部位的尿道阻力平均值（15.25±1.72）cmH2O，對(duì)照組I尿道阻力的平均值為（14.85±1.96）cmH2O，兩組對(duì)比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），對(duì)照組II尿道阻力平均值為（27.83±3.71）cmH2O，阻力明顯增高，與實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組Ⅰ相比均有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。結(jié)論 尿道上皮細(xì)胞/多孔絲素蛋白支架復(fù)合物可以作為尿道修復(fù)的支架，具有促進(jìn)尿道缺損修復(fù)的能力。

關(guān)鍵詞組織工程； 尿道狹窄；絲素蛋白質(zhì)類；上皮細(xì)胞

尿道狹窄是泌尿外科的常見(jiàn)病，但是目前尿道狹窄的治療仍然是泌尿外科醫(yī)生的巨大挑戰(zhàn)，尤其是＞3cm的長(zhǎng)段狹窄，目前的常用的修補(bǔ)方法，再狹窄率仍然很高，所以目前泌尿外科的學(xué)者們都在尋求價(jià)廉物美、效果良好、并發(fā)癥少的尿道修補(bǔ)材料。絲素蛋白是目前組織工程學(xué)的一種重要材料，其無(wú)毒性、無(wú)刺激作用，組織相容性好，同時(shí)來(lái)源豐富，價(jià)格低廉，具有巨大的潛力和優(yōu)勢(shì)，目前已嘗試應(yīng)用于多種組織修補(bǔ)，本文嘗試應(yīng)用尿道上皮細(xì)胞/多孔絲素蛋白支架復(fù)合物修補(bǔ)尿道，以明確尿道上皮細(xì)胞/片狀多孔絲素蛋白支架復(fù)合物修補(bǔ)長(zhǎng)段尿道缺損的可行性及效果。

材料與方法

一、材料

雄性新西蘭兔27 只（2.5±0.5）kg （南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心） 絲素蛋白支架孔徑80μm。

二、尿道上皮細(xì)胞/多孔絲素蛋白支架復(fù)合物的制備

1. 用 75%酒精溶液的浸泡消毒多孔絲素蛋白支架，取出后干燥24h。

2. 將絲素蛋白支架置于環(huán)氧乙烷氣體中滅菌12h。

3. 將絲素蛋白支架修剪為1.5cm×1.0cm，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基浸泡24h后，將支架材料轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)。

4. 將原代分離的兔尿道上皮細(xì)胞傳代3次后加入至放置有支架材料的24孔板內(nèi)，每孔加入1mL，注意要使支架材料浸沒(méi)在培養(yǎng)基中。

5. 將支架材料在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，取出，用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h。

三、動(dòng)物分組

27只兔隨機(jī)分成3 組：實(shí)驗(yàn)組（9只）； 對(duì)照組Ⅰ（9只）； 對(duì)照組Ⅱ（9只）。

四、方法

（一）手術(shù)方法

1. 實(shí)驗(yàn)組切開(kāi)兔陰莖皮膚及皮下組織 游離出尿道海綿體，切開(kāi)尿道海綿體，將尿道黏膜切除1.5 cm，用1.5 cm 尿道上皮細(xì)胞/多孔絲素蛋白支架復(fù)合物修復(fù)尿道缺損，以7-0 腸線縫合兩端兩吻合口分別選取3點(diǎn)、 9點(diǎn)及12點(diǎn)，以5-0 絲線作為標(biāo)記，術(shù)后留置8F 導(dǎo)尿管1周后拔除。

2. 對(duì)照組Ⅰ行尿道海綿體切開(kāi)后，即逐層縫合海綿體、皮下組織及皮膚，術(shù)后留置8F 導(dǎo)尿管，1周后拔除。

3. 對(duì)照組Ⅱ操作同實(shí)驗(yàn)組，切除尿道中段1.5cm尿道黏膜，逐層縫合切口，依靠尿道自體組織再生修復(fù)缺損，術(shù)后留置8F 導(dǎo)尿管，1周后拔除。

（二）檢測(cè)方法

1. 對(duì)3組實(shí)驗(yàn)兔分別在戊巴比妥鈉靜脈麻醉下進(jìn)行尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)（尿道測(cè)壓）。

2. 對(duì)3組組織增生情況觀察及逆行尿道造影 在術(shù)后8 周行逆行尿道造影，然后取材行HE 染色、Van Gieson VG染色及免疫組織化學(xué)染色觀察組織再生情況。

結(jié)　果

27只兔實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)一例死亡。術(shù)后8周，對(duì)照組Ⅱ造影片顯示尿道黏膜連續(xù)性中斷，管腔毛糙，尿道管徑變細(xì)，呈現(xiàn)尿道狹窄的表現(xiàn)。對(duì)照組Ⅰ膀胱尿道造影顯示尿道黏膜連續(xù)性好，管腔光滑，管徑均勻。實(shí)驗(yàn)組膀胱尿道造影提示尿道黏膜的連續(xù)性良好，管腔稍毛糙，管徑與對(duì)照組Ⅰ基本一致（圖1）。

對(duì)照組Ⅰ術(shù)后4、8及16周尿道組織結(jié)構(gòu)無(wú)明顯區(qū)別，尿道上皮細(xì)胞均勻覆蓋，層數(shù)約4～5層，排列規(guī)則，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞，黏膜下可見(jiàn)較多的平滑肌細(xì)胞，間有少量膠原纖維；VG染色可見(jiàn)膠原纖維呈鮮紅色，數(shù)量較少，平滑肌細(xì)胞呈黃色，膠原纖維分散分布于平滑肌之間（圖2）。對(duì)照組Ⅱ術(shù)后4及8周時(shí)均見(jiàn)腔壁纖維化形成，可見(jiàn)大量的纖維組織及成纖維細(xì)胞，其間可見(jiàn)炎癥細(xì)胞，大部分區(qū)域上皮細(xì)胞缺失，少數(shù)區(qū)域可見(jiàn)少量上皮細(xì)胞，排列混亂；16周仍以纖維組織為主，瘢痕化形成，可見(jiàn)陳舊性纖維組織，上皮細(xì)胞增多，層數(shù)約4～5層，排列混亂，偶可見(jiàn)少量平滑肌細(xì)胞，VG染色示修復(fù)區(qū)大量膠原纖維（圖3）。

圖11　AA、BB、CC 分別是對(duì)照組Ⅰ、對(duì)照組Ⅱ及實(shí)驗(yàn)組術(shù)后8周逆行尿道造影對(duì)照組I尿道黏膜連續(xù)性好，官腔光滑，對(duì)照組II尿道黏膜連續(xù)性中斷，官腔毛糙，實(shí)驗(yàn)組尿道黏膜連續(xù)性好，管腔稍毛糙

圖22　AA、BB分別是對(duì)照組Ⅰ術(shù)后1166周尿道組織切片HHEE染色和VVGG染色（×400）尿道組織結(jié)構(gòu)無(wú)明顯區(qū)別，尿道上皮細(xì)胞均勻覆蓋，層數(shù)約4～5層，排列規(guī)則，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞

圖33　A、BB、CC、DD 分別是對(duì)照組Ⅱ術(shù)后8周、1166周尿道組織切片HHEE染色和術(shù)后8周、1166周VVGG尿道組織切片染色（×200）4及8周時(shí)均見(jiàn)壁纖維化形成，可見(jiàn)大量的纖維組織及成纖維細(xì)胞，其間可見(jiàn)炎癥細(xì)胞，大部分區(qū)域上皮細(xì)胞缺失，16周仍以纖組織為主，瘢痕化形成，可見(jiàn)陳舊性纖維組織

實(shí)驗(yàn)組術(shù)后4周時(shí)可見(jiàn)較多炎癥細(xì)胞，材料表面細(xì)胞黏附，層數(shù)約6～8層，排列不均勻，絲素蛋白支架網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)進(jìn)一步發(fā)生扭曲，可見(jiàn)部分網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)裂解；8周時(shí)鏡下難于辨認(rèn)絲素蛋白膜支架，表面細(xì)胞層數(shù)約5～7層，排列較4周時(shí)均勻，漸趨向規(guī)則，炎癥細(xì)胞較前明顯減少，可見(jiàn)較多的成纖維細(xì)胞及膠原纖維，排列不規(guī)則，同時(shí)可見(jiàn)少量的平滑肌細(xì)胞及小口徑血管；16周尿道上皮細(xì)胞排列均勻，完全覆蓋，層數(shù)約4～5層，平滑肌細(xì)胞明顯增多，成纖維細(xì)胞及膠原纖維數(shù)量減少、排列規(guī)則，無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)較多管徑粗大的血管，與對(duì)照組Ⅰ相似（圖44，圖5）。

尿道測(cè)壓：實(shí)驗(yàn)組術(shù)后8周手術(shù)部位的尿道阻力平均值（15.25±1.72）cmH2O，對(duì)照組I尿道阻力的平均值為（14.85±1.96）cmH2O，兩組對(duì)比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；對(duì)照組Ⅱ尿道阻力平均值為（27.83±3.71）cmH2O，阻力明顯增高，與實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組Ⅰ相比均有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

圖44 AA、BB、CC 分別是實(shí)驗(yàn)組術(shù)后4、88、1166周尿道組織切片HHEE染色（×400）絲素蛋白支架逐漸吸收，表面細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞層數(shù)逐漸增至4～5層，排列整齊，滑肌細(xì)胞明顯增多，成纖維細(xì)胞及膠原纖維數(shù)量逐漸減少

圖55　AA、BB實(shí)驗(yàn)組術(shù)后8周及1166周實(shí)驗(yàn)組尿道組織切片VVGG染色（×400）絲素蛋白支架消失，表面細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞層數(shù)逐漸增至4～5層，排列整齊，滑肌細(xì)胞明顯增多，成纖維細(xì)胞及膠原纖維數(shù)量逐漸減少，可見(jiàn)較多管徑粗大的血管

討　論

尿道狹窄（urethral strictures，US）是臨床泌尿外科較為常見(jiàn)的一類疾病， 對(duì)于泌尿外科醫(yī)生來(lái)說(shuō)，尿道狹窄仍然是一個(gè)重大的挑戰(zhàn)，尤其是對(duì)超過(guò)3cm的長(zhǎng)段尿道狹窄，目前臨床常用的治療方法效果均不甚理想［1］。對(duì)于長(zhǎng)段的尿道狹窄，目前主要的治療方法是替代材料尿道成形術(shù)，所面臨的主要問(wèn)題就是尋找替代材料。過(guò)去10多年，臨床上的替代材料從自體皮膚黏膜、膀胱黏膜、口腔黏膜到移植物［2］。對(duì)于自身材料，這些方法均以犧牲自體正常組織為代價(jià)，造成額外的創(chuàng)傷，一旦效果不好，造成雙重?fù)p失。另外，有學(xué)者嘗試應(yīng)用程序化凍存同種異體膀胱黏膜作為修補(bǔ)材料，但僅限于實(shí)驗(yàn)階段［3，4］。而組織工程材料為長(zhǎng)段尿道缺損帶來(lái)的新的希望，但是大多數(shù)組織工程材料價(jià)格相對(duì)昂貴，限制了其廣泛應(yīng)用。

絲素蛋白以組織相容性好，理化特性穩(wěn)定，在體內(nèi)可降解等優(yōu)勢(shì)作為組織工程學(xué)良好的支架材料得到大家的肯定。另外，絲素蛋白是由蠶繭繅絲脫膠而得的纖維狀蛋白質(zhì)，所以來(lái)源豐富［5，6］。隨著制備技術(shù)的進(jìn)步，制備絲素蛋白的成本也越來(lái)越低，所以絲素蛋白有可能成為被廣泛應(yīng)用的尿道修補(bǔ)材料。

我們的前期實(shí)驗(yàn)，嘗試用單純多孔絲素蛋白支架修復(fù)1.5cm的新西蘭大白兔尿道缺損，術(shù)后8周，尿道上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞逐漸修復(fù)尿道缺損區(qū)，術(shù)后16周，尿道上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞排列有序，與正常對(duì)照組無(wú)明顯差異［7］。但是，有報(bào)道認(rèn)為，由于絲素蛋白的吸收速度問(wèn)題，在尿道完全修復(fù)前，絲素蛋白已經(jīng)吸收，會(huì)導(dǎo)致修復(fù)段尿道的攣縮；而應(yīng)用細(xì)胞支架復(fù)合物修復(fù)尿道，盡管相對(duì)復(fù)雜，并且周期較長(zhǎng)；但由于存在尿道上皮種子細(xì)胞的再生作用，修復(fù)較快，能夠有效縮短尿道修復(fù)時(shí)間，降低修復(fù)段尿道的攣縮發(fā)生率。所以理論上說(shuō)，細(xì)胞/支架復(fù)合物要比單純支架修復(fù)缺損的尿道效果更好。至于多孔絲素蛋白的孔徑多大為最優(yōu)，目前也在探索階段。

本實(shí)驗(yàn)嘗試應(yīng)用80μm的尿道上皮細(xì)胞/片狀多孔絲素蛋白支架復(fù)合物修復(fù)1.5cm的新西蘭大白兔尿道缺損，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，術(shù)后無(wú)論是影像學(xué)的尿道通暢程度，還是尿動(dòng)力學(xué)的尿道壓力，均與正常對(duì)照無(wú)明顯差異。初步說(shuō)明應(yīng)用尿道上皮細(xì)胞/片狀多孔絲素蛋白支架復(fù)合物作為長(zhǎng)段尿道缺損的修補(bǔ)替代材料，是有效的。但是本實(shí)驗(yàn)也存在一定局限性，包括隨訪時(shí)間較短而且僅僅應(yīng)用于新西蘭大白兔，所以，應(yīng)用于需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。今后我們進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)將尿道上皮細(xì)胞/片狀多孔絲素蛋白支架復(fù)合物應(yīng)用于較大的動(dòng)物，比如比格犬等動(dòng)物。另外，嘗試應(yīng)用于不同長(zhǎng)度的尿道狹窄的修補(bǔ)，證實(shí)其適合修復(fù)的尿道長(zhǎng)度。最后，需要延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)間，明確其長(zhǎng)期療效。

參 考 文 獻(xiàn)

1 Peterson AC， Webster GD. Management of urethral stricture disease： developing options for surgical intervention. BJU Int 2004； 94（7）： 971-976

2 Singh O， Gupta SS， Arvind NK. Anterior urethral strictures： a brief review of the current surgical treatment. Urol Int 2011； 86（1）： 1-10

3 Lu Y， Li B， Wang X， et al. The effect of programmed cryopreservation on immunogenicity of bladder mucosa in New Zealand rabbits. Cryobiology 2012； 64（1）： 27-32

4 Li B， Lu Y， Liu C， et al. Urethral reconstruction using allogenic frozen-thawed bladder mucosa： an experimental study. Urol Int. 2013； 90（4）： 422-429

5 Altman GH， Diaz F， Jakuba C， et al. Silk-based biomaterials. Biomaterials. 2003； 24（3）： 401-416

6 Dal Pra I， Freddi G， Minic J， et al. De novo engineering of reticular connective tissue in vivo by silk fibroin nonwoven materials. Biomaterials. 2005； 26（14）： 1987-1999

7 劉春曉， 林陽(yáng)彥， 李虎林， 等. 絲素蛋白膜修復(fù)兔尿道缺損的實(shí)驗(yàn)研究. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) 2007； 27（2）： 184-187

（2016-01-08收稿）

doi：10.3969/j.issn.1008-0848.2016.03.003

中圖分類號(hào)R 695.4

*基金項(xiàng)目資助：2013年廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（S2013040016823）；2014年度佛山市衛(wèi)生局醫(yī)學(xué)科研立項(xiàng)（2014293）

Application of urethral epithelial cells/Silk Fibroin composite in rabbit urethral defect repairing*

Lin Yangyan1， Wang Mo1， Yang Yong1， Qiu Chunming1， Ou Qunxiong1， He Pei1， Li Bingkun2
1. Department of Urology， the Third People's Hospital of Nanhai District， Foshan 258244， Guangdong， China 2. Department of Urology， Zhujiang Hospital， Southern Medical University

AbstractObjectiveTo explore the feasibility and effect of urethral epithelial cells/porous silk fi broin composite in long-segment urethral defect repairing. Metthhooddss Total of 27 male New Zealand rabbits （2.5Kg） were randomly divided into 3 groups such as the experimental group （urethral epithelial cells/porous silk fi broin composite group， n=9）； the control group I （sham-operated group， n=9）； the control group Ⅱ （Urethral defect group， n=9）. Pathology was performed in three groups after 4 and 16 weeks feeding. Cystourethrography， urodynamics （urethral pressure） and pathology were detected after 8 weeks feeding. RessuullttssNo rabbit died during the experiment. In 4， 8 and 16 weeks after operation， the urethral organization of control groupⅠhad no obvious difference， about 4～5 layers urethral epitheliums covered uniformly andregularly. There was no infl ammatory cell. In the control groupⅡ， scar tissue was formed， a large amount of fi brous tissue and mucosa defect was showed in the urethra. In 4 weeks after the operation， there were lots of infl ammatory cells， about 6～8 layers of cells were adhered on the material， and urethral epithelial cells/porous silk fi broin composite were distorted. In 8 weeks after the operation， urethral epithelial cells/porous silk fi broin composite degraded into chips and uniform tissue was cover on the urethral epithelial cells/porous silk fi broin composite； In 16 weeks after the operation， urethral epithelial cells arranged in uniform layers， about 4～5 layers， no obvious infl ammatory cells infi ltered， there were lots of blood vessels，similar to the control group I. The cystourethrography of the control group Ⅱ showed the interruption of urethral mucosa，narrowing of the urethral lumen. The cystourethrography of the control group I revealed good continuity of urethral lumen. The cystourethrography of experimental group was similar to the control group I. Urethral pressure-the urethral resistance 8 weeks after the operation： the average urethral pressure of experimental group was （15.25±1.72） cm H2O， and the control group I was （14.85±1.96） cm H2O， no signifi cant difference was found between two groups （P＞0.05）. The average urethral pressure of control group II was （27.83±3.71）cm H2O， a signifi cant difference was found compared with the experimental group and the control group I （P＜0.05）. ConclussiioonnUrethral epithelial cells / porous silk fi broin composite can be used as scaffold for urethral repair， and have the ability to promote the urethral defect repair.

Key wordstissue engineering；urethral stricture；fi broins；epithelial cells