狄 準(zhǔn)，趙艷麗，左智天，龍 華，張 雪，王元忠*，李 鸝*

1. 吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000 2. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所，云南 昆明 650200 3. 云南技師學(xué)院，云南 安寧 650300

藥用植物川東獐牙菜紅外光譜分析與鑒別

狄 準(zhǔn)1, 2，趙艷麗2，左智天2，龍 華1，張 雪3，王元忠2*，李 鸝1*

1. 吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000 2. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所，云南 昆明 650200 3. 云南技師學(xué)院，云南 安寧 650300

采用傅里葉變換紅外光譜法(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)、偏最小二乘判別分析(partial least square discriminant analysis, PLS-DA)和系統(tǒng)聚類(lèi)分析(hierarchical cluster analysis, HCA)快速鑒別不同產(chǎn)地川東獐牙菜(SwertiadavidiFranch)。采集4個(gè)不同地區(qū)70株樣品不同部位的紅外光譜數(shù)據(jù)，原始光譜數(shù)據(jù)經(jīng)預(yù)處理(自動(dòng)基線(xiàn)校正，自動(dòng)平滑，一階求導(dǎo)，二階求導(dǎo))后導(dǎo)入OMNIC 8.2，比較吸收峰的差異； 用SIMCA-Pa+10.0進(jìn)行偏最小二乘判別分析(PLS-DA)，以前三個(gè)主成分三維得分圖比較產(chǎn)地鑒別效果； 紅外光譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 19.0，進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析(HCA)，通過(guò)樹(shù)狀圖比較不同部位分類(lèi)效果。結(jié)果顯示，(1)不同產(chǎn)地根的光譜圖在1 739，1 647，1 614，1 503，1 271，1 243，1 072 cm-1附近的吸收峰有差異，不同產(chǎn)地莖的光譜圖在1 503，1 270，1 246 cm-1吸收峰附近有差異； (2)相同產(chǎn)地不同部位的光譜特征峰有差異； (3)PLS-DA分析結(jié)果顯示自動(dòng)基線(xiàn)校正+自動(dòng)平滑+二階求導(dǎo)這種預(yù)處理方式分類(lèi)效果最好，根的紅外光譜數(shù)據(jù)產(chǎn)地鑒別效果最佳； (4)HCA的樹(shù)狀圖，顯示根的聚類(lèi)分析結(jié)果正確率83%，莖的聚類(lèi)分析結(jié)果正確率49%，葉的聚類(lèi)分析結(jié)果正確率70%。FTIR技術(shù)結(jié)合PLS-DA與HCA方法能夠快速準(zhǔn)確地鑒別不同產(chǎn)地川東獐牙菜，不同部位產(chǎn)地鑒別效果有差異，根的光譜數(shù)據(jù)產(chǎn)地鑒別效果最佳，二階求導(dǎo)處理增強(qiáng)了樣品的特異性，使PLS-DA的三維主成分得分圖分類(lèi)效果更明顯。

紅外光譜； 產(chǎn)地鑒別； 川東獐牙菜； 系統(tǒng)聚類(lèi)分析； 偏最小二乘判別分析

引 言

川東獐牙菜(SwertiadavidiFranch.)為龍膽科獐牙菜屬多年生草本植物[1]，俗稱(chēng)魚(yú)膽草、水黃連、水靈芝，為我國(guó)特有的獐牙菜屬植物，主要分布于川、湘、鄂、黔等地[2]。川東獐牙菜的主要藥用成分有獐牙菜苦苷、苦龍膽酯苷、龍膽苦苷等，具有清熱解毒、清肝利膽、防治腫瘤等[3]功效，民間將其曬干沖泡飲用，用于治療痢疾、口腔潰瘍。

藥用植物鑒別是保證藥材品質(zhì)的關(guān)鍵，不同的產(chǎn)地環(huán)境會(huì)影響藥材的藥效和藥性[4]。傳統(tǒng)藥用植物的鑒別技術(shù)有色譜鑒別[5-6]、顯微鑒別[7]、分子鑒別[8]等，色譜鑒別方法預(yù)處理過(guò)程會(huì)破壞樣品，顯微鑒別難以區(qū)分不同產(chǎn)地同一物種，分子鑒別操作步驟繁瑣，對(duì)操作技術(shù)要求高。傅里葉變換紅外光譜法具有操作簡(jiǎn)便、快速、樣品無(wú)損的特點(diǎn)[9]，廣泛應(yīng)用于藥用植物種類(lèi)、產(chǎn)地鑒別。Zhao等[10]將近紅外光譜與高效液相色譜結(jié)合區(qū)分不同產(chǎn)地和不同種類(lèi)的重樓，Li等[11]結(jié)合二階求導(dǎo)與二維相關(guān)紅外光譜方法鑒別不同種類(lèi)的當(dāng)歸，F(xiàn)an等[12]運(yùn)用FTIR技術(shù)，結(jié)合PLS-DA和PCA兩種方法區(qū)分不同產(chǎn)地天麻。

目前，獐牙菜屬植物的研究重點(diǎn)主要集中在元素測(cè)定、化學(xué)成分對(duì)疾病的作用、獐牙菜種類(lèi)鑒別和植物組織培養(yǎng)等方面。Negi[13]研究不同海拔、不同季節(jié)影響下寬絲獐牙菜中根與葉的無(wú)機(jī)元素，Wang等[14]研究大籽獐牙菜對(duì)糖尿病鼠類(lèi)的治療作用，Wan等[15]研究貴州獐牙菜乙醇提取物對(duì)糖尿病的作用，Pandey等[16]比較芒果苷的含量以區(qū)分五種獐牙菜，Tao等[17]研究川西獐牙菜愈傷組織如何有效再生，獐牙菜藥用植物產(chǎn)地鑒別方面鮮有報(bào)道。本研究運(yùn)用FTIR技術(shù)結(jié)合PLS-DA與HCA方法，迅速準(zhǔn)確地鑒別川東獐牙菜的產(chǎn)地，為該藥用植物提供了一種簡(jiǎn)單易行的產(chǎn)地鑒別方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

供試材料于2014年7月—8月采集，經(jīng)吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院李鸝教授鑒定為川東獐牙菜SwertiadavidiFranch.，標(biāo)本存放于吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院植物標(biāo)本館(標(biāo)本號(hào)為201408011)，樣品信息見(jiàn)表1。

Table 1 Information of samples

1.2 儀器

Frontier型傅里葉變換紅外光譜儀(Perkin Elmer公司)，配備DTGS檢測(cè)器； FW-100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(天津市華鑫儀器廠)； 60目標(biāo)準(zhǔn)篩(浙江上虞市道墟五四儀器廠)； YP-2型壓片機(jī)(上海市山岳科學(xué)儀器有限公司)； XS125A型電子分析天平(瑞士Precisa公司)； 溴化鉀(分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)； SPSS 19.0分析軟件； SIMCA-P+10.0分析軟件； OMNIC 8.2分析軟件。

1.3 樣品制備

植株清洗干凈，將根、莖、葉分開(kāi)保存，長(zhǎng)溪村居群(W1)第1株植物的根標(biāo)記為W1-1-1，莖標(biāo)記為W1-1-2，葉標(biāo)記為W1-1-3，以此類(lèi)推，陰干。粉碎，過(guò)60目篩，備用。精確稱(chēng)取樣品粉末1.0 mg，與KBr按1∶50的比例在研缽中混勻，壓片。

1.4 光譜數(shù)據(jù)處理

掃描范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描信號(hào)累加16次。原始圖譜由OMNIC 8.2分析軟件預(yù)處理。將自動(dòng)平滑+自動(dòng)基線(xiàn)校正圖譜，自動(dòng)平滑+自動(dòng)基線(xiàn)校正+一階求導(dǎo)圖譜，自動(dòng)平滑+自動(dòng)基線(xiàn)校正+二階求導(dǎo)圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P+10.0進(jìn)行PLS-DA； 數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 19.0進(jìn)行HCA，距離計(jì)算方式： 歐氏距離的平方(Squared Euclidean distance)，聚類(lèi)方法： 離差平方和法(Ward’s method)。

1.5 方法

1.5.1 重現(xiàn)性試驗(yàn)

隨機(jī)抽取W1樣品，精確稱(chēng)取1.0 mg樣品6份，與KBr按1∶50比例混合，分別壓片、測(cè)定、采集光譜數(shù)據(jù)。用OMNIC 8.2分析軟件測(cè)得相似度為99.94%，99.94%，99.72%，99.81%，99.94%，99.61%，RSD為0.14%，以前的工作表明實(shí)驗(yàn)方法的重現(xiàn)性好。

1.5.2 精密度試驗(yàn)

按照1.5.1的方法制備1份壓片，連續(xù)測(cè)量6次，采集光譜數(shù)據(jù)。測(cè)得光譜圖的相似度為99.98%，100%，100%，100%，100%，99.96%，RSD為0.017%，表明儀器的精密度高。

1.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按照1.5.1的方法制備1份壓片，每隔10 min測(cè)定一次，每次測(cè)完后放在紅外燈下，防止吸潮，測(cè)6次，采集光譜數(shù)據(jù)。測(cè)得相似度分別為99.98%，99.77%，99.99%，99.99%，99.98%，99.97%，RSD為0.01%，表明實(shí)驗(yàn)方法穩(wěn)定性好。

2 結(jié)果與討論

2.1 平均光譜圖比較

Fig.1 Averaged infrared spectra of S. davidiroots from different origins

Fig.2 Averaged infrared spectra of S. davidistems from different origins

Table 2 Wave numbers of the FTIR fingerprint spectra of the roots

注： 同一列為共有峰

Table 3 Wave numbers of the FTIR fingerprint spectra of the stems

注： 同一列為共有峰

Table 4 Wave numbers of the FTIR fingerprint spectra of the leaves

注： 同一列為共有峰

2.2 偏最小二乘判別分析(PLS-DA)

原始光譜經(jīng)預(yù)處理后導(dǎo)入SIMCA-P+10.0軟件，進(jìn)行PLS-DA分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。4(a)： 自動(dòng)平滑+自動(dòng)基線(xiàn)校正預(yù)處理，4個(gè)產(chǎn)地樣品不能很好的分開(kāi)，相互重疊在一起； 4(b)： 自動(dòng)平滑+自動(dòng)基線(xiàn)校正+一階求導(dǎo)預(yù)處理，相同居群聚在一起，不同居群分開(kāi)； 4(c)： 經(jīng)過(guò)自動(dòng)平滑+自動(dòng)基線(xiàn)校正+二階求導(dǎo)預(yù)處理，分類(lèi)效果最好，即根的產(chǎn)地鑒別效果明顯優(yōu)于莖與葉。二階求導(dǎo)能有效地消除了其他背景干擾，增強(qiáng)樣品之間的特異性[19]，二階求導(dǎo)處理后的PLS-DA三維得分圖，可以準(zhǔn)確鑒別樣品產(chǎn)地。

2.3 系統(tǒng)聚類(lèi)分析

系統(tǒng)聚類(lèi)分析的基本思想是根據(jù)一定的標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)相應(yīng)的方法，把相似元素歸結(jié)為一類(lèi)[20]。系統(tǒng)聚類(lèi)分析鑒別4個(gè)產(chǎn)地的川東獐牙菜，朱砂村居群(J1，1-20)，永定區(qū)居群(M1，21-40)，長(zhǎng)溪村居群(W1，41-60)，鹿角鎮(zhèn)居群(W2，61-70)，以距離3劃分，結(jié)果顯示相同部位不同處理方式的分類(lèi)效果有差異： 根(自動(dòng)平滑+自動(dòng)基線(xiàn)校正+二階求導(dǎo)>自動(dòng)平滑+自動(dòng)基線(xiàn)校正+一階求導(dǎo)>自動(dòng)平滑+自動(dòng)基線(xiàn)校正)，莖(自動(dòng)平滑+自動(dòng)基線(xiàn)校正+一階求導(dǎo)>自動(dòng)平滑+自動(dòng)基線(xiàn)校正>自動(dòng)平滑+自動(dòng)基線(xiàn)校正+二階求導(dǎo))，葉(自動(dòng)平滑+自動(dòng)基線(xiàn)校正+二階求導(dǎo)>自動(dòng)平滑+自動(dòng)基線(xiàn)校正+一階求導(dǎo)>自動(dòng)平滑+自動(dòng)基線(xiàn)校正)。圖5為不同部位系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)狀圖比較，d1為根(自動(dòng)平滑+自動(dòng)基線(xiàn)校正+二階求導(dǎo))，d2為莖(自動(dòng)平滑+自動(dòng)基線(xiàn)校正+一階求導(dǎo))，d3為葉(自動(dòng)平滑+自動(dòng)基線(xiàn)校正+二階求導(dǎo))。在樹(shù)狀圖中將每一類(lèi)標(biāo)記，注明不同產(chǎn)地樣品個(gè)數(shù)，由圖5得知，d1誤判個(gè)數(shù)為12，正確率為83%； d2誤判個(gè)數(shù)為36，正確率為49%； d3誤判個(gè)數(shù)為21，正確率為70%。不同產(chǎn)地之間以根的紅外光譜數(shù)據(jù)作為產(chǎn)地鑒別的依據(jù)，效果最好。

Fig.4 3D score scatter plot

Fig.5 Comparison of the best dendrogram of different parts

3 結(jié) 論

使用OMNIC 8.0軟件比較4個(gè)不同產(chǎn)地川東獐牙菜不同部位平均光譜圖，結(jié)果顯示相同產(chǎn)地不同部位的紅外光譜特征峰有差異，可能是因?yàn)椴煌课换瘜W(xué)物質(zhì)成分和含量不同，4個(gè)產(chǎn)地川東獐牙菜根之間，莖之間的吸收峰不同，這可能與不同產(chǎn)地環(huán)境因素和植株本身遺傳因素有關(guān)； 自動(dòng)平滑+自動(dòng)基線(xiàn)校正+二階求導(dǎo)處理后的PLS-DA三維得分圖將4個(gè)不同產(chǎn)地川東獐牙菜分開(kāi)，根的分類(lèi)效果比莖、葉的效果好，表明不同部位之間分類(lèi)效果有差異，產(chǎn)地鑒別效果與處理方式有關(guān)； HCA樹(shù)狀圖分類(lèi)結(jié)果顯示根的正確率為83%，莖的正確率為49%，葉的正確率為70%，表明根的分類(lèi)效果最好，莖的分類(lèi)效果最差。因此FTIR與PLS-DA和HCA方法結(jié)合對(duì)川東獐牙菜進(jìn)行產(chǎn)地鑒別的方法可行。

[1] Editorial Committee of Flora China Nica of the Academy of Sciences of China(中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì)). Flora of China(中國(guó)植物志). Beijing: Science Press(北京: 科學(xué)出版社), 1988. 371.

[2] Li L, Huang H Y. Bulletin of Botanical Reseach, 2006, 24(6): 452.

[3] Sirish Kumar I, Paul B N, Asthana R, et al. ImmunoPharmacology and Immunotoxicology, 2003, 25(4): 573.

[4] HUANG Lu-qi, GUO Lan-ping(黃璐琦, 郭蘭萍). China Journal of Chinese Materia Medica(中國(guó)中藥雜志), 2007, 32(04): 277.

[5] Abdulmanea K, Prokudina E A, Lanková P, et al. Biochemical Systematics and Ecology, 2012, 45: 237.

[6] Cheng H, Qin Z H, Guo X F, et al. Food Research International, 2013, 51(2): 813.

[7] Zhang C, Su J. Acta Pharmaceutica Sinica B, 2014, 4(3): 182.

[8] FENG Shan-shan, ZHENG Si-hao, LI Ya-kang, et al(馮杉杉, 鄭司浩, 李亞康, 等). Acta Pharmaceutica Sinica(藥學(xué)學(xué)報(bào)), 2014, 49(2): 260.

[9] Tarantilis P A, Troianou V E, Pappas C S, et al. Food Chemistry, 2008, 111(1): 192.

[10] Zhao Yanli, Zhang Ji, Yuan Tianjun, et al. Plos One, 2014, 9(2): e89100.

[11] Li J R, Sun S Q, Wang X X, et al. Journal of Molecular Structure, 2014, 1069: 229.

[12] Fan Q M, Chen C Y, Lin Y P, et al. Journal of Molecular Structure, 2013, 1051: 66.

[13] Negi J S. Natural Product Research, 2012, 26(1): 72.

[14] Wang Y L, Xiao Z Q, Liu S, et al. Journal of Ethnopharmacology, 2013, 150(2): 536.

[15] Wan L S, Chen C P, Xiao Z Q, et al. Journal of Ethnopharmacology, 2013, 147(3): 622.

[16] Pandey D K, Basu S, Jha T B. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 2012, 2(3): S1450.

[17] Tao H, Jing X, Lina Y, et al. American Journal of Plant Sciences, 2012, 3(7): 904.

[18] Gok S, Severcan M, Goormaghtigh E, et al. Food Chemistry, 2014.

[19] NI Zhen, HU Chang-qin, FENG Fang(尼 珍, 胡昌勤, 馮 芳). Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis(藥物分析雜志), 2008, 28(5): 824.

[20] Kniggendorf A K, Gaul T W, Meinhardt-Wollweber M. Applied Spectroscopy, 2011, 65(2): 165.

*Corresponding authors

Analysis and Discrimination of the Medicinal PlantsSwertiaDavidiFranch Based on Infrared Spectroscopy

DI Zhun1, 2, ZHAO Yan-li2, ZUO Zhi-tian2, LONG Hua1, ZHANG Xue3, WANG Yuan-zhong2*, LI Li1*

1. Resources and Environmental Sciences, Jishou University, Jishou 416000, China 2. Institute of Medicinal Plants, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kuming 650200, China 3. Yunnan Technician College, Anning 650300, China

Fourier transform infrared spectroscopy combined with partial least squares discriminate analysis (PLS-DA) and hierarchical cluster analysis (HCA) were used to rapidly discriminate theSwertiadavidiFranch which collected from different origins. The original infrared spectra data of different parts of all the 70 samples which collected from four different regions were preprocessed by automatic calibration, automatic smoothing, the first derivative and the second derivative. Then the processed data were imported into OMNIC 8.2 and the absorption peaks were compared; PLS-DA was performed by SIMCA-P+10.0 and the effect of discrimination of different origins was compared by 3D score plot of the first three principal components; the infrared spectral data were imported into SPSS 19.0 for HCA to compare classification results of different parts by the dendrogram. The results showed that: (1) There were differences among the spectra of the roots of different origins in the spectral peaks in 1 739, 1 647, 1 614, 1 503, 1 271, 1 243, 1 072 cm-1. The spectra of the stems of different origins showed differentiation in the wavelength in 1 503, 1 270, 1 246 cm-1; (2) The characteristic peaks of different parts of the same origin were different; (3) PLS-DA indicated that the data which were processed by automatic correction, automatic smoothing and second derivative have showed the best classification. In addition, the discrimination of roots which collected from different origins could be the best; (4) Tree diagram of HCA showed that the accuracy rate of cluster in roots, stems and leaves were 83%, 56%, and 70%, respectively. In conclusion: FTIR combined with PLS-DA and HCA can rapidly and accurately differentiate S. davidi that collected from different origins, the origin discrimination effect of different parts was clearly different that the classification of roots is the best, the second derivative could enhance the specificity of the samples, the classification in 3D score plot could be visualized and obvious.

Infrared spectroscopy; Origin discrimination;SwertiadavidiFranch; Hierarchical cluster analysis; Partial least squares discriminant analysis

Sep. 28, 2014; accepted Jan. 18, 2015)

2014-09-28，

2015-01-18

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31260102, 81260608)資助

狄 準(zhǔn)，1989年生，吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院碩士研究生 e-mail： dizhun@hotmail.com *通訊聯(lián)系人 e-mail: yzwang1981@126.com; lilyjsu@126.com

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)02-0388-06