王西閣 張曉敏 趙雪蓮 周玉潔 任瑞芳

急性淋巴細(xì)胞白血病患兒外周血IL-17、IL-35及T淋巴細(xì)胞亞群的變化及意義

王西閣 張曉敏 趙雪蓮 周玉潔 任瑞芳

目的 本研究通過(guò)檢測(cè)急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)患兒外周血中IL-17、IL-35水平及T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)，探討其在ALL發(fā)病中的作用。方法 選擇141例ALL患兒，其中初診76例(初診組)、治療后完全緩解65例(緩解組)，另選45例健康兒童為對(duì)照組。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組患兒

CD 3+T淋巴細(xì)胞、CD 4+T淋巴細(xì)胞、CD 8+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)IL-17、IL-35的水平。結(jié)果 IL-17的水平：初診組(8.66±0.95)pg/ mL和緩解組(14.86±1.77)pg/mL均低于對(duì)照組(22.85±1.84)pg/mL(P<0.05)；IL-35的水平：初診組(164.72±8.99)pg/mL和緩解組(125.63±8.41) pg/mL均高于對(duì)照組(69.07±3.23)pg/mL(P<0.05)；CD 3+T淋巴細(xì)胞、CD 4+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)水平：初診組［(60.75±3.16)%、（30.00±2.30）%］和緩解組［（67.31±2.94）%、（34.51±2.44）%］均低于對(duì)照組［（69.53±4.12）%、（38.18±2.39）%］(P<0.05)；CD 8+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)水平：初診租（33.32±3.01）%和緩解組（29.54±2.70）%高于對(duì)照組(25.87±2.01%)(P<0.05)；初診組與緩解組之間的比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CD 4+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)水平與IL-17的水平呈正相關(guān)(r=0.678,P<0.01)，與IL-35的水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.688,P<0.01)。結(jié)論 ALL患兒存在不同程度的免疫異常，外周血中IL-17的低表達(dá)、IL-35的高表達(dá)，可能在ALL的發(fā)病中起重要作用。

急性淋巴細(xì)胞白血病；IL-17；IL-35；T淋巴細(xì)胞亞群；兒童

急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)是指由未分化或分化程度較低的淋巴細(xì)胞在骨髓、淋巴結(jié)及脾臟等造血器官內(nèi)無(wú)限增殖所致的血液系統(tǒng)惡性腫瘤[1]，為兒童最常見(jiàn)的惡性腫瘤。研究顯示[2]，惡性腫瘤患者普遍存在免疫功能下降，主要體現(xiàn)在細(xì)胞免疫功能方面，且腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與T淋巴細(xì)胞亞群有密切聯(lián)系。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)和輔助性T細(xì)胞17(Th 17)是新近發(fā)現(xiàn)的CD 4+T淋巴細(xì)胞亞群。Th 17細(xì)胞主要通過(guò)白介素17(interleukin-17，IL-17)來(lái)發(fā)揮作用。白介素35(interleukin-35，IL-35)主要由Tregs分泌，是其發(fā)揮免疫負(fù)調(diào)控的主要細(xì)胞因子之一。本文將初步探討IL-17、IL-35 及T淋巴細(xì)胞亞群在ALL發(fā)病機(jī)制中的作用及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2014年1月～2015年4月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院及第一附屬醫(yī)院就診的ALL患兒141例，其中初步確診但未治療的ALL患兒76例為初診組，男46例，女30例，年齡1～14歲，中位年齡6歲；已經(jīng)確診并經(jīng)系統(tǒng)化療達(dá)到完全緩解的ALL患兒65例為緩解組，男39例，女26例，年齡2～13歲，中位年齡6歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)及化療方案均依據(jù)《小兒急性淋巴細(xì)胞白血病診療建議》[3]。另選同期本院兒童保健中心體檢正常的兒童45例作為對(duì)照組，男27例，女18例，年齡3～15歲，中位年齡7歲。對(duì)照組患兒性別、年齡與初診組、緩解組ALL患兒比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究獲得本院人體試驗(yàn)委員會(huì)批準(zhǔn)及家屬的知情同意。

完全緩解的標(biāo)準(zhǔn)為[4]：（1）臨床無(wú)白血病細(xì)胞浸潤(rùn)所致的癥狀和體征，生活正?；蚪咏！＃?）血象：Hb≥90 g/L，中性粒細(xì)胞絕對(duì)值≥1.5×109/L，血小板≥100×109/L。外周血白細(xì)胞分類中無(wú)白血病細(xì)胞。（3）骨髓象：原始淋巴細(xì)胞＋幼稚淋巴細(xì)胞≤5%，紅細(xì)胞及巨核細(xì)胞系正常。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本的采集 初診組及緩解組患兒均于入院未治療前抽取外周靜脈血5mL，對(duì)照組為隨機(jī)抽取外周靜脈血5mL，其中3mL用EDTA管抗凝，6 h內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)分析，檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群；2 mL置于普通干燥管中，2500 r/min離心10 min，分離血清后，置于-80℃保存。

1.2.2 主要試劑及儀器 C D 4F I T C/C D 8P E/ CD 3PerCP試劑及紅細(xì)胞裂解液均購(gòu)自美國(guó)BD公司；IL-17、IL-35的ELISA試劑盒均購(gòu)自美國(guó)R&D公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)Bio-rad，洗板機(jī)購(gòu)自美國(guó)熱電thermo；FACSCalibur型流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD 3+T淋巴細(xì)胞、CD 4+T淋巴細(xì)胞、CD 8+T淋巴細(xì)胞 先將流式管進(jìn)行編號(hào)，然后將標(biāo)本反復(fù)顛倒混勻；先取5μL CD 4FITC/CD 8PE/CD 3PerCP試劑加入到流式管底部，再取20 μL EDTA抗凝全血加入到流式管中，低速震蕩混勻，室溫避光15 min；加入200 μL 1×紅細(xì)胞裂解液，室溫避光10 min后上機(jī)，采用FACSComp軟件分析檢測(cè)。

1.2.4 細(xì)胞因子測(cè)定 外周血IL-17、IL-35水平的檢測(cè)采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度值，以試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算IL-17、IL-35水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。計(jì)量資料以“±s”表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，變量間的相關(guān)性分析采用Pearson積矩相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血IL-17、IL-35的水平 初診組和緩解組IL-17的水平均低于對(duì)照組(P<0.05)，且初診組低于緩解組(P<0.05)；初診組和緩解組IL-35的水平均高于對(duì)照組(P<0.05)，且初診組高于緩解組(P<0.05)；各組間的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組外周血IL-17、IL-35水平的比較(x±s,pg/mL)

2.2 T淋巴細(xì)胞亞群的水平 初診組和緩解組CD 3+T淋巴細(xì)胞、CD 4+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)水平均低于對(duì)照組(P<0.05)，CD 8+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05)，初診組與緩解組之間的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組外周血T淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定結(jié)果的比較±s,%)

表2 各組外周血T淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定結(jié)果的比較±s,%)

注:與對(duì)照組比較，aP<0.05；與緩解組比較，bP<0.05

組別例數(shù)CD 3+TCD 4+TCD 8+T對(duì)照組4569.53±4.1238.18±2.3925.87±2.01緩解組6567.31±2.94a34.51±2.44a29.54±2.70a初診組7660.75±3.16ab30.00±2.30ab33.32±3.01abF值117.92175.85111.88 P值＜0.01＜0.01＜0.01

2.3 相關(guān)性分析 ALL患兒外周血CD 4+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)水平與IL-17的水平呈正相關(guān)(r＝0.678,P<0.01)，與IL-35的水平呈負(fù)相關(guān)(r＝-0.688,P<0.01)。

3 討論

急性白血病(acute leukemia,AL)占所有兒童惡性腫瘤的25%～35%，根據(jù)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)分型分為急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)和急性髓細(xì)胞白血病(AML)，兒童白血病以ALL為主，占60%～70%。其發(fā)病機(jī)制包括[5]：“二次打擊”學(xué)說(shuō)（如：染色體異位形成融合基因、多基因參與的第二次打擊）、免疫因素、腫瘤干細(xì)胞等。近期的研究發(fā)現(xiàn)基因多態(tài)性也與白血病的易患性相關(guān)[6]，如葉酸代謝相關(guān)基因、細(xì)胞色素P 450和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、苯醌氧化還原酶-1等。此外，研究發(fā)現(xiàn)[7]CASP 8AP 2基因啟動(dòng)子區(qū)-1189和-1176兩個(gè)CpG位點(diǎn)的異常高甲基化可能與兒童ALL的發(fā)病相關(guān)。由于白血病的生物多樣性，其病因及發(fā)病機(jī)制也是多因素的。本文主要從免疫因素方面探索兒童ALL的發(fā)病機(jī)制。

人體成熟T淋巴細(xì)胞亞群按功能不同可分為:輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)、抑制性T淋巴細(xì)胞(Ts)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Tc)；若按表型又可以分為CD 4+T淋巴細(xì)胞和CD 8+T淋巴細(xì)胞。CD 4+T淋巴細(xì)胞主要行使Th細(xì)胞的功能，而CD 8+T淋巴細(xì)胞主要行使Tc細(xì)胞的功能，因此根據(jù)CD 4+T淋巴細(xì)胞和CD 8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量，可初步評(píng)估機(jī)體免疫狀態(tài)。研究表明，惡性血液病患者機(jī)體免疫功能失衡導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降，抗腫瘤能力減弱，T淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)可以為惡性血液病的診斷、治療及判斷預(yù)后提供依據(jù)[8]。另有研究顯示[9]細(xì)胞免疫與白血病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸有關(guān)。本研究結(jié)果回示：ALL患兒初診組及緩解組外周血CD 3+T淋巴細(xì)胞、CD 4+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)水平均低于對(duì)照組(P<0.05)，而CD 8+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05)，初診組與緩解組之間的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示ALL患兒存在不同程度的免疫異常，與文獻(xiàn)報(bào)告一致。

細(xì)胞因子介導(dǎo)的細(xì)胞免疫是機(jī)體抗腫瘤免疫的主要方式。大量研究表明細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡是腫瘤細(xì)胞能夠免疫逃逸的機(jī)制之一，與兒童白血病相關(guān)的細(xì)胞因子有干擾素調(diào)節(jié)因子-3(IRF-3)、腫瘤壞死因子a(TNF-a)、干擾素(IFN)和Toll樣受體(TLR)等[6]。IL-17是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，主要由Th 17細(xì)胞產(chǎn)生，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生多種細(xì)胞因子、趨化因子、炎癥效應(yīng)物質(zhì)和抗微生物蛋白，從而參與多種自身免疫性疾病和感染炎癥[10]。近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)IL-17與腫瘤的關(guān)系密切。一方面IL-17可以通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤的血管生成等來(lái)發(fā)揮促瘤效應(yīng)；另一方面它又可以通過(guò)增強(qiáng)NK細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性來(lái)發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[11]。Th 17的表達(dá)根據(jù)不同的腫瘤類型而有差異。如在肺腫瘤中發(fā)現(xiàn)IL-17有效促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，對(duì)肺癌調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫反應(yīng)具有抑制作用[12]。在白血病患兒中的研究中發(fā)現(xiàn)[13]Th 17的表達(dá)低于對(duì)照組，且未緩解組更低。分析其原因可能為：(1)白血病細(xì)胞可能分泌一些抑制Th 17功能的因子，未緩解時(shí)體內(nèi)腫瘤負(fù)荷高，抑制作用更強(qiáng)。(2)白血病患者由于經(jīng)過(guò)化療或放療，機(jī)體免疫系統(tǒng)遭到破壞，因此，初始T細(xì)胞數(shù)量減少，其所分化的Th 17當(dāng)然更少。(3)機(jī)體還存在一些抑制Th 17細(xì)胞的細(xì)胞亞群，如Th 1和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等，當(dāng)白血病經(jīng)過(guò)化療達(dá)到緩解時(shí)，雖然Th 17的功能有所恢復(fù)，但這些抑制Th 17的細(xì)胞功能也有所恢復(fù)，綜合作用的結(jié)果就是抵消了Th 17數(shù)量和功能的提高[14]。本研究結(jié)果回示：ALL患兒初診組及緩解組外周血IL-17的水平均低于對(duì)照組(P<0.05)，提示IL-17可能參與了ALL患兒的發(fā)生發(fā)展。

IL-35屬于IL-12家族，是一種由p 35和EBI 3亞基組成的異源二聚體分子,主要來(lái)源于Tregs并為其發(fā)揮最大免疫抑制功能所必需，從而在誘導(dǎo)和維持機(jī)體免疫耐受過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[15-16]。目前研究認(rèn)為IL-35可能廣泛參與了體內(nèi)的免疫應(yīng)答過(guò)程，不僅在細(xì)胞內(nèi)感染及炎癥過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，而且與自身免疫病和腫瘤等多種臨床疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，成為細(xì)胞因子研究的新熱點(diǎn)[17]。研究發(fā)現(xiàn)[18]，IL-35在AML患者體內(nèi)高表達(dá)，分析原因可能為：IL-35通過(guò)抑制效應(yīng)性T細(xì)胞(effector T cells,Teffs)和促進(jìn)Tregs/iTr 35(IL-35誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞)的表達(dá)和功能以及直接促進(jìn)AML細(xì)胞的增殖和抑制AML細(xì)胞的凋亡來(lái)誘導(dǎo)AML細(xì)胞的免疫逃逸，從而在介導(dǎo)AML的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。但在ALL中的發(fā)病機(jī)制目前不完全明確。本研究發(fā)現(xiàn)：ALL患兒初診組及緩解組外周血IL-35的水平均高于對(duì)照組(P<0.05)，提示IL-35可能也參與了ALL患兒的發(fā)病過(guò)程。

綜上所述，本研究表明，ALL患兒存在不同程度的免疫異常，外周血中IL-17的表達(dá)水平降低、IL-35的表達(dá)水平升高，且CD 4+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)水平與IL-17的水平呈正相關(guān)，與IL-35的水平呈負(fù)相關(guān)，提示免疫異常、IL-17的低表達(dá)及IL-35的高表達(dá)可能參與了ALL的發(fā)生發(fā)展，但兩兩之間是否具有一定的因果關(guān)系，需要更加深入的研究。

[1] Kulkarni K,Marwaha RK.Pattern and determinants of central nervous system relapse in childhood acute lymphoblastic leukemia in a resourcelimited setting[J].Indian J Med Paediatr Oncol,2013,34(1):48-49.

[2] Des Guetz G,Uzzan B,Nicolas P,et al.Microvessel density and VEGF expression are prognostic factors in colorectal cancer.Meta-analysis of the literature[J].Br J Cancer,2006,94(12):1823-1832.

[3] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)血液學(xué)組.小兒急性淋巴細(xì)胞白血病診療建議(第三次修訂草案)[J].中華兒科雜志，2006，44(5):392-395．

[4] 楊天楹.急性白血病療效標(biāo)準(zhǔn)[A]//張之南，沈悌.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[M].第3版.北京：科學(xué)出版社，2007:131-132.

[5] 何志旭，許威.兒童急性白血病發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展[J].實(shí)用兒科臨床雜志，2011，26(15):1149-1152.

[6] 鄒黎，周國(guó)平.兒童急性白血病發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J].國(guó)際兒科雜志，2010，37(4):368-371.

[7] 劉飛飛，劉瀟，王凱玲，等.兒童急性淋巴細(xì)胞白血病 CASP 8AP 2 基因啟動(dòng)子甲基化水平及其臨床意義[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2015，23(1):6-11.

[8] 甄禎，葉芳，李國(guó)霞，等.惡性血液病患者T淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)分析[J].中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2014，21(9):101-102．

[9] 高然，李艷.急性白血病患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)的臨床意義[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2008，11(2):115-116.

[10] Onishi RM,Gaffen SL.Interleukin-17 and its target genes:mechanisms of interleukin-17 function in disease[J].Immunology,2010,129(3):311-321.

[11] 錢鑫，杜嬌，金陽(yáng).IL-17與腫瘤的關(guān)系[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志，2012，28(8):760-765.

[12] Kirshberg S,Izhar U,Amir G,et al.Involvement of CCR 6/CCL 20/IL-17 axis in NSCLC disease progression[J].PLoS One,2011,6(9):e 24856.

[13] 吳小艷，金潤(rùn)銘，余慧，等.兒童急性白血病外周血Thl 7細(xì)胞表達(dá)及其臨床意義分析[J].中國(guó)實(shí)用兒科雜志，2010，25(9):702-704．

[14] Afzali B,Lombardi G,Lechler RI,et al.The role of T helper 17(Th 17)and regulatory T cells(Treg)in human organ transplantation and autoimmune disease［J].Clin Exp Immunol,2007,148(1):32-46.

[15] Collison LW,Workman CJ,Kuo TT,et al.The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function[J]. Nature,2007,450(7169):566-569.

[16] Niedbala W,Wei XQ,Cai B,et al.IL-35 is a novel cytokine with therapeutic effects against collagen-induced arthritis through the expansion of regulatory T cells and suppression of Thl 7 cells[J].Eur J Immunol,2007,37(11):3021-3029.

[17] 陳爽，鞠曉紅，鄭文彧，等.IL-35與人類疾病關(guān)系的研究進(jìn)展[J].免疫學(xué)雜志，2014，30(7):645-648.

[18] 陶千山.IL-35誘導(dǎo)急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞免疫逃逸的作用及機(jī)制[D].安徽醫(yī)科大學(xué)，2014.

Objective The study was to detect the levels of IL-17 and IL-35 and the expression of T lymphocyte subsets in peripheral blood, to explore its role in the pathogenesis of acute lymphoblastic leukemia (ALL). Methods One hundred and forty-one cases with ALL were divided into two groups: Group A (n=76) who were confirmedly diagnosed but not yet treated; Group B (n=65) who were confirmedly diagnosed and treated systematically with chemotherapy; and 45 healthy children were selected as the control group. Flow cytometry (FCM) was used to measure the expression of T lymphocyte subsets, and the levels of IL-17 and IL-35 were determined with enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA). Results The level of IL-17 in Group A and Group B was significantly lower than that in control group (P<0.05). On the contrary, the level of IL-35 in Group A and Group B was significantly higher than that in control group (P<0.05). The expressions of CD 3+T and CD 4+T cells in Group A and Group B were significantly lower than those in control group (P<0.05),and the CD 8+T cells level increased significantly (P<0.05), significant difference was found between Group A and Group B (P<0.05). The expression of CD 4+T cells was positively correlated with the level of IL-17 (r=0.678,P<0.01), but negatively correlated with the level of IL-35 (r=-0.688,P<0.01). Conclusion There are immune disorders of varying degrees in ALL children, and the expression of IL-17 and IL-35 in peripheral blood may paly an important role in the pathogenesis of ALL.

Acute lymphocytic leukemia; Interleukin-17; Interleukin-35; T lymphocyte subsets; Child

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.2.003

河南 450052 鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院小兒血液/腫瘤科 （王西閣 張曉敏 趙雪蓮 周玉潔 任瑞芳）