李 運， 王元忠， 楊維澤， 楊紹兵， 張金渝*， 徐福榮

1. 云南中醫(yī)學院中藥學院， 云南 昆明 650500

2. 云南省農(nóng)業(yè)科學院藥用植物研究所， 云南 昆明 650200

紅外光譜對三七及其野生近緣種親緣關系研究

李 運1, 2， 王元忠2， 楊維澤2， 楊紹兵2， 張金渝1, 2*， 徐福榮1*

1. 云南中醫(yī)學院中藥學院， 云南 昆明 650500

2. 云南省農(nóng)業(yè)科學院藥用植物研究所， 云南 昆明 650200

傅里葉變換紅外光譜； 三七； 野生近緣種； 親緣關系； 種質(zhì)資源

引 言

三七Panaxnotoginseng(Burkill) F. H. Chen ex C. Chow & W. G. Huang為五加科(Araliaceae)人參屬(Panax)植物， 主要以根入藥， 是我國特有名貴中藥。 當今社會， 心腦血管類疾病成為人類健康的第一殺手， 越來越多的人受到心腦血管類疾病的困擾。 三七具有降血壓、 保護神經(jīng)、 抗血栓、 抗動脈粥樣硬化等預防及治療心血管類疾病的作用[1]， 這使得人們對其需求量大大增加。

三七在我國藥用歷史有600多年， 種植歷史有400多年， 三七種植面積以及產(chǎn)量隨需求逐年增加， 但是三七遺傳多樣性喪失[2]、 種質(zhì)資源退化[3]使得三七在抗病性、 抗逆性方面變差， 直接導致了在三七種植過程中農(nóng)藥使用過度， 三七連作障礙嚴重化[4]等問題的出現(xiàn)。

野生近緣種(wild relative)是指與栽培植物具有近緣關系的野生物種[5]； 由于野生近緣種生存在自然環(huán)境下， 長期抵御各種生物和非生物脅迫， 在其進化過程中形成并積累了豐富的遺傳變異和有益基因資源[6]。 這些因素在改善栽培物種品質(zhì)與產(chǎn)量[7]、 豐富種質(zhì)資源方面起到十分重要的作用。 三七野生近緣種具有較強抗逆性， 與三七相比屏邊三七P.stipuleanatusC. T. Tsai & K. M. Feng幾乎不染病， 且基本對三七病害免疫[8]。 因此， 對三七及其野生近緣種進行親緣關系研究在改善三七品質(zhì)和產(chǎn)量及豐富三七種質(zhì)資源等方面具有重要意義。

在植物親緣關系研究方面， 通過植株形態(tài)特征[9]、 AFLP技術[10]、 RAPD分子鑒定[11]等方法進行分類， 繁瑣、 費時、 需要復雜設備和專業(yè)知識。 傅里葉變換紅外光譜法(FTIR)是通過化合物分子振動吸收特定波長紅外光， 得到化合物官能團、 化學鍵等信息的結(jié)構(gòu)分析方法[12]。 能夠反映化合物中豐富的化學成分信息， 具有快速簡便、 無損、 靈敏度高等特點。 結(jié)合化學計量學方法， 紅外光譜已經(jīng)被應用于中藥的產(chǎn)地鑒別[13]、 生長年限與真?zhèn)纹疯b別[14-15]等多個方面。 此外， 該方法對生物進行分類研究以及親緣關系研究具有十分成熟的理論基礎與實踐支持， 如竹類植物分類研究、 小麥屬與山羊草屬植物[16]、 微生物鑒別分類研究[17]等。

將FTIR用于三七及其3個近緣種的研究。 僅通過對比不同物種之間紅外光譜進行親緣關系研究， 主觀性較強[18]。 而化學計量學能對數(shù)據(jù)進行更加客觀地分析。 本研究使用FTIR結(jié)合主成分分析(principal component analysis, PCA)、 偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)及系統(tǒng)聚類分析(hierarchical cluster analysis, HCA)， 對三七及其4個野生近緣種進行親緣關系研究， 為三七的品種改良及種質(zhì)資源開發(fā)利用提供理論基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Frontier型傅里葉變換紅外光譜儀(配備DTGS檢測器， 掃描范圍為4 000～400 cm-1， 掃描信號累加16次， 分辨率為4 cm-1， 美國Perkin Elmer公司)； KBr(分析純， 風船化學試劑科技有限公司)； 三七總皂苷標準品panax notoginsenosides(中國藥品生物制品檢定所， 編號f)； YP-2型壓片機(山岳科學儀器有限公司)； FW-100型高速粉碎機(華鑫儀器廠)； 80目標準篩盤(道墟五四儀器廠)。

1.2 樣品制備與檢測

檢測樣品為三七及其4個野生近緣種的根； 樣品經(jīng)由云南省農(nóng)業(yè)科學院藥用植物研究所張金渝研究員鑒定， 詳見表1。 樣品在50 ℃恒溫下烘干至恒重， 粉碎過80目篩。 取樣品粉末、 三七總皂苷標準品與KBr充分混合研磨， 將研磨粉末加入模具壓成均勻薄片。 同一樣品掃描兩次， 取平均光譜， 掃描時扣除CO2和H2O的干擾。

1.3 數(shù)據(jù)處理

原始光譜通過OMNIC8.0 進行平均光譜、 自動基線校正、 平滑、 縱坐標歸一化等預處理以及二階導數(shù)處理。 使用ORIGIN8.0軟件作圖， SIMCA-P+10.0軟件進行PCA和PLS-DA， SPSS20.0軟件進行HCA。

表1 三七及其野生近緣種樣品信息

2 結(jié)果與討論

2.1 三七及其野生近緣種紅外光譜分析

2.2 三七及其野生近緣種二階導數(shù)紅外光譜分析

對紅外光譜進行二階導數(shù)處理， 可以提高譜圖的分辨率， 指示疊合的隱蔽譜峰[20]。 三七及其野生近緣種紅外光譜十分相似， 但是在指紋區(qū)1 800～500 cm-1存在一定差別； 通過二階導數(shù)處理放大三七及其野生近緣種紅外光譜的不同譜峰， 可以對不同譜圖進行區(qū)分， 從而達到區(qū)分不同物種的目的。 對人參屬樣品的二階導數(shù)光譜(圖2)指紋區(qū)進行分析可以發(fā)現(xiàn)， 784 cm-1處三七、 珠子參、 越南人參無峰； 屏邊三七峰強不明顯； 羽葉三七具有較強峰。 1 385 cm-1珠子參無峰； 三七、 屏邊三七、 越南人參峰強不明顯； 羽葉三七有較強峰。 1 800～500 cm-1波段內(nèi)， 不同物種吸收峰有較大差異， 利用這一特點， 結(jié)合化學計量學方法， 可以對三七及其野生近緣種進行親緣關系研究。

2.3 主成分分析

主成分分析是一種將多個變量通過線性變換以選出較少重要變量， 從而達到數(shù)據(jù)降維效果的多元統(tǒng)計分析方法[21]。 這種無監(jiān)督模式識別的檢測， 能夠?qū)ο蠡蛘咦兞块g的相似點進行聚合并以圖表示[22]， 是從不相關中分離相關信息的探索性方法[23]。 將經(jīng)過數(shù)據(jù)降維得到主成分信息作為新的綜合指標并作圖， 可以對數(shù)據(jù)進行直觀分析。 對三七及其野生近緣種二階導數(shù)紅外光譜1 800～500 cm-1波段進行主成分分析， 前6個主成分累計貢獻率達到81.5%， 可以代表樣品紅外光譜大部分信息。 圖3為主成分PC1， PC2， PC3組成的三維圖， 圖中同一物種聚集在一起， 部分物種個體之間有混雜。

圖1 (a): 三七及其野生近緣種平均紅外光譜； (b): 三七與三七總皂苷標準品紅外光譜

Fig.1 (a): Average infrared spectra ofP.notoginsengand its wild relatives; (b): Infrared spectra ofP.notoginsengand panax notoginsenosides

圖2 三七及其野生近緣種二階導數(shù)紅外光譜

2.4 偏最小二乘判別分析

偏最小二乘判別分析是通過測量傳感器陣列和由正確分類矢量組成的類關系矩陣提取數(shù)據(jù)并建立兩種矩陣關系模型的有監(jiān)督模式識別[24]。 是一種將二進制變量描述的類別分類變量設為Y變量， 預測變量設為X變量的偏最小二乘回歸方法[25]。 對二階導數(shù)紅外光譜1 800～500 cm-1波段進行偏最小二乘判別分析， 前6個主成分累計貢獻率達到85.5%， 可以代表樣品紅外光譜大部分信息。 圖4為主成分t1， t2， t3組成的三維圖， 圖中同一物種聚集在一起， 不同物種之間能清晰地區(qū)分開。

圖3 主成分分析3D得分圖

圖4 偏最小二乘判別3D得分圖

2.5 系統(tǒng)聚類與結(jié)果分析

系統(tǒng)聚類分析又稱層次聚類分析， 使用距離算法和分類算法確定樣品光譜數(shù)據(jù)的相關程度并根據(jù)研究樣品間相關程度大小進行類別聚合的多元統(tǒng)計分析方法[26]。 結(jié)果通過樹狀圖顯示出來， 具有簡潔、 直觀的優(yōu)點。

通過對比主成分分析與偏最小二乘判別分析3D得分圖， 發(fā)現(xiàn)偏最小二乘判別分析對不同物種區(qū)分效果優(yōu)于主成分分析。 把偏最小二乘判別分析得到的前6個主成分數(shù)據(jù)， 作為三七及其野生近緣種紅外光譜提取數(shù)據(jù)代入SPSS20.0軟件進行系統(tǒng)聚類分析[27]。 利用ward聯(lián)接的方法， 以平方Euclidean距離為度量標準處理數(shù)據(jù)， 得到了三七及其野生近緣種親緣關系樹狀圖(圖5)。

由圖5可知不同物種在不同的距離聚成一類， 絕大多數(shù)三七個體在距離系數(shù)為1處聚為一類， 全部珠子參個體在距離系數(shù)為1處聚為一類， 絕大多數(shù)越南人參個體在距離系數(shù)為1處聚為一類， 絕大多數(shù)屏邊三七個體在距離系數(shù)為4處

圖5 系統(tǒng)聚類親緣關系圖

聚為一類， 全部羽葉三七個體在距離系數(shù)為3處聚為一類。 在聚類樹狀圖中三七、 屏邊三七、 越南人參有4個個體聚類錯誤， 這可能是由于同一物種生存環(huán)境不同而造成的化學成分積累差異導致的。 在物種層面， 三七與越南人參在距離系數(shù)為6處聚為一類， 珠子參與越南人參、 三七在距離系數(shù)為7處聚為一類， 屏邊三七與三七、 越南人參、 珠子參在距離系數(shù)為10處聚為一類。 不同物種之間聚類結(jié)果顯示， 三七與越南人參、 珠子參親緣關系較近， 與屏邊三七、 羽葉三七親緣關系較遠。 與三七親緣關系由近到遠為： 越南人參、 珠子參、 屏邊三七、 羽葉三七。 這一結(jié)果與張金渝等[28]利用EST-SSR技術研究三七與珠子參及屏邊三七親緣關系結(jié)果相一致。

3 結(jié) 論

采用傅里葉變換紅外光譜法測定三七及其野生近緣種(珠子參、 屏邊三七、 越南人參、 羽葉三七)、 三七總皂苷標準品的紅外光譜。 結(jié)果顯示， 三七與三七總皂苷標準品紅外光譜在3 400， 2 930， 1 635， 1 385， 1 075， 927 cm-1等附近存在多個共有峰， 推測三七共有峰強度可能與皂苷含量有關。 五個物種原始紅外光譜較為相似， 通過對原始圖譜進行自動基線校正、 平滑、 縱坐標歸一化、 二階導數(shù)預處理后發(fā)現(xiàn)， 在指紋區(qū)(1 800～500 cm-1)不同物種紅外光譜具有差異， 物種之間吸收峰峰數(shù)、 峰強、 峰型差異較大。 對預處理紅外光譜數(shù)據(jù)進行主成分分析以及偏最小二乘判別分析發(fā)現(xiàn)， 偏最小二乘判別分析對不同物種的區(qū)分效果優(yōu)于主成分分析， 偏最小二乘判別分析前6個主成分累計貢獻率達到85.5%， 可以代表樣品紅外光譜大部分信息。 將前6個主成分數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)聚類分析， 得到三七與其野生近緣種親緣關系由近到遠為： 越南人參、 珠子參、 屏邊三七、 羽葉三七。 說明越南人參、 珠子參與三七親緣關系較近， 可以在三七種質(zhì)資源開發(fā)利用研究中優(yōu)先考慮。 傅里葉變換紅外光譜結(jié)合化學計量學方法可以有效地對三七及其野生近緣種進行親緣關系研究； 為三七的品種改良及種質(zhì)資源開發(fā)利用提供研究基礎， 同時為藥用植物種質(zhì)資源相關領域提供借鑒和參考。

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Study on the Genetic Relationship ofPanaxNotoginsengand Its Wild Relatives Based on Fourier Translation Infrared Spectroscopy

LI Yun1, 2, WANG Yuan-zhong2, YANG Wei-ze2, YANG Shao-bing2, ZHANG Jin-yu1, 2*, XU Fu-rong1*

1. College of Traditional Chinese Medicine, Yunnan University of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650500, China

2. Institute of Medicinal Plants, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650200, China

Fourier transform infrared spectroscopy;Panaxnotoginseng; Wild relatives; Genetic relationship; Germplasm resources

May 17, 2015; accepted Sep. 8, 2015)

2015-05-17，

2015-09-08

國家自然科學基金項目(81260610， 81460581)資助

李 運， 1993年生， 云南中醫(yī)學院中藥學院碩士研究生 e-mail: liyunsci@163.com *通訊聯(lián)系人 e-mail: jyzhang2008@126.com； xfrong99@163.com

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)08-2420-05

*Corresponding authors