曾穎

【摘 要】本文針對(duì)用于DNA擴(kuò)增的PCR儀其試樣環(huán)境溫度的測(cè)量裝置及測(cè)溫位置進(jìn)行研究，提出使用薄膜鉑電阻對(duì)PCR儀進(jìn)行快速準(zhǔn)確測(cè)溫，并在實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的對(duì)比分析后證明將測(cè)溫敏感點(diǎn)放置在試管的液體中的位置最滿足DNA實(shí)驗(yàn)需要。

【關(guān)鍵詞】PCR儀；溫度；測(cè)溫位置；薄膜鉑電阻

0 引言

PCR技術(shù)是一項(xiàng)在短時(shí)間內(nèi)體外大量擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)[1]，PCR儀的工作原理在于為DNA實(shí)驗(yàn)制造不同的溫度環(huán)境，使DNA變性、退火、引物鏈延伸，其實(shí)質(zhì)為一臺(tái)精密溫度控制儀。其溫度的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性、波動(dòng)性直接影響DNA反應(yīng)3個(gè)階段過程中基因片段的擴(kuò)增質(zhì)量。但是目前國(guó)內(nèi)PCR儀器的校準(zhǔn)規(guī)程里并未對(duì)溫度校準(zhǔn)裝置的響應(yīng)速度及溫度測(cè)量位置進(jìn)行詳細(xì)闡述，為此本文針對(duì)PCR儀試樣環(huán)境溫度的測(cè)量裝置及測(cè)溫位置進(jìn)行探討。

1 PCR儀簡(jiǎn)介

1.1 PCR儀簡(jiǎn)介

目前市面上PCR儀的主流方向?yàn)榘雽?dǎo)體式PCR，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示：在快速導(dǎo)熱金屬質(zhì)地的基座上設(shè)有多個(gè)試管孔，并由下方的半導(dǎo)體片進(jìn)行加熱制冷控溫。

圖1 半導(dǎo)體式PCR儀內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖

1.2 PCR儀校準(zhǔn)用溫度傳感器

PCR儀使用的基座按孔數(shù)分有48孔、60孔、96孔，按孔的大小也分為0.2ml、0.5ml等。根據(jù)PCR儀的特殊結(jié)構(gòu)，若采用一般鉑電阻的形狀及大小無法與基座完全接觸，且粗大的鉑電阻數(shù)據(jù)線使得在校準(zhǔn)過程中帶閉蓋結(jié)構(gòu)的PCR儀頂蓋無法閉合，加強(qiáng)了空氣對(duì)流，破壞了基座溫度場(chǎng)分布，影響校準(zhǔn)結(jié)果。

目前市面上主流的國(guó)外PCR溫度檢測(cè)裝置其測(cè)量傳感器使用固定測(cè)點(diǎn)間距及探頭大小的檢測(cè)系統(tǒng)，其普適性低，不適用于檢測(cè)對(duì)象具有多樣性的計(jì)量檢測(cè)機(jī)構(gòu)。此外，以DRIFTCON的PCR實(shí)時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)為例，其溫度探頭（如圖2所示）雖能和基座試管孔完美貼合，但尺寸較大直接影響其熱容值，導(dǎo)致熱響應(yīng)速度減慢，不能滿足快速檢測(cè)的需求，在校準(zhǔn)PCR儀升降溫速率時(shí)偏差較大。

（1） （2）

圖2 BIOplastics的溫度傳感器圖

2 溫度測(cè)量

2.1 標(biāo)準(zhǔn)器裝置

1）溫度采集

利用本院自主研發(fā)的Vtest-1101溫濕度試驗(yàn)設(shè)備自動(dòng)檢定系統(tǒng)的18CH溫度數(shù)據(jù)采集器（如圖3所示），對(duì)溫度數(shù)據(jù)進(jìn)行自動(dòng)快速采集。

圖3 溫度數(shù)據(jù)采集器圖

2）薄膜鉑電阻

為了滿足溫度測(cè)量快速響應(yīng)且準(zhǔn)確可靠的測(cè)量需求，本文采用厚1mm、熱觸點(diǎn)面積1mm2的薄膜鉑電阻Pt100，其具有熱容小、熱反應(yīng)時(shí)間短、在（-40～200）℃范圍內(nèi)線性準(zhǔn)確測(cè)溫的特點(diǎn)，并能較好伸入PCR儀試管孔中，而不影響其基座的溫度場(chǎng)。為了防止薄膜鉑電阻遇水靜電等一系列干擾，將其表面及引線涂上有較高的機(jī)械強(qiáng)度且防水耐油的漆包線漆，進(jìn)而提高和穩(wěn)定鉑電阻引線的性能，其實(shí)物圖如圖4所示。

圖4 薄膜鉑電阻實(shí)物圖

2.2 溫度測(cè)量方法

1）溫度測(cè)量方法1

為了讓薄膜鉑電阻更好的與試管孔壁面貼合，在試管孔內(nèi)壁涂上一層具有高導(dǎo)熱率的導(dǎo)熱硅脂，并將薄膜鉑電阻深入試管與基座之間，利用試管往下的力使薄膜鉑電阻熱觸點(diǎn)面貼緊孔壁，最后連接采集器及上位機(jī)進(jìn)行孔壁溫度的測(cè)量。薄膜鉑電阻測(cè)點(diǎn)放置位置如圖5所示。

圖5 方法1鉑電阻測(cè)溫位置示意圖

2）溫度測(cè)量方法2

為了防止液體在試驗(yàn)溫度內(nèi)沸騰時(shí)產(chǎn)生氣泡，并附著溫度傳感器進(jìn)而帶來測(cè)量誤差。在試管內(nèi)加入2/3試管容積高傳熱效率、高沸點(diǎn)的導(dǎo)熱油，然后將薄膜鉑電阻伸入1/2液體深度，最后將其連接采集器及上位機(jī)進(jìn)行試管中液體溫度的測(cè)量。薄膜鉑電阻測(cè)點(diǎn)放置位置如圖6所示。

圖6 方法2鉑電阻測(cè)溫位置示意圖

PCR儀的溫度偏差、均勻度、波動(dòng)度分別表征試管孔的實(shí)際溫度的差值、各試管實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性及實(shí)驗(yàn)成功率。為了對(duì)比兩種測(cè)量方法，分別對(duì)Applied Biosysterms 9700型號(hào)的一臺(tái)PCR儀進(jìn)行試驗(yàn)測(cè)試，設(shè)定儀器溫度95.0℃恒溫。并取圖7中5個(gè)位置的試管孔進(jìn)行測(cè)溫，待溫度示值穩(wěn)定后進(jìn)行溫度數(shù)值采樣，并對(duì)其溫度偏差、均勻度、波動(dòng)度進(jìn)行分析，兩種測(cè)量方法試驗(yàn)數(shù)據(jù)如下：

圖7 96試管孔測(cè)溫點(diǎn)

a）溫度測(cè)量方法1（表1）：（℃）

表1

從以上數(shù)據(jù)分析可以看出基板整個(gè)空間自左而右側(cè)溫度呈現(xiàn)由高到低的梯度，溫度偏差△Td：+0.20℃，溫度均勻度△Tu：0.47℃，溫度波動(dòng)度△Tv：±0.15℃。

b）溫度測(cè)量方法2（表2）：（℃）

表2

同樣從以上數(shù)據(jù)分析可以看出，溫度偏差△Td：-0.76℃，溫度均勻度△Tu：0.54℃，溫度波動(dòng)度△Tv：±0.02℃。

對(duì)比兩種PCR儀測(cè)溫的方法，兩種方法所測(cè)結(jié)果中方法2的溫度偏差較小，并略小于顯示溫度；方法2的波動(dòng)度也小于方法1，均勻性兩種方法相差不多。方法1實(shí)測(cè)溫度實(shí)質(zhì)為儀器基板孔壁溫度，而方法2實(shí)測(cè)溫度為試管內(nèi)DNA實(shí)驗(yàn)時(shí)的液體環(huán)境溫度。在進(jìn)行PCR試驗(yàn)時(shí)，基座溫度通過試管壁傳遞到其試管內(nèi)液體，在穩(wěn)定散熱情況下自基座底部到試管形成一定梯度的溫度場(chǎng)，因此方法1所測(cè)溫度略高于方法2所測(cè)溫度，且方法2的所測(cè)位置的溫度波動(dòng)更小，其所測(cè)位置實(shí)際溫度的測(cè)量也更滿足DNA實(shí)驗(yàn)需要。

3 總結(jié)

根據(jù)PCR溫度計(jì)量檢測(cè)準(zhǔn)確性和升溫速率檢測(cè)快速響應(yīng)的需要，本文提出使用薄膜鉑電阻對(duì)PCR進(jìn)行溫度檢測(cè)；并通過提出兩種測(cè)溫傳感器放置的位置進(jìn)行溫度檢測(cè)試驗(yàn)，通過試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析比較其溫度偏差、波動(dòng)度、均勻度說明將測(cè)溫敏感點(diǎn)放置在試管的液體中的位置最滿足DNA實(shí)驗(yàn)需要。

【參考文獻(xiàn)】

[1]莫曉山，陳憲.PCR分析儀器關(guān)鍵技術(shù)及其相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制定初探[J].中國(guó)計(jì)量， 2009：74-76.

[2]張麗萍.基因擴(kuò)增儀PCR儀溫度校準(zhǔn)裝置的研究[D].天津：天津大學(xué)，2012.

[責(zé)任編輯：楊玉潔]