李 蓉(陜西省西安市第一醫(yī)院， 陜西 西安 710002)

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脂肪間質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)肝硬化大鼠的實(shí)驗(yàn)研究?

李 蓉
(陜西省西安市第一醫(yī)院， 陜西 西安 710002)

摘 要:目的:研究脂肪間質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)門(mén)靜脈及尾靜脈移植入肝硬化大鼠后的治療效果。方法:選取45只Wister大鼠，采用隨機(jī)對(duì)照方法將Wister大鼠分為對(duì)照組、門(mén)靜脈移植組及尾靜脈移植組。3組先用相同方法制造肝硬化模型，隨后，門(mén)脈移植組及尾靜脈移植組分別從門(mén)靜脈和尾靜脈注射2mL細(xì)胞數(shù)量為2×106個(gè)脂肪間質(zhì)干細(xì)胞懸液，對(duì)照組注入2mL細(xì)胞培養(yǎng)液，6周后觀察三組大鼠治療效果。結(jié)果:門(mén)靜脈組大鼠肝臟邊緣變鈍，表明紋理變粗，大鼠肝臟形態(tài)改變程度較輕；對(duì)照組及尾靜脈組大鼠肝臟質(zhì)地則比較生硬，肝臟萎縮，顏色暗淡，出現(xiàn)不同成度的肝硬化；三組治療前AST、ALT、ALB及總膽紅素(TBIL)指標(biāo)差異不顯著(P＞0.05)；門(mén)靜脈組大鼠AST、ALT、總膽紅素(TBIL)指標(biāo)顯著低于對(duì)照組和尾靜脈組(P＜0.05)；ALB顯著高于對(duì)照組和尾靜脈組(P＜0.05)；對(duì)照組肝臟在顯微鏡下顯示：肝臟出現(xiàn)不同程度的變性、壞死，肝細(xì)胞脂肪變性占小葉比例2/ 3以上；尾靜脈組肝臟出現(xiàn)纖維化，且細(xì)胞數(shù)少于對(duì)照組；門(mén)脈組大鼠肝臟纖維化程度最輕，光鏡下甚至能夠看見(jiàn)正常肝臟細(xì)胞。結(jié)論:脂肪間質(zhì)干細(xì)胞便于獲取，易于分離、培養(yǎng)，且容易與外源基因?qū)牒捅磉_(dá)，屬于進(jìn)行干細(xì)胞移植治療肝硬化的新型種子細(xì)胞。其經(jīng)門(mén)靜脈及尾靜脈移植，能夠有效的改善肝硬化大鼠的肝功能并改善肝纖維化及肝硬化程度，具有重要的研究?jī)r(jià)值。

關(guān)鍵詞:脂肪間質(zhì)干細(xì)胞； 門(mén)靜脈； 尾靜脈移植； 大鼠肝硬化

肝硬化是由于一種或多種病因長(zhǎng)時(shí)間滯留在患者體內(nèi)而不斷反復(fù)作用逐漸形成的彌漫性肝損害。在我國(guó)絕大多數(shù)的病人是肝炎發(fā)病長(zhǎng)時(shí)間得不到及時(shí)的治療，最終演變?yōu)楦斡不Ｑ芯匡@示:全世界范圍內(nèi)肝硬化的發(fā)病率為2500/10萬(wàn)人口，并且每年超過(guò)50萬(wàn)人口死于肝硬化[1]。目前，臨床上對(duì)于肝硬化尚缺乏理想的治療方法，藥物治療雖然能夠改善患者癥狀，但是預(yù)后較差。再生醫(yī)學(xué)是利用機(jī)體的正常組織中某些細(xì)胞的特性以及創(chuàng)傷修復(fù)與再生功能，實(shí)施不斷分化最終尋找科學(xué)合理的生物治療方法，促進(jìn)機(jī)體的自我修復(fù)、再生，或者可以構(gòu)件新組織以及器官，有效維持、修復(fù)再生的組織和器官[2]。

用于慢性肝臟疾病的常見(jiàn)細(xì)胞有:雙能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞、原代細(xì)胞等。雖然能改善患者肝功能，但部分細(xì)胞體外擴(kuò)增能力較差、缺乏特異性等[3]。肝臟內(nèi)的微環(huán)境在某種程度上說(shuō)有一定獨(dú)特肝臟組織以及肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的相互作用，在條件運(yùn)行的情況下可以有效的促進(jìn)移植細(xì)胞的進(jìn)一步增殖和分化作用。研究顯示:從人體或動(dòng)物脂肪中分離得到的脂肪間脂干細(xì)胞經(jīng)過(guò)一定條件下的培養(yǎng)能夠表現(xiàn)出和肝臟細(xì)胞類(lèi)似的細(xì)胞分化能力。目前臨床上對(duì)于脂肪間質(zhì)干細(xì)胞在動(dòng)物及臨床中的研究相對(duì)較少，因此研究脂肪間質(zhì)干細(xì)胞對(duì)大鼠肝硬化的治療效果具有重要的意義。

1　材料與方法

1.1材料:2013年12月至2015年1月期間，對(duì)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的45只實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行分析，探討脂肪間質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)門(mén)靜脈及尾靜脈移植后對(duì)大鼠肝硬化的治療效果。

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:45只Wister大鼠，體重為(0.16～0. 40)kg，平均(0.20±0.01)kg，雌雄隨機(jī)，飼養(yǎng)嚴(yán)格遵守相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)大鼠進(jìn)行等條件喂養(yǎng)，對(duì)大鼠的處理符合《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)下意見(jiàn)》中相關(guān)規(guī)則。采用隨機(jī)對(duì)照方法將Wister大鼠分為對(duì)照組、門(mén)靜脈移植組及尾靜脈移植組，每組15只。

表1　主要儀器和試劑

1.1.2主要儀器和試劑:胎牛血清、DMED培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液、胰酶消化液，CD44、CD29、CD45等相關(guān)克隆抗體試劑盒。廣譜細(xì)胞角蛋白抗體、SABC通用型免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒、Nikon生物光學(xué)攝影顯微鏡等。相關(guān)試劑和儀器廠家如下(見(jiàn)表1)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1ADMSCs的分離培養(yǎng):無(wú)菌操作下從健康Wister大鼠腹股溝皮下獲得脂肪組織，剪碎后放入1g/ L膠原酶消化，振蕩搖勻。下層液體使用篩網(wǎng)進(jìn)行清潔，并進(jìn)行過(guò)濾處理，離心3min，速度800r/ min，加入紅細(xì)胞裂解液進(jìn)行懸浮處理，靜止15min再次離心，去除其存在的殘余雜質(zhì)。另?xiàng)壢ド锨寮尤牒繛?00mL/ LFBS的DMEM培養(yǎng)液，充分混合均勻之后接種在培養(yǎng)皿中，在37℃的溫度條件下，50mL/ L CO2孵箱中培養(yǎng)24h，再對(duì)其進(jìn)行首次換液處理，新鮮的培養(yǎng)液加入到貼壁細(xì)胞，每2～3d換液一次。在細(xì)胞增殖完全融合到培養(yǎng)皿底80%的情況下，胰酶消化依據(jù)1∶1比例進(jìn)行傳代。將第3～5代所得的貼壁細(xì)胞做出細(xì)胞懸液，其標(biāo)簽的標(biāo)定濃度為1.0×106，各個(gè)試管可裝入2mL，置于孵箱中以備移植使用。

1.2.2大鼠肝硬化模型建立[4]:大鼠食用普通飼料，并根據(jù)5mL/ kg劑量在腹腔內(nèi)注射40%四氯化碳植物油溶液，每周2次，連續(xù)注射3周。同時(shí)，大鼠飲食10%乙醇溶液。第4周注射50%四氯化碳中性植物油溶液，每周3次，連續(xù)注射3周；改用為30%的乙醇溶液作為其飲用水。制備大鼠模型共使用6周。

1.2.3三組肝硬化大鼠治療:大鼠在誘導(dǎo)肝損傷6周后，門(mén)靜脈組大鼠按照要求注射10mg/ L水合氯醛實(shí)施麻醉，于大鼠腹部正中做一個(gè)3cm的胃腸切口，使用26G細(xì)針實(shí)施血管穿刺，在完全確定針，對(duì)位于門(mén)靜脈血管內(nèi)之后，緩慢注射2mL的大鼠ADMSCs懸液，此時(shí)通過(guò)計(jì)算能夠發(fā)現(xiàn)細(xì)胞懸液中有細(xì)胞2×106個(gè)左右，之后可將細(xì)針拔出，同時(shí)穿刺的部位使用明膠海綿對(duì)其實(shí)施止血處理，并關(guān)閉大鼠腹腔。尾靜脈組大鼠則從尾靜脈注射2mL的大鼠ADMSCs懸液；對(duì)照組是從尾靜脈注射相同劑量的細(xì)胞培養(yǎng)液[5]。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1大鼠肝硬化模型蘇木清-伊紅染色:大鼠模型建立后取肝臟進(jìn)行病理學(xué)檢測(cè)。觀察肝硬化組織情況。

1.3.2肝功能指標(biāo)的檢測(cè):大鼠在治療前及治療后6周抽取1.5～2mL尾靜脈血，進(jìn)行肝功能相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。采用生化檢測(cè)儀對(duì)采集血液進(jìn)行肝功能檢測(cè)，檢測(cè)指標(biāo)主要包括:天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶( ALT)、白蛋白( ALB)及總膽紅素(TBIL)。

1.3.3組織病理學(xué)檢查:將門(mén)靜脈組、尾靜脈組肝硬化大鼠，脂肪間質(zhì)干細(xì)胞治療6周后將大鼠處死，并取出肝臟，采用生理鹽水進(jìn)行沖洗，觀察大鼠形態(tài)。對(duì)照組用相同劑量的細(xì)胞培養(yǎng)液注射6周后，用同上方法處理。最后將三組大鼠肝臟采用100g/ L甲醛溶液進(jìn)行72h固定，采用石蠟包埋切片，并進(jìn)行HE染色[6]。

1.3.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:對(duì)研究數(shù)據(jù)用SPSS18.0軟件進(jìn)行處理，肝功能指標(biāo)用s描述，組間比較采用單因素分差分析，重要比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05，為存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2　結(jié) 果

2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析:45只大鼠全部進(jìn)行結(jié)果分析，中途無(wú)死亡。

2.2肝硬化大鼠組織分析:蘇木精-伊紅染色結(jié)果顯示:肝硬化大鼠細(xì)胞疏松、濁腫，存在少許脂肪變，且存在炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肝小葉結(jié)構(gòu)模糊不清，有多個(gè)大小不等的假小葉形成(見(jiàn)圖1)。

圖1　肝硬化模型大鼠肝組織蘇木精-伊紅染色結(jié)果(×200)

2.3脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)及鑒定:在顯微鏡下脂肪干細(xì)胞呈現(xiàn)梭形細(xì)胞貼壁，細(xì)胞形態(tài)不一，且細(xì)胞核居中；脂肪間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)3～5d后發(fā)現(xiàn)脂肪間質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)茂盛，排列具有一定方向性(圖2)。同時(shí)，脂肪間質(zhì)干細(xì)胞常規(guī)免疫熒光染色顯示細(xì)胞CD29、CD44等均為陽(yáng)性，CD45為陰性。

圖2　脂肪干細(xì)胞倒置顯微鏡下圖(×100)

2.4肝功能指標(biāo)檢測(cè):本次研究中，三組治療前AST、ALT、ALB及總膽紅素(TBIL)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)；治療后門(mén)靜脈組大鼠AST、ALT、總膽紅素(TBIL)指標(biāo)顯著低于對(duì)照組和尾靜脈組(P＜0.05)；ALB顯著高于對(duì)照組和尾靜脈組(P＜0.05)(見(jiàn)表2)。

表2　細(xì)胞移植治療前后各組別大鼠肝功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較

2.5大鼠肝臟組織的HE染色結(jié)果:本次研究中，對(duì)照組肝臟在顯微鏡下顯示:肝臟出現(xiàn)不同程度的變性、壞死，肝細(xì)胞脂肪變性占小葉比例2/3以上；尾靜脈組肝臟出現(xiàn)纖維化，且細(xì)胞數(shù)少于對(duì)照組；門(mén)靜脈組大鼠肝臟纖維化程度最輕，光鏡下甚至能夠看見(jiàn)正常肝臟細(xì)胞(圖3)。

圖3　大鼠肝臟組織的HE染色結(jié)果(×200倒置顯微鏡)

3　討 論

隨著基因技術(shù)飛速發(fā)展，干細(xì)胞移植在肝硬化患者中廣為使用，并且在臨床上研究相對(duì)較多。尤其骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的研究。研究顯示[7]:將骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchyma1 stem ce11s，BMSCs)移植入肝硬化的動(dòng)物中效果理想，能夠有效的改善動(dòng)物肝臟損害程度，并且能夠在一定程度上抑制肝臟纖維化的形成。而在臨床應(yīng)用方面，相關(guān)學(xué)者進(jìn)行了一次實(shí)驗(yàn)[8，9]，實(shí)驗(yàn)中從肝硬化患者身上分離、鈍化出骨髓間質(zhì)干細(xì)胞并將其移植到肝臟，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:患者手術(shù)后肝功能、凝血功能等均得到改善，由此看出:BMSCs肝內(nèi)移植能夠有效的緩解肝硬化患者肝功能的損害，改善其生活質(zhì)量，并且使用該方法治療時(shí)并未出現(xiàn)明顯的并發(fā)癥，安全性較高。

早在2001年，第一次從人體脂肪中分離出干細(xì)胞，并證實(shí)脂肪間質(zhì)干細(xì)胞在一定條件下能夠向成骨、脂肪和成肌等方向進(jìn)行分化。研究結(jié)果顯示:脂肪間質(zhì)干細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)采用干細(xì)胞生長(zhǎng)因子等進(jìn)行誘導(dǎo)，能夠定向分化形成肝細(xì)胞，能夠有效的改善患者肝功能。同時(shí)，脂肪間質(zhì)干細(xì)胞和其他干細(xì)胞相比來(lái)源更加充裕、易于獲取，并且獲取量較大，能夠進(jìn)行反復(fù)取材。由此表明:脂肪間質(zhì)干細(xì)胞適合用于肝硬化的治療。另有研究顯示:移植細(xì)胞在肝臟內(nèi)環(huán)境下和其他多種因子共同作用下能夠發(fā)揮肝臟細(xì)胞樣細(xì)胞的功能，能夠共同參與肝臟代謝和肝組織重建工作。

但是，對(duì)于脂肪間質(zhì)干細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)如何抑制肝硬化進(jìn)一步發(fā)展機(jī)制尚不知曉，可能的機(jī)制如下:①脂肪間質(zhì)干細(xì)胞在干細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)下在肝臟內(nèi)分化為功能性干細(xì)胞，從而能夠有效的促進(jìn)肝細(xì)胞再生；②脂肪間質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡或抑制肝星狀細(xì)胞活性等功能而抑制肝組織纖維化的形成。臨床上，對(duì)于脂肪間質(zhì)干細(xì)胞治療肝硬化仍需要克服許多難題。本項(xiàng)研究結(jié)果顯示:門(mén)靜脈組大鼠肝細(xì)胞變性及肝纖維化程度顯著低于尾靜脈組(P＜0.05)；由此看出:大鼠在治療過(guò)程中選擇何種注射部位具有重要的意義。不同的注射部位治療過(guò)程中存在明顯的差異，可能的原因?yàn)?第一大鼠在治療過(guò)程中通過(guò)門(mén)靜脈移植干細(xì)胞治療，在相同條件下能夠到達(dá)肝臟的有效細(xì)胞更多，參與肝臟修復(fù)的細(xì)胞也相對(duì)較多；再者通過(guò)門(mén)靜脈途徑移植細(xì)胞能夠保證細(xì)胞植入后在肝臟內(nèi)部分布更加均勻，更加接近人體正常肝臟的運(yùn)作功能，移植干細(xì)胞在機(jī)體肝臟組織越容易停留，從而能夠更好的發(fā)揮其治療功能。

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Cirrhotic Rat Model Treated with Adipose Mesenchymal Stem Cells

LI Rong
(The First Hospital Affiliated to Xi'an Medical College，Shanxi Xi'an 710002，China)

Abstract:Objective:To investigate the c1inica1 effect of adipose mesenchyma1 stem ce11s transp1anted from the porta1 vein and cauda1 vein graft c1inica1 in treatment of 1iver cirrhosis in rats. Method: 45 Wister rats data were ana1yzed，and using random1y contro11ed method，were divided into the contro1 group，the porta1 transp1antation group and tai1 vein graft group，with 15 in each group. The porta1 transp1antation group and tai1vein transp1antation group were intraveous1y injected from the tai1 and porta1 vein 2mL intergovernmenta1 fat stem ce11 suspension with 2×106ce11s，the contro1 group injected 2mL ce11 cu1ture medium，the treatment effect was observed on three groups of rats in six weeks. Result: Liver porta1 vein group b1unt edge indicated thicker texture；The 1iver texture of the contro1 group and the tai1 vein group was re1ative1y stiff，1iver atrophy and dark co1ors，there was different degrees of cirrhosis；of the three groups before treatment，AST，ALT，ALB and tota1 bi1irubin (TBIL) index was not significant1y different (P＞0.05)；AST，ALT and TBLL index of the porta1 group were significant1y 1ower than those of the contro1 group and the tai1 vein group (P＜0.05)；ALB significant1y higher than that of contro1 group and the tai1 vein group (P＜0.05)；the 1iver of the contro1 group under the microscope showed: there were different degrees of 1iver degeneration and necrosis，hepatic steatosis proportion accounted for more than 2/3 of 1obu1es；1iver fibrosis was found in tai1 vein group，and the number of ce11s was 1ess than that of the contro1 group；1iver fibrosis of the porta1 group was 1ightest，norma1 1iver ce11s cou1d be seen under 1ight microscope. Conclusion: Adipose mesenchyma1 stem ce11s are easi1y separated，cu1tured，and esi1y ferried and expressed with exogenous gene，be1onging to the new seed ce11s in the treatment of cirrhosis with 1iver transp1antation，after transp1antation，it can effective1y improve the body's 1iver function and pro1ong 1ife of the body，which has important research va1ue.

Key words:Adipose mesenchyma1 stem ce11s； Porta1 vein； Tai1 vein transp1antation； Liver cirrhosis

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

doi:10.3969/ j.issn.1006-6233.2016.02.002

文章編號(hào):1006-6233(2016)02-0180-05

基金項(xiàng)目：?陜西省衛(wèi)生廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目，(編號(hào)：14H21)