蔣俏麗，劉樂(lè)環(huán)，黃瑞雪，茅玉煒，黎翊君，翟文文，戴俊東

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 100102）

含丹酚酸的丹參酮微乳處方工藝研究＊

蔣俏麗，劉樂(lè)環(huán)，黃瑞雪，茅玉煒，黎翊君，翟文文，戴俊東＊＊

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 100102）

目的：制備丹參多組分復(fù)合微乳，優(yōu)選最佳處方及制備工藝。方法：結(jié)合偽三元相圖法與單純形網(wǎng)格法，以微乳粒徑、包封率和載藥量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò) Design Expert 8.06 軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和模型構(gòu)建，響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析優(yōu)化和驗(yàn)證最佳處方。結(jié)果：最終優(yōu)選出的微乳處方為肉豆蔻酸異丙酯:15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯（solutrol-HS 15）-二乙二醇單乙基醚（transcutol P）（4:1）:純化水為13.3:31.7:55.0，此時(shí)微乳粒徑為12.88±0.57 nm，丹參酮IIA包封率為98.00±2.26%，丹參酮IIA和丹酚酸B的載藥量分別為5.30±0.03、2.43±0.01 mg·g-1。結(jié)論：該法制得的微乳中丹參酮IIA包封率及載藥量均較高，粒徑較小，為丹參微乳制劑的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

丹參總酚酸 總丹參酮 單純形網(wǎng)格法 微乳 處方優(yōu)化 含量測(cè)定

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根和根莖，性味苦，微寒。歸心、肝經(jīng)。有祛瘀止痛，活血通經(jīng)，清心除煩之功效[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明丹參對(duì)多種疾病如心血管系統(tǒng)疾病、消化系統(tǒng)疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等都具有良好的治療效果及預(yù)防作用。丹參的藥效成分主要是以丹參酮類(lèi)（丹參酮IIA、隱丹參酮、丹參酮I等）為主的脂溶性成分和以酚酸類(lèi)（丹酚酸A、B、丹參素、原兒茶醛等）為主的水溶性成分。目前臨床上常用的丹參類(lèi)口服制劑中丹參酮IIA的水溶性差，吸收時(shí)又受到P-糖蛋白外排轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，絕對(duì)生物利用度低于3.5%[2,3]；丹酚酸B口服時(shí)受腸道酶水解、pH、p糖蛋白和載體轉(zhuǎn)運(yùn)等因素影響，絕對(duì)生物利用度也僅為2.3%[4-6]。注射制劑多以一類(lèi)成分為主，難以同時(shí)包含脂溶性丹參酮類(lèi)和水溶性丹酚酸類(lèi)成分，患者用藥的順應(yīng)性也較差。因此，本研究通過(guò)將丹參酮與丹酚酸制備成微乳，以期通過(guò)透皮給藥技術(shù)使兩類(lèi)成分能同時(shí)起效，生物利用度得到提高，患者順應(yīng)性得到改善。

微乳是由水相、油相、表面活性劑和助表面活性劑在適當(dāng)?shù)谋壤伦园l(fā)形成的一種透明或者半透明、低黏度、各向同性的熱力學(xué)穩(wěn)定體系，粒徑通常在5-100 nm之間[7]。水溶性微乳能夠顯著增加脂溶性丹參酮類(lèi)成分的溶解度，提高其生物利用度；又能夠溶解丹酚酸類(lèi)水溶性成分，實(shí)現(xiàn)兩類(lèi)活性成分的同時(shí)給藥，發(fā)揮其協(xié)同作用。本文采用 單純形網(wǎng)格法[8]（ Simplex Lattice Design，SLD）優(yōu)化設(shè)計(jì)丹參復(fù)合微乳給藥系統(tǒng)，闡明影響該制劑處方的關(guān)鍵因素，篩選得出最優(yōu)處方。

1 材料

高效液相色譜儀（SPD-20A，日本島津）；電子天平[BT125D，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；多點(diǎn)加熱磁力攪拌器（RT10 PowerIKAWERKE，上海大邁儀器有限公司）；動(dòng)態(tài)光散射粒徑儀（NANO-ZS型，英國(guó)馬爾文）。

丹參酮IIA對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110766-200619）；丹酚酸B對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111562-201212）；丹參總酮（ 南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：141011，純度60%）；丹參總酚酸（南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：141008，純度60%）；肉豆蔻酸異丙酯（Isopropyl myristate，IPM，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20140522）； 聚乙二醇十二羥基硬脂酸酯（北京鳳禮精求商貿(mào)有限責(zé)任公司，批號(hào)：34445116KO）；二乙二醇單乙基醚 （ 法國(guó)Gattefossé公司，批號(hào)：146063）；乙腈、甲醇（色譜醇，美國(guó)Fisher公司），水為純化水，其它試劑均為分析純。

2 方法

根據(jù)文獻(xiàn)[9-11]和預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)丹參酮溶解度大，安全無(wú)刺激性的IPM為微乳油相，15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯為表面活性劑，二乙二醇單乙基醚為助表面活性劑，純化水為水相。

2.1 偽三元相圖的繪制及微乳的制備方法

偽三元相圖的繪制[12-15]：將表面活性劑，助表面活性劑以特定比例（1:1、2:1、3:1、4:1、5:1）混合后與特定比例油相（油相與Smix的重量比為1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1）于磁力攪拌器上在300 r·min-1、38℃條件下混合均勻，將水相逐滴加入油相中，邊加邊攪拌，記錄體系由澄清變渾濁及由渾濁再變澄清的加入水量，以油相、水相、表面活性劑-助表面活性劑混合相為3個(gè)頂點(diǎn)，繪制偽三元相圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 偽三元相圖

微乳的制備：將過(guò)量的丹參酮分別加入油相及混合表面活性劑中，離心取上清液，按微乳處方比例將油相與混合表面活性劑置于磁力攪拌器上在300 r·min-1、38℃條件下混合均勻。將過(guò)量的丹酚酸溶于純化水中離心取上清作為水相，按處方比例將水相逐滴加入上述混合油相中，邊加邊攪拌使其形成澄清透明的含丹酚酸的丹參酮微乳。

2.2 丹參酮 II A與丹酚酸B的含量測(cè)定

液相色譜條件：色譜柱：Kromasil C18（5 μm，250 mm×4.6 mm），流動(dòng)相：乙腈-0.4%磷酸溶液（0-20 min，10-45:90-55；20-21 min，45-80:55-20；21-37 min，80:20；37-38 min，80-10:20-90，38-43 min，10:90），流速：1.2 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm（TSN），286 nm（Sal B）進(jìn)樣量：10uL 。在該色譜條件下，各成分分離度良好，結(jié)果見(jiàn)圖2。丹參酮II A和丹酚酸B的分離度分別為1.96和3.31，理論板數(shù)分別為138 123和114 068，均符合要求。

表1 單純形網(wǎng)格設(shè)計(jì)處方優(yōu)化試驗(yàn)安排及結(jié)果

圖2 模型擬合及優(yōu)化范圍點(diǎn)

2.3 SLD設(shè)計(jì)優(yōu)化丹參多組分復(fù)合微乳

參照偽三元相圖得到的微乳區(qū)域，同時(shí)考慮表面活性劑和油相的用量，初步選出各項(xiàng)的比例范圍為油相：5%-15%，表面活性劑相：30%-40%，水相55%-65%。由于丹酚酸是水溶性成分，微乳中丹酚酸直接溶于水相中，因此微乳中丹酚酸的含量主要取決于水相的比例，水相比例越高，丹酚酸含量越高。故在優(yōu)化處方時(shí)只以各相特定的比例為考察因素，以微乳的平均粒徑、丹參酮IIA的包封率和載藥量為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

3 結(jié)果與分析

3.1 偽三元相圖的繪制

以上偽三元相圖的結(jié)果顯示，當(dāng)Sm=4:1時(shí)，微乳區(qū)域最大，故選擇4:1作為表面活性劑與助表面活性劑的比例。

3.2 含量測(cè)定方法學(xué)考察

方法學(xué)考察結(jié)果證明專(zhuān)屬性良好，以峰面積積分值對(duì)對(duì)照品的進(jìn)樣量進(jìn)行線性回歸，得Sal B回歸方程：Y=11 460 782.86X-89 474.00（線性范圍：10.0-210.0 μg·mL-1，r=0.999 7）；TSN回歸方程：Y=47 906 766.22X+4 137.54（線性范圍：0.3-64.0 μg·ml-1，r=0.999 9）。方法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率RSD均小于2%，符合要求。表明此HPLC方法同時(shí)檢驗(yàn)兩種成分的準(zhǔn)確性符合要求。

3.3 SLD設(shè)計(jì)優(yōu)化丹酚酸-丹參酮復(fù)合微乳

采用 Design Expert 8.06軟件中單純形網(wǎng)格設(shè)計(jì)對(duì)丹參復(fù)合微乳的處方組成進(jìn)行實(shí)驗(yàn)安排，并進(jìn)行相關(guān)評(píng)價(jià)指標(biāo)檢測(cè)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1，模型擬合及優(yōu)化范圍見(jiàn)圖2。

3.3.1 模型擬合及分析

應(yīng)運(yùn)Design Expert 8.06軟件，以油相（A）、混合表面活性劑（B）、水相（C）為自變量，平均粒徑（Y1）、丹參酮II A包封率（Y2）、丹參酮IIA載藥量（Y3）為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行多元回歸模型擬合及優(yōu)化，相應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表1。得到以下相應(yīng)響應(yīng)方程：

Y1=0.858 07A-0.079 164B+0.059 973C（R2Adj= 0.869 8，P＜0.000 1，P失擬相=0.195 5）

Y2=1.707 95A+0.158 15B+1.265 46C（R2Adj= 0.801 6，P＜0.000 1，P失擬相=0.301 0）

Y3=0.597 59A+0.098 815B-6.652 78×10-5C-7.587 82×10-3AB-4.049 69×10-3AC+3.423 73× 10-6BC（R2Adj=0.982 1，P＜0.000 1，P失擬相=0.986 4）

由Y1、Y2、Y33個(gè)方程可知：響應(yīng)模型方程的P值均是＜0.000 1，遠(yuǎn)小于0.05，表明響應(yīng)回歸模型達(dá)到極顯著水平；響應(yīng)模型失擬項(xiàng)的P值分別為0.195 5、0.301 0、0.986 4，均大于0.05，即相對(duì)于純誤差不顯著，因此3項(xiàng)指標(biāo)的回歸模型擬合非常成功。由方程Y1可以看出，對(duì)丹參復(fù)合微乳粒徑影響較大的因素是油相的比例，油相的比例減少，粒徑將減??；由方程Y2可以看出對(duì)丹參復(fù)合微乳中丹參酮II A包封率影響較大的因素是油相和水相的比例，隨著油相和水相比例的增加，丹參酮II A包封率將增加；由方程Y3可以看出對(duì)丹參復(fù)合微乳中丹參酮II A載藥量影響較大的因素是油相和混合表面活性劑的比例，隨著油相和混合表面活性劑比例的增加，丹參酮II A包封率將增加。

3.3.2 最優(yōu)處方的確定

Design Expert 8.06軟件中單純形網(wǎng)格設(shè)計(jì)時(shí)，考慮到本研究中影響載藥微乳質(zhì)量的主要為藥物的包封率和微乳的載藥量，粒徑均符合要求且較小，故以微乳包封率和載藥量為主要權(quán)重因子，粒徑相對(duì)為次要權(quán)重因子，即包封率和載藥量的重要度為四星，粒徑的重要度為三星。最終得到兩個(gè)理論較優(yōu)處方：處方1最優(yōu)評(píng)分為0.680，處方2最優(yōu)評(píng)分為0.679，具體情況見(jiàn)圖3。兩個(gè)處方比例及預(yù)測(cè)值見(jiàn)表2。

圖3 理論處方1（A）和理論處方2（B）評(píng)分圖

按照以上兩個(gè)理論處方各制備3批次丹參復(fù)合微乳，其平均粒徑、TSN包封率和載藥量見(jiàn)表3。

由表3可以看出，優(yōu)化處方1和優(yōu)化處方2的包封率和載藥量的偏差的絕對(duì)值均小于10%，而處方1粒徑偏差的絕對(duì)值大于10%，說(shuō)明優(yōu)化處方2更加符合擬合方程，且本實(shí)驗(yàn)擬合方程可以較好的描述因素與指標(biāo)的關(guān)系，優(yōu)化處方2具體優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)圖4。

3 討論與小結(jié)

本研究最終得到的優(yōu)化處方為油相：13.327%，表面活性劑相：31.673%，水相：55.000%。

丹參酮II A和丹酚酸B在丹參藥材中含量比例較高且具有明確的藥理作用，因此選擇丹參酮II A和丹酚酸B作為丹參多組分復(fù)合微乳制劑含量測(cè)定的指標(biāo)性成分。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)丹酚酸的載藥量只與水相含量有關(guān)，丹酚酸的加入對(duì)復(fù)合微乳的粒徑及丹參酮II A的包封率和載藥量無(wú)明顯影響。

表2 兩個(gè)優(yōu)化處方比例及模型擬合預(yù)測(cè)值

表3 最優(yōu)處方實(shí)驗(yàn)實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的比較

圖4 理論處方2比例及預(yù)測(cè)值

助表面活性劑能改變表面活性劑的表面活性及親水親油平衡值，微乳制劑中常用無(wú)水乙醇為助表面活性劑[16]，存在容易揮發(fā)和刺激性強(qiáng)的缺點(diǎn)。本研究中選用的助表面活性劑二乙二 醇單乙基醚是近年來(lái)新合成的藥用輔料，是許多活性藥物如硝酸甘油、荷爾蒙等的良好溶劑，可用于局部給藥、透皮給藥及口服制劑的制備，是良好的吸收促進(jìn)劑。毒理學(xué)研究證實(shí)其對(duì)眼部粘膜、皮膚等均無(wú)刺激性，對(duì)皮膚無(wú)致敏性1Transcutol P理化性質(zhì)和注冊(cè)文件。。本研究發(fā)現(xiàn)丹參酮在二乙二醇單乙基醚中溶解能力較強(qiáng)，是在油相IPM中的2.6倍。二乙二醇單乙基醚的高溶解性能使其在發(fā)揮助表面活性劑作用的同時(shí)顯著增加微乳制劑中脂溶性丹參酮的載藥量。Censi R.等[17]的研究表明槲皮素溶解在微乳中或僅溶于二乙二醇單乙基醚中時(shí)，其透皮能力與槲皮素水溶液相比顯著提高；劉志東等[18]的角膜滲透實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，二乙二 醇單乙基醚能夠增加水溶性藥物的角膜透過(guò)量。本研究選擇二乙二 醇單乙基醚作為助表面活性劑，在改善表面活性劑聚乙二醇十二羥基硬脂酸酯乳化能力的同時(shí)，能夠顯著增加脂溶性丹參酮在微乳制劑中的溶解度，并改善丹參復(fù)合微乳中兩類(lèi)藥物的的經(jīng)皮滲透能力，為本研究后續(xù)透皮實(shí)驗(yàn)的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

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Study on Microemulsion Formulation of Radix Salvia Miltiorrhiza Containing Salvianolic Acid

Jiang Qiaoli, Liu Lehuan, Huang Ruixue, Mao Yuwei, Li Yijun, Zhai Wenwen, Dai Jundong
(School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China)

This study aimed to optimize the formulation and preparation process of Salvia miltiorrhiza multicomponent microemulsion. Combined with pseudo three phase diagram method and simplex lattice design, particle size, entrapment efficiency and drug loading of microemulsion were selected as evaluation indexes. Experimental design and model establishment were performed by Expert Design 8.06 software. Final microemulsion formulation was optimized and validated by the response surface data analysis. It was found that the component proportion of the final optimized microemulsion formulation was as follows: ratio of isopropyl myristate (IPM) to Solutrol-HS 15-Transcutol P (4:1) to purified water was 13.3 to 31.7 to 55.0. Particle size of the final microemulsion formulation was 12.88±0.57 nm, while entrapment efficiency of tanshinone II 98.00±2.26%, and drug loading of tanshinone II A and salvianolic acid B 5.30±0.03, 2.43±0.01 mg·g-1, respectively. It was concluded that the high entrapment efficiency and drug loading rate of tanshinone II, small particle size were obtained in the microemulsion prepared by optimized formulation, which provided scientific basis for further development and application of Salvia miltiorrhiza multicomponent microemulsion.

Total salvianolic acid, total tanshinones, simplex lattice design, microemulsion, formulation optimization, content determination

10.11842/wst.2016.03.027

R283

A

（責(zé)任編輯：朱黎婷 張志華，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2015-11-04

修回日期：2015-11-26

＊ 北京中醫(yī)藥大學(xué)自主選題資助項(xiàng)目（2015-JYB-XS108）：丹參吸入粉霧劑的制備及其特發(fā)性肺纖維化的藥效學(xué)評(píng)價(jià)，負(fù)責(zé)人：翟文文。

＊＊ 通訊作者：戴俊東，副教授，主要研究方向：分子藥劑學(xué)與新型給藥系統(tǒng)研究。