王洲羿，夏光明，周　剛，肖展翅，黃虎翔，陳浩特，李　鋼

湖北省黃岡市中心醫(yī)院(湖北黃岡 438000)

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何首烏對血管性認(rèn)知障礙大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響

王洲羿，夏光明，周剛，肖展翅，黃虎翔，陳浩特，李鋼

湖北省黃岡市中心醫(yī)院(湖北黃岡 438000)

摘要：目的探討何首烏對血管性認(rèn)知障礙(VCI)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響。方法篩選造模成功VCI大鼠48只，隨機(jī)分為4組：何首烏高劑量組、何首烏中劑量組、何首烏低劑量組、VCI模型組，每組12只大鼠。另有12只假手術(shù)大鼠作為正常對照組(假手術(shù)組)。造模成功后對大鼠用灌胃器灌胃，灌胃液體溫度為20 ℃，何首烏高、中、低劑量組給予4.0 g/mL、2.0 g/mL、0.5 g/mL何首烏溶液灌胃，模型組、假手術(shù)組均生理鹽水灌胃，灌胃劑量按1 mL/(100 g·d)，共28 d。術(shù)后28 d各組大鼠開始行Morris水迷宮學(xué)習(xí)記憶能力等行為學(xué)測試，行為學(xué)測試結(jié)束后，行免疫組織化學(xué)檢測Bcl-2、Bax陽性細(xì)胞的表達(dá)。結(jié)果與VCI模型組相比，何首烏中劑量組、何首烏高劑量組大鼠逃避潛伏期明顯縮短，穿越目標(biāo)象限時(shí)間明顯延長，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 或P<0.01)；各組VCI大鼠造模28 d完成行為學(xué)試驗(yàn)后海馬區(qū)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)顯著高于假手術(shù)組。而何首烏高劑量組、中劑量組與VCI模型組相比Bcl-2蛋白表達(dá)增加的幅度明顯大于Bax蛋白(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論何首烏通過調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)來抑制細(xì)胞凋亡，從而改善VCI大鼠的學(xué)習(xí)以及認(rèn)知能力。

關(guān)鍵詞：血管性認(rèn)知障礙；何首烏；學(xué)習(xí)記憶功能；Bcl-2；Bax；呆病

血管性認(rèn)知障礙(VCI)是伴隨著腦血管病的發(fā)生出現(xiàn)的一種記憶、認(rèn)知和行為等障礙的綜合征，其中較為嚴(yán)重的又稱血管性癡呆(VD)。隨著我國老齡人口的不斷增多，血管性癡呆這一問題日益突出。與阿爾茨海默病(AD)等其他認(rèn)知功能障礙疾病不同，VCI是一種可預(yù)防、可延緩認(rèn)知損害進(jìn)程，甚至可逆轉(zhuǎn)的綜合征[1]。這提示人們應(yīng)該把重點(diǎn)放在對VCI的長期診治和預(yù)防干預(yù)上來。因此，在充分認(rèn)識(shí)VCI的基礎(chǔ)上。在VCI初期發(fā)展到VD之前，就做到早期預(yù)防、早期診斷、早期治療，阻止病情發(fā)展，無疑對預(yù)防和控制VD的發(fā)生和發(fā)展有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。因此開發(fā)研究確實(shí)有效的預(yù)防治療藥物非常迫切。何首烏(Polygonum Multiflorum Thunb)是祖國醫(yī)學(xué)中抗衰老之中藥，據(jù)《本草綱目》記載何首烏有“益精髓、延年不老”之效。本研究擬建立VCI大鼠模型，通過何首烏對模型大鼠的治療，從其行為學(xué)和分子生物學(xué)水平分析血管性認(rèn)知障礙大鼠發(fā)病機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠80只，SPF級(jí)，體重(200±20)g，雌雄各半，湖北省黃岡市中心醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠購買后，養(yǎng)殖于自然光線下，保持溫度20 ℃～25 ℃，自由進(jìn)食進(jìn)水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2受試藥物何首烏藥材由本課題組所在單位藥劑科提供，原藥材經(jīng)該單位質(zhì)檢部鑒定為蓼科植物何首烏的塊根，其質(zhì)量符合《中國藥典》2010版何首烏項(xiàng)下規(guī)定。制首烏飲片由本實(shí)驗(yàn)室人員自行炮制并檢測，其質(zhì)量符合《中國藥典》2010版制何首烏項(xiàng)下規(guī)定。受試藥物提取制備：取制首烏飲片粗粉，先用80%乙醇熱提取兩次，提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，除去乙醇后加水配制成相當(dāng)于制何首烏4.0 g/mL、2.0 g/mL、0.5 g/mL 3種高、中、低劑量濃度的溶液。

1.3儀器與試劑MT-200Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司；熒光多功能顯微鏡：BX，日本OLYMPuS公司；CMIAS圖像分析儀：CMIAS 98A，北京航空航天大學(xué)；石蠟切片機(jī)：RM2145，德國LEICA公司；image-pro plus圖像處理系統(tǒng)6.0，美國Media Cybernetics公司。免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1VCI大鼠的造模方法采用反復(fù)結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)造成缺血再灌注損傷(2VO)建立大鼠VCI模型[2]。腹腔注射10%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉大鼠，鈍性分離雙側(cè)CCA，用動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)CCA造成腦缺血，夾閉10 min，再灌注20 min，反復(fù)3 次，縫合切口，術(shù)后行抗感染治療。假手術(shù)組只行CCA分離，不夾閉血管。

1.4.2分組及給藥方法篩選術(shù)后造模成功大鼠48只，隨機(jī)分為4組：何首烏高劑量組、何首烏中劑量組、何首烏低劑量組、VCI模型組，每組12只大鼠。另有12只假手術(shù)大鼠作為正常對照組(假手術(shù)組)。造模成功后對大鼠用灌胃器灌胃，灌胃液體溫度為20 ℃，何首烏高、中、低劑量組分別給予4.0 g/mL、2.0 g/mL、0.5 g/mL何首烏溶液灌胃，模型組、假手術(shù)組均給予生理鹽水灌胃，灌胃劑量按1 mL/(100 g·d)，共28 d。

1.4.3學(xué)習(xí)記憶能力測定采用Morris水迷宮方法[3]。實(shí)驗(yàn)前將大鼠放入水中進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練。術(shù)后28 d各組大鼠開始行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：①定位航行實(shí)驗(yàn)，歷時(shí)5 d，每天4次，大鼠面向池壁從A、B、C、D入水點(diǎn)放入水中，觀察其在2 min內(nèi)尋找到并爬上平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期)，若2 min未找到平臺(tái)，實(shí)驗(yàn)者將其牽引至平臺(tái)上，停留10 s后放回籠中，潛伏期記為最高2 min。②空間探索實(shí)驗(yàn)：第6天撤除平臺(tái)，任選一個(gè)入水點(diǎn)放入大鼠，測量2 min內(nèi)大鼠在目標(biāo)象限和其他象限的游泳時(shí)間、穿越目標(biāo)(原平臺(tái))次數(shù)[4]。

1.4.4免疫組織化學(xué)檢測Bcl-2、Bax陽性細(xì)胞的表達(dá)行為學(xué)測試結(jié)束后，各組大鼠行心臟灌注術(shù)，以0.4%的戊巴比妥鈉(1 mL/100 g)腹腔麻醉，立即開胸暴露心臟。左心室迅速插管至主動(dòng)脈，同時(shí)剪開右心室，灌注生理鹽水，速度先快后慢，直至舌尖、肝臟變白，大鼠四肢僵硬為滿意，迅速取腦，立即將腦置于4%多聚甲醛中浸置4 h～6 h，取視交叉后4 mm處至小腦前的腦組織，PBS漂洗，經(jīng)乙醇常規(guī)脫水、二甲苯透明后，浸蠟包埋，5 mm厚切片，行免疫組化染色。

2結(jié)果

2.1何首烏對大鼠認(rèn)知功能的影響

2.1.1定位航行實(shí)驗(yàn)隨著訓(xùn)練次數(shù)增多，各組大鼠逃避潛伏期均有不同程度縮短。與假手術(shù)組相比，VCI模型組大鼠的逃避潛伏期明顯延長(P<0.01)；而與VCI模型組相比，何首烏中劑量組、何首烏高劑量組大鼠逃避潛伏期明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。詳見表1。

表1　各組大鼠逃避潛伏期比較(±s) 　 s

2.1.2空間探索實(shí)驗(yàn)與假手術(shù)組相比，VCI模型穿越目標(biāo)象限時(shí)間明顯縮短(P<0.01)，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少(P<0.01)；與VCI模型組相比，何首烏中劑量組、何首烏高劑量穿越目標(biāo)象限時(shí)間明顯延長，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。詳見表2。

表2　各組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較(±s)

2.2各組大鼠海馬Bcl-2、Bax免疫組化結(jié)果Bcl-2、Bax免疫陽性細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，即免疫組化染色的陽性表達(dá)成分。VCI模型組陽性細(xì)胞著色增強(qiáng)，數(shù)量明顯增加，其中Bax變化更為顯著，Bcl-2/Bax的比值較假手術(shù)組明顯降低。何首烏高劑量組、何首烏中劑量組Bcl-2、Bax陽性細(xì)胞也有增加，著色增深，尤其Bcl-2變化顯著，Bcl-2/Bax的比值較假手術(shù)組明顯增高。何首烏低劑量組與VCI模型組比較無顯著意義(P>0.05)。詳見表3。

表3　各組大鼠海馬Bcl-2、

3討論

VCI是指由腦血管病危險(xiǎn)因素、明顯或不明顯的腦血管病引起的，從輕度認(rèn)知功能損害到癡呆的一大類綜合征，涵蓋了VCI從輕到重的整個(gè)發(fā)病過程。腦部微循環(huán)障礙導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡是其發(fā)生的共同通道[5]，主要病理變化是認(rèn)知相關(guān)腦區(qū)如額葉、顳葉、杏仁體、丘腦等處明顯的血管性病變、局灶性神經(jīng)元損傷和腦白質(zhì)損傷[6]。隨著年齡的增長，VCI的發(fā)病率和患病率有逐漸增加的趨勢[7]。

VCI屬中醫(yī)“呆病”范疇，基本病機(jī)是腎精虧虛、瘀血阻絡(luò)，治療當(dāng)以補(bǔ)腎填精、化瘀通竅為主。何首烏是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中常用來益智、抗衰老、改善記憶力的名貴中草藥。二苯乙烯苷是何首烏中特有的生物活性成分，其含量目前已經(jīng)成為何首烏藥材的專屬性指標(biāo)，其具有抗氧化、清除自由基、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化及促智等作用。相關(guān)研究表明，何首烏對丘腦神經(jīng)元有保護(hù)、改善學(xué)習(xí)記憶的作用[8]。

Bcl-2家族是細(xì)胞凋亡機(jī)制中重要的調(diào)節(jié)因子，Bcl-2、Bax是這一家族中重要成員，根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能分為凋亡抑制因子和促凋亡誘導(dǎo)因子，其中Bcl-2是最主要的凋亡抑制因子，而Bax是最主要的凋亡促進(jìn)因子[9]。Bcl-2基因是一種重要的內(nèi)源性抗凋亡因子，過度表達(dá)后可抑制由于氧自由基、興奮性氨基酸等誘發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。Bax為重要促凋亡基因，其誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制是Bax同源二聚體的形成，Bcl-2蛋白的抑制凋亡作用則要通過與Bax結(jié)合形成異源二聚體來實(shí)現(xiàn)[10]。

本實(shí)驗(yàn)行為學(xué)結(jié)果顯示，術(shù)后28 d VCI模型大鼠出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙，表現(xiàn)為逃離潛伏期的延長和在目標(biāo)象限中游泳時(shí)間的縮短以及穿越平臺(tái)次數(shù)的減少。而與VCI模型組相比，何首烏中劑量組、何首烏高劑量組大鼠逃避潛伏期明顯縮短，穿越目標(biāo)象限時(shí)間明顯延長，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加，表明中、高劑量何首烏對VCI模型大鼠的學(xué)習(xí)以及認(rèn)知能有一定改善作用。而在本實(shí)驗(yàn)中各組VCI大鼠造模28 d完成行為學(xué)試驗(yàn)后，海馬區(qū)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)顯著高于假手術(shù)組。而何首烏高劑量組、中劑量組與VCI模型組相比，Bcl-2蛋白表達(dá)增加的幅度明顯大于Bax蛋白，即雖然Bcl-2蛋白和Bax蛋白表達(dá)均升高，但Bcl-2蛋白增加的更為明顯，發(fā)揮了Bcl-2作為內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)物質(zhì)高表達(dá)后抑制神經(jīng)元凋亡的作用。本研究提示，何首烏通過調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)來抑制細(xì)胞凋亡，從而改善VCI大鼠的學(xué)習(xí)以及認(rèn)知能力。對臨床中延緩VCI向VD發(fā)展有著重要意義；同時(shí)對何首烏以及何首烏為主的傳統(tǒng)名方的挖掘、中藥治療慢性疾病以及新藥的開發(fā)都有著重要的指導(dǎo)意義。

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(本文編輯郭懷印)

The Influence of Polygonum on Learning and Memory Function in Rats with Vascular Cognitive Impairment

Wang Zhouyi，Xia Guangming，Zhou Gang，Xiao Zhanchi，Huang Huxiang，Chen Haote，Li Gang

Huanggang Central Hospital，Huanggang 438000，Hubei，China

Abstract：ObjectiveTo investigate the impact of polygonum on learning and memory function in rats with vascular cognitive impairment(VCI).MethodsForty-eight VCI model rats were randomly divided into four groups，namely polygonum high dose group，middle dose group，low dose group，VCI model groups.Another 12 sham-operated rats served as normal controls.After a successful modeling by gavage to rats is fed，fed a liquid temperature of 20 ℃，polygonum each treatment group were given different groups according to different concentrations of Polygonum solution mice in the model group，sham group were normal saline irrigation stomach，a total of 28 days.After 28 days the rats began to Morris water maze learning and memory ability behavioral tests，behavioral tests after the end of the line expression of Bcl-2 immunohistochemistry，Bax positive cells.ResultsCompared with the model group，escape latency was significantly shorter in polygonum middle dose group，high dose group(P<0.05 or P<0.01).The time of crossing the target quadrant was prolonged，the number of across the platform increased significantly(P<0.05 or P<0.01).After 28 days of modeling，the expressions of hippocampus Bcl-2 and Bax protein in each group was significantly higher than that in sham group.Compared with the model group，the magnitude of the increase Bcl-2 protein expression was significantly greater than the Bax protein in polygonum middle dose group，high dose group(P<0.05 or P<0.01).ConclusionPolygonum can inhibit apoptosis by regulating the Bcl-2，Bax protein expression，and improve the learning and cognitive ability in rats with VCI.

Key words：vascular dementia；polygonum；learning and memory function；Bcl-2；Bax

(收稿日期：2015-12-16)

Corresponding Author：Li Gang

中圖分類號(hào)：R749.1R285.6

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.09.011

文章編號(hào)：1672-1349(2016)09-0960-03

通訊作者：李鋼，E-mail：38449259@qq.com

基金項(xiàng)目：湖北省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No.2013CFC053)