尚粉青　張玎　趙朝　雷霆

710002 西安市第一醫(yī)院心內(nèi)三科(尚粉青、趙朝)；710068 西安,陜西省人民醫(yī)院血液科(張玎)；710061 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院心血管研究中心(雷霆)

?

·基礎(chǔ)研究·

替米沙坦通過調(diào)節(jié)Krüppel樣因子4的表達(dá)延緩心肌纖維化

尚粉青張玎趙朝雷霆

710002 西安市第一醫(yī)院心內(nèi)三科(尚粉青、趙朝)；710068 西安,陜西省人民醫(yī)院血液科(張玎)；710061 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院心血管研究中心(雷霆)

【摘要】目的研究SHR大鼠心肌Krüppel樣因子4(KLF4)及其相關(guān)因子變化，同時(shí)觀察替米沙坦治療后的效果。方法10周左右的SHR大鼠分別給予生理鹽水和替米沙坦10 mg·kg-1·d-1干預(yù)(WKY為對(duì)照組)。8周后測(cè)血壓，左室重量及左室重量指數(shù)評(píng)定左室肥厚情況；同時(shí)觀察心肌組織中KLF4、內(nèi)皮一氧化氮合酶(eNOS)及纖溶酶原激活抑制物-1(PAI-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物-1(TIMP-1)和Ⅳ型膠原的mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化。為進(jìn)一步明確其機(jī)制，用AngⅡ刺激內(nèi)皮細(xì)胞，同時(shí)測(cè)定KLF4的表達(dá)進(jìn)一步明確病理機(jī)制。結(jié)果SHR大鼠血壓、左室重量(LVW)及左室重量指數(shù)(LVW/BW)較WKY大鼠明顯增加(均為P<0.05)，替米沙坦可以顯著降低血壓，逆轉(zhuǎn)SHR大鼠的LVW及LVW/BW變化(均為P<0.01)。SHR大鼠KLF4、eNOS的mRNA及蛋白表達(dá)水平較WKY大鼠顯著降低(均為P<0.05)，而替米沙坦治療組KLF4的表達(dá)較SHR組明顯增加(均為P<0.05)；相反，SHR大鼠PAI-1、TIMP-1和Ⅳ型膠原的mRNA及蛋白水平較WKY大鼠明顯增加(均為P<0.05)，而替米沙坦治療后較SHR組明顯降低(均為P<0.05)。AngⅡ作用于內(nèi)皮細(xì)胞，eNOS的磷酸化明顯降低(2.37±0.22比1.57±0.31)(P<0.05)，同時(shí)PAI-1、TIMP-1和Ⅳ型膠原的表達(dá)明顯增加(均為P<0.05)，過表達(dá)KLF4可以使eNOS的磷酸化顯著回升(1.57±0.31比2.08±0.28)(P<0.05)，同時(shí)PAI-1、TIMP-1和Ⅳ型膠原的表達(dá)較AngⅡ作用下明顯減低(均為P<0.05)。結(jié)論KLF4在高血壓大鼠心肌心肌纖維化過程中發(fā)揮重要作用，替米沙坦降壓治療可以明顯延緩或逆轉(zhuǎn)此病理過程。

【關(guān)鍵詞】替米沙坦；高血壓；纖維化；Krüppel樣因子- 4

高血壓引起的心肌纖維化是高血壓性心臟病的重要病理過程。研究表明，在心肌纖維化過程中，心肌細(xì)胞增生及間質(zhì)纖維化與心肌血管的相對(duì)供血不足，是促進(jìn)心功能不全發(fā)生和發(fā)展的重要原因。在心肌纖維化過程中，心肌血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙起著重要的作用，特別是內(nèi)皮細(xì)胞纖溶酶原激活抑制物-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)及基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑的表達(dá)失平衡，從而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成增加，降解減少，細(xì)胞外基質(zhì)堆積，嚴(yán)重影響心臟功能。

肺Krüppel樣生長(zhǎng)因子4(Krüppel-like factor 4，KLF4)是鋅指Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一，在體內(nèi)多種組織廣泛分布[1]。在心血管疾病研究中發(fā)現(xiàn)，KLF4在血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞均有表達(dá)，在內(nèi)皮細(xì)胞過表達(dá)KLF4可以刺激抗炎和抗栓基因的表達(dá)，如eNOS 和血栓調(diào)節(jié)蛋白(thrombomodulin，TM)[2]。KLF4亦可以結(jié)合到平滑肌基因SM22a的啟動(dòng)子上來調(diào)節(jié)它的轉(zhuǎn)錄。但是其在心臟組織中特別是高血壓心肌纖維化的作用仍未見報(bào)道。本研究使用高血壓動(dòng)物模型，觀察KLF4及其相關(guān)因子在高血壓心肌組織中的表達(dá)變化及替米沙坦的影響，并進(jìn)一步明確其病理機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用8～10周SPF級(jí)雄性SHR和WKY大鼠(體重300～350 g)作為研究對(duì)象，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.1.2臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離與培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)本取自西安高新醫(yī)院婦產(chǎn)科孕婦足月正常娩出的臍帶組織。于無菌條件下獲得新生兒臍帶(長(zhǎng)約15～20 cm，無破損，無鉗夾痕跡)，置于冰的臍帶保鮮液(M199培養(yǎng)基 40%，100×AB/M 溶液 0.8%，1 mol/L HEPES溶液 0.4%，肝素鈉注射液 0.144%)中，6 h內(nèi)進(jìn)行HUVECs分離。0.1%的膠原酶灌注消化法分離HUVECs細(xì)胞。0.125%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)，取生長(zhǎng)良好的第2～3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.3藥物、試劑及儀器替米沙坦購自勃林格殷格翰制藥有限公司。主要試劑：AngⅡ購自Sigma公司；pAd-KLF4過表達(dá)腺病毒由西安交通大學(xué)心血管研究中心贈(zèng)予。PCR引物(KLF4、eNOS、PAI-1、TIMP-1、Ⅳ型膠原)：生工(上海)有限公司合成。β-actin抗體及Ⅳ型膠原抗體購自Santa Cruz公司；eNOS抗體、phospho-eNOS(S1177)抗體、caspase-1抗體及TIMP-1抗體均購自美國(guó)Cell Signaling公司；PAI-1購自Abcam公司。蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑(德國(guó)Roche公司)，ECL發(fā)光液(Vazyme公司，Millipore公司)，Trizol 試劑(Invitrogen公司)，HiScriptTMqPCR SuperMix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Vazyme公司)，PCR DNA聚合酶(Vazyme公司)，其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。主要儀器： ALC無創(chuàng)鼠尾動(dòng)脈血壓測(cè)定系統(tǒng)(上海奧爾科特生物科技有限公司)，實(shí)時(shí)定量PCR儀及梯度PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems 公司)，WB電泳儀和電泳槽、WB半干轉(zhuǎn)膜槽(BIO-RAD公司)，自動(dòng)洗片機(jī)(柯達(dá)公司)。

1.2方法1.2.1動(dòng)物分組及處理20只10周左右的SHR大鼠(WKY大鼠10只作對(duì)照組)，適應(yīng)環(huán)境1周后測(cè)定鼠尾動(dòng)脈血壓。隨機(jī)分成高血壓組及替米沙坦治療組；替米沙坦組給予替米沙坦10 mg·kg-1·d-1每天灌胃治療，WKY及SHR 組給予生理鹽水。療程8周，其中4周末、8周末均測(cè)定鼠尾動(dòng)脈血壓。8周末，血壓測(cè)定完畢后。CO2麻醉的方法處死大鼠，取其心尖部心臟組織，液氮快速冰凍，-80℃保存?zhèn)溆?。所有試?yàn)操作已得到西安市第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。1.2.2血壓、體重、左室重量測(cè)定用尾袖法測(cè)鼠尾動(dòng)脈收縮壓。先將大鼠用配套的固定器固定，建議30℃先加熱5 min，再將鼠尾套入脈搏感應(yīng)器內(nèi)。打開配套生理記錄儀或相關(guān)軟件，監(jiān)測(cè)脈搏，待出現(xiàn)平穩(wěn)脈搏后，充氣加壓使之超過收縮壓30 mmHg(壓力達(dá)到收縮壓水平時(shí)脈搏搏動(dòng)消失，據(jù)此判斷)，然后緩慢減壓，經(jīng)壓力換能器和放大器連接于生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄血壓。每只鼠連續(xù)測(cè)量收縮壓3次，間隔60 s，取其平均值。大鼠處死后，迅速開胸取心臟，用冰生理鹽水沖洗干凈，去除大血管、右室及左右心房，濾紙吸干水分，左心室稱重為L(zhǎng)VW，測(cè)左室重量指數(shù)(LVW/BW)來評(píng)價(jià)左室肥厚(LVH)程度。

1.2.3Western Blot分析取心尖部心臟組織40 g/只，剪碎組織，加入蛋白裂解液約300 ml，勻漿機(jī)勻漿，3次，每次30 s；液氮凍融3次，4℃，12 000 r/min，離心15 min，取上清，ABC法測(cè)定蛋白濃度。加入上樣緩沖液，95℃，8 min蛋白變性。10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳(上層膠30 mA，30 min；下層膠50 mA，90 min)，轉(zhuǎn)膜(230 mA，2 h)，5%的脫脂牛奶(TTBS配制)封閉1 h，孵一抗4℃過夜，TTBS洗3遍，每遍5 min；孵二抗，室溫1 h；ECL發(fā)光，自動(dòng)洗片機(jī)洗片。標(biāo)定Marker，進(jìn)行掃描和分析。

1.2.4Real time-PCR取心尖部心臟組織30 g，剪碎組織，加入Trizol提取RNA，RNA濃度采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)。取心肌組織2 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(參照HiScriptTMqPCR SuperMix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書)。逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)(參照TaqMan universal PCR Master Mix說明書)。PCR引物序列見表1。

表1　實(shí)時(shí)定量PCR引物序列

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.13組大鼠血壓、BW、LVW及LVW/BW的比較

治療前SHR大鼠血壓顯著高于WKY組大鼠血壓(P<0.01)，給予替米沙坦治療過程中可見SHR大鼠血壓逐漸下降，在4周末測(cè)血壓已經(jīng)明顯下降(P<0.01)，8周末較4周末又有輕度下降(P<0.01)。見圖1。SHR大鼠LVW及LVW/BW較WKY大鼠明顯增加，替米沙坦可以明顯逆轉(zhuǎn)SHR大鼠的LVW及LVW/BW變化。見表2。

圖1　3組大鼠實(shí)驗(yàn)過程中血壓變化及8周末血壓對(duì)比(WKY組n=10，SHR組n=10，SHR+替米沙坦組n=9)

組別只數(shù)BW(g)LVW(mg)LVW/BW(mg/g)WKY9332.52±12.54695.21±62.542.09±0.37SHR8326.45±32.65966.48±78.28a2.96±0.35aSHR+替米沙坦9306.65±13.59760.52±58.31b2.48±0.27b

注：與WKY組相比，aP<0.05；與SHR組相比,bP<0.05

2.23組大鼠心肌組織KLF4及其相關(guān)因子的mRNA水平表達(dá)變化

SHR大鼠KLF4、eNOS的mRNA表達(dá)水平較WKY大鼠顯著降低，而替米沙坦治療組KLF4的表達(dá)較SHR組明顯增加；相反，SHR大鼠PAI-1、TIMP-1和Ⅳ型膠原的mRNA表達(dá)水平較WKY大鼠明顯增加，而替米沙坦治療后較SHR組明顯降低。見圖2。

2.33組大鼠心肌組織KLF4及其相關(guān)因子的蛋白水平表達(dá)變化

SHR大鼠KLF4、eNOS的蛋白表達(dá)水平較WKY大鼠顯著降低，SHR大鼠PAI-1、TIMP-1和Ⅳ型膠原的蛋白表達(dá)水平較WKY大鼠明顯增加，而替米沙坦治療后KLF4、eNOS的蛋白表達(dá)較SHR大鼠顯著增加，PAI-1、TIMP-1和Ⅳ型膠原的蛋白表達(dá)水平明顯降低。見圖3。

2.4過表達(dá)pAd-KLF4可以逆轉(zhuǎn)Ang Ⅱ 對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用

Western結(jié)果顯示Ang Ⅱ 可以使內(nèi)皮細(xì)胞eNOS的磷酸化明顯降低，同時(shí)PAI-1、TIMP-1和Ⅳ型膠原的表達(dá)明顯增加；過表達(dá)pAd-KLF4可以使eNOS的磷酸化顯著回升，同時(shí)PAI-1、TIMP-1和Ⅳ型膠原的表達(dá)較單純Ang Ⅱ 作用下明顯減低。上述結(jié)果表明，KLF4所致內(nèi)皮功能障礙在心肌纖維化過程中起重要作用。見圖4。

3討論

近年研究報(bào)道，KLF4具有抗炎、保護(hù)內(nèi)皮、抗凝血防止血栓形成等功能。減少KLF4的表達(dá)可以增加腫瘤壞死因子-α(TNF-α)刺激產(chǎn)生的血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)和組織因子[2]。在一項(xiàng)研究中，內(nèi)皮細(xì)胞過表達(dá)KLF4可明顯降低TNF-α導(dǎo)致的E-選擇素和VCAM-1的表達(dá)[3]。同時(shí)KLF4抑制PAI-1的表達(dá)，有明確的抗凝作用。在平滑肌細(xì)胞，有研究證明，KLF4可以抑制某些特異基因(SM22α，αSAM等)的表達(dá)從而調(diào)控血管平滑肌的表型[4-5]。本研究亦證實(shí)，在心肌組織KLF4減少的情況下PAI-1表達(dá)明顯增多，而PAI-1對(duì)TIMP-1有明確的抑制作用，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)增生及纖維化進(jìn)程。而對(duì)于KLF4在心肌纖維化中的詳細(xì)機(jī)制，本研究主要針對(duì)其在血管內(nèi)皮細(xì)胞上作用做了部分探討，高血壓引起的RAS系統(tǒng)的激活，使循環(huán)及局部的AngⅡ濃度均升高，AngⅡ可以明顯降低KLF4的表達(dá)，從而PAI-1等表達(dá)增加，細(xì)胞外基質(zhì)成分增加。過表達(dá)KLF4可明顯逆轉(zhuǎn)此效應(yīng)。

與WKY組相比，aP<0.05，bP<0.01；與SHR組相比，cP<0.05圖2　3組大鼠心肌組織KLF4及其相關(guān)因子的mRNA表達(dá)變化(WKY組n=10，SHR組n=10，SHR+替米沙坦組n=9)

與WKY組相比，aP<0.05，bP<0.01；與SHR組相比，cP<0.05圖3　3組大鼠心肌組織KLF4及其相關(guān)因子的蛋白表達(dá)變化(WKY組n=10，SHR組n=10，SHR+替米沙坦組n=9)

與WKY組相比，aP<0.05；與SHR組相比，bP<0.05圖4　過表達(dá)KLF4可以逆轉(zhuǎn)AngⅡ?qū)?nèi)皮細(xì)胞的損傷作用

本研究證實(shí)，替米沙坦減輕心肌纖維化是與KLF4的表達(dá)變化有關(guān)，過表達(dá)KLF4可以明顯減少PAI-1等的表達(dá)，減輕細(xì)胞外基質(zhì)集聚。研究表明，層流切應(yīng)力及他汀類藥物可以促進(jìn)KLF4的表達(dá)[6-7]，層流切應(yīng)力通過磷脂酰肌醇-3-激酶調(diào)節(jié)KLF4的表達(dá)，同時(shí)又可以通過AMPK依賴的MEK5/ERK5/MEF2通路誘導(dǎo)KLF4的表達(dá)。有報(bào)道替米沙坦可以磷酸化AMPK，其是否通過AMPK途徑誘導(dǎo)KLF4表達(dá)仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

總之，高血壓治療的主要目標(biāo)即減輕其心腦血管并發(fā)癥。本研究初步在組織水平上觀察了替米沙坦對(duì)高血壓心肌纖維化的有效緩解及其相關(guān)機(jī)制。因此，積極合理應(yīng)用藥物減緩心肌纖維化、使受損的左心室收縮和舒張功能得以改善，從而降低各種心血管病并發(fā)癥的發(fā)生率和死亡率，改善高血壓患者的預(yù)后，有著重大的臨床價(jià)值。

利益沖突：無

參考文獻(xiàn)

[1] Pearson R，F(xiàn)leetwood J，Eaton S，et al.Kruppel-like transcription factors: a functional family [J].Int J Biochem Cell Biol，2008，40(10)：1996-2001.DOI:10.1016/j.biocel.2007.07.018.

[2] Hamik A，Lin Z，Kumar A，et al.Kruppel-like factor 4 regulates endothelial inflammation[J].J Biol Chem，2007，282(18)：13769-13779. DOI:10.1074/jbc.M700078200.

[3] Methe H，Balcells M，Alegret Mdel C，et al.Vascular bed origin dictates flow pattern regulation of endothelial adhesion molecule expression[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，292(5)：H2167-2175.DOI:10.1152/ajpheart.00403.2006.

[4] Liu Y，Sinha S，McDonald OG，et al.Kruppel-like factor 4 abrogates myocardin-induced activation of smooth muscle gene expression[J].J Biol Chem，2005，280(10)：9719-9727.DOI:10.1074/jbc.M412862200.

[5] King KE，Iyemere VP，Weissberg PL，et al.Kruppel-like factor 4 (KLF4/GKLF) is a target of bone morphogenetic proteins and transforming growth factor beta 1 in the regulation of vascular smooth muscle cell phenotype[J].J Biol Chem，2003，278(13)：11661-11669.DOI:10.1074/jbc.M211337200.

[6] 向仕釗,卞洲艷,周恒,等.比索洛爾聯(lián)合還原型谷胱甘肽改善應(yīng)激性心肌病心肌重構(gòu)[J].中國(guó)心血管雜志,2015,20(5): 358-365.DOI:10.3969/j.issn.1007-5410.2015.05.011.

Xiang SZ,Bian ZY,Zhou H，et al.Combined utilization of bisoprolol and glutathione attenuates ventricular remodeling of takotsubo cardiomyopathy in mice[J].Chin J Cardiovasc Med,2015,20(5): 358-365.DOI:10.3969/j.issn.1007-5410.2015.05.011.

[7] Maejima T，Inoue T，Kanki Y，et al.Direct evidence for Pitavastatin induced chromatin structure change in the KLF4 gene in endothelial cell[J].PLoS One，2014，9(6)：e96005.DOI:10.1371/journal.pone.0096005.

(本文編輯：周白瑜)

Telmisartan reverses myocardial fibrosis by regulating the expression of Krüppel-like factor 4

ShangFenqing，ZhangDing，ZhaoZhao，LeiTing

DepartmentofCardiology，NO. 1HospitalofXI′ANCity，Xi′an710002，China(ShangFQ，ZhaoZ)；DepartmentofHematology，ShaanxiProvincialPeople′sHospital，Xi′an710068，China(ZhangD)；CardiovascularResearchCenter，MedicalSchool，Xi′anJiaotongUniversity，Xi′an，710061，China(LeiT)

【Abstract】ObjectiveTo explore the change and the effect of telmisartan on Krüppel-like factor 4 and its related factors in SHR rats myocardial fibrosis. MethodsTen-week-old male SHR rats were fed standard chow diet and treated with telmisartan (10 mg·kg-1·day-1) for 8 weeks，while WKY rats are used as control，fed standard chow diet and treated with normal saline. Systolic arterial pressure was measured by tail-cuff plethysmography. The left ventricular weight and left ventricular mass index were used to evaluate the ventricular hypertrophy. At the same time，we observed the changes of mRNA and protein of KLF4，endothelial nitric oxide synthase (eNOS)，plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1)，matrix metalloproteinase inhibitor-1 (TIMP-1) and collagen type Ⅳ in the myocardial tissue. ResultsThe blood pressure，left ventricular mass (LVW) and left ventricular mass index (LVW/BW) of SHR rats increased significantly comparing with WKY rats，telmisartan can significantly reduce blood pressure，LVW and LVW/BW. The mRNA and protein levels of KLF4 and eNOS of SHR rats decreased significantly than that in WKY rats，while telmisartan increased their level. The mRNA and protein level of PAI-1，TIMP-1 and Collagen type Ⅳ of SHR rats increased significantly than that in WKY rats，whereas telmisartan eliminated these effect. Overexpression KLF4 in endothelial cell can reverse the effect of AngⅡ. ConclusionsKLF4 plays an important role in the process of myocardial fibrosis，telmisartan treatment can significantly slow or reverse the pathological process through KLF4.

【Key words】Telmisartan;Hypertension;Fibrosis;Krüppel-like factor 4

(收稿日期:2015-10-12)

Corresponding author：Shang Fenqing，Email：shangfenqing@163.com

DOI：10.3969/j.issn.1007-5410.2016.02.013

通訊作者：尚粉青，電子信箱：shangfenqing@163.com