黎先偉 譯

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藍(lán)耳病病毒（PRRSV）實(shí)驗(yàn)室診斷所面臨的挑戰(zhàn)

By Katarzyna Podgórska

黎先偉 譯

自從1996年暴發(fā)以來(lái)，豬繁殖與呼吸綜合癥病毒（豬藍(lán)耳病病毒，PRRSv）感染的臨床表現(xiàn)越來(lái)越復(fù)雜多樣，而且現(xiàn)在的感染主要以多種病原混合感染為主，這使得我們難以通過(guò)剖檢和肉眼病變做出準(zhǔn)確的判斷，因此，對(duì)于豬藍(lán)耳病病毒（PRRSv）的診斷必須通過(guò)實(shí)驗(yàn)室的分子生物學(xué)等檢測(cè)手段來(lái)進(jìn)行核實(shí)。隨著技術(shù)的發(fā)展，豬藍(lán)耳病病毒（PRRSv）的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)有了更多的選擇，不過(guò)目前最常用于豬藍(lán)耳病病毒（PRRSv）抗體和抗原的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)分別是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）。

如何選擇一個(gè)合適的診斷方法，取決于診斷的目標(biāo)。其中特異性高的診斷方法適用于監(jiān)測(cè)豬藍(lán)耳病病毒（PRRSv）陰性群體，而對(duì)公豬精液的檢測(cè)則需要在感染的早期階段采用敏感性極高的診斷方法。在制定和執(zhí)行豬藍(lán)耳?。≒RRS）的防控計(jì)劃中，最好是采用ELISA 和RT-PCR相結(jié)合的方法，并進(jìn)行DNA序列的分析，以全面的監(jiān)控豬場(chǎng)豬藍(lán)耳病病毒（PRRSv）的動(dòng)態(tài)變化。每個(gè)養(yǎng)豬場(chǎng)都必須根據(jù)豬藍(lán)耳病病毒（PRRSv）的診斷目標(biāo)、豬場(chǎng)的規(guī)模和養(yǎng)殖模式來(lái)單獨(dú)地制定采樣計(jì)劃。簡(jiǎn)單的來(lái)說(shuō)，我們判斷一個(gè)豬場(chǎng)是否感染豬藍(lán)耳病病毒（PRRSv），一般可通過(guò)ELISA的方法檢測(cè)10至20份育肥豬的血清來(lái)回答。要想詳細(xì)分析一點(diǎn)飼養(yǎng)或多點(diǎn)飼養(yǎng)生產(chǎn)系統(tǒng)中豬藍(lán)耳病病毒（PRRSv）的循環(huán)（感染）狀態(tài)，那么則需要采集大量的具有代表性的不同日齡（包括保育豬、生長(zhǎng)豬和育肥豬）的豬群，以及一個(gè)生長(zhǎng)系統(tǒng)中所有不同位置的樣品，因?yàn)樗鼈兛赡艽碇粋€(gè)獨(dú)立的病毒生態(tài)系統(tǒng)。

要想解釋血清轉(zhuǎn)換或在一個(gè)使用豬藍(lán)耳病活疫苗的養(yǎng)豬場(chǎng)中進(jìn)行病毒的檢測(cè)具有一定的難度，這主要是因?yàn)椋?）目前市場(chǎng)上沒(méi)有標(biāo)記疫苗；（2）疫苗毒會(huì)在使用活疫苗的養(yǎng)豬場(chǎng)內(nèi)長(zhǎng)期存在；（3）至少在一段時(shí)間內(nèi)疫苗毒與野毒會(huì)在豬場(chǎng)內(nèi)共存。在這樣的養(yǎng)豬場(chǎng)中，對(duì)不同日齡的豬群檢測(cè)所獲的核酸進(jìn)行DNA序列分析，以便更充分的認(rèn)識(shí)豬場(chǎng)內(nèi)豬藍(lán)耳病病毒（PRRSv）的循環(huán)（感染）狀態(tài)。

基于酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）的血清學(xué)診斷方法操作起來(lái)十分簡(jiǎn)便，而且具有較好的特異性和敏感性，適用于一個(gè)群體的基礎(chǔ)檢測(cè)。不過(guò)，個(gè)別的血清樣品，尤其是育肥豬有可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性的情況。這對(duì)于豬藍(lán)耳病病毒（PRRSv）陰性群體的監(jiān)測(cè)來(lái)說(shuō)可能會(huì)造成一定的困擾，因此，對(duì)于這種情況需要采用不同的檢測(cè)方法來(lái)重新檢測(cè)樣品（包括免疫過(guò)氧化物酶單層試驗(yàn)（IPMA）、間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）或另一些特異性更高的ELISA試驗(yàn)）；或者2至3周后重新采集豬群樣品進(jìn)行檢測(cè)。ELISA性能的這一方面很少解決診斷能力的評(píng)價(jià)。如果一個(gè)ELISA檢測(cè)試劑盒的敏感性較低的話一般可通過(guò)增加檢測(cè)樣品數(shù)來(lái)克服；不過(guò)其特異性較低的話則往往需要額外的工具來(lái)協(xié)助做出正確的診斷。

一般來(lái)說(shuō)，任何一個(gè)ELISA檢測(cè)試劑盒通常只用于針對(duì)一種豬藍(lán)耳病病毒（PRRSv）基因型的抗體進(jìn)行檢測(cè)，而這種只針對(duì)一種豬藍(lán)耳病病毒（PRRSv）基因型的抗原所研發(fā)的ELISA試劑盒通常對(duì)另一種基因型的豬藍(lán)耳病病毒（PRRSv）的敏感性較低。眾所周知，豬藍(lán)耳病病毒（PRRSv）主要分成兩種基本的基因型，即歐洲型和美洲型。目前，美洲型豬藍(lán)耳病病毒（PRRSv）是造成全球暴發(fā)高致病性豬藍(lán)耳病的主要基因型，美洲型的毒力要比歐洲型的更強(qiáng)。不過(guò)，隨著豬藍(lán)耳病病毒（PRRSv）的變異，歐洲型豬藍(lán)耳病病毒（PRRSv）在歐洲一些國(guó)家的發(fā)病率有所上升，而且造成較嚴(yán)重的臨床癥狀。陸續(xù)有報(bào)道在我國(guó)分離到歐洲型豬藍(lán)耳病病毒（PRRSv），這需要引起我們高度的重視。此外，目前也有試劑盒能夠?qū)煞N基因型病毒的血清轉(zhuǎn)化進(jìn)行區(qū)分，不過(guò)需要注意的是，由于兩者之間只有很少的血清交叉反應(yīng)，因此用這種方法所獲的的結(jié)果需謹(jǐn)慎對(duì)待。從目前來(lái)說(shuō)，人們普遍推薦采用辨別式PCR來(lái)對(duì)養(yǎng)豬場(chǎng)內(nèi)兩種不同基因型豬藍(lán)耳病病毒（PRRSv）的混合感染進(jìn)行診斷。

逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)病毒核酸的原理是，針對(duì)豬藍(lán)耳病病毒（PRRSv）的一個(gè)特定的基因組片段設(shè)計(jì)一段可互補(bǔ)性結(jié)合的寡核苷酸（引物），并在特定條件下通過(guò)酶促反應(yīng)將微量的待測(cè)病毒成倍放大。目前，實(shí)驗(yàn)室最為常用的檢測(cè)方法是實(shí)時(shí)定量PCR，其是通過(guò)監(jiān)測(cè)與特定序列結(jié)合的DNA探針?biāo)l(fā)出的信號(hào)，判斷待檢病毒的擴(kuò)增情況?？紤]到這種反應(yīng)的特性，這樣的信號(hào)也可能出現(xiàn)在缺失的病毒序列中，特別在聚合酶鏈反應(yīng)的后期常有發(fā)生，這可能導(dǎo)致類(lèi)似于弱陽(yáng)性的結(jié)果。

然而，有關(guān)RT-PCR檢測(cè)方法所主要關(guān)注的問(wèn)題是病毒較高的遺傳多樣性，這可能會(huì)導(dǎo)致核苷酸序列突變的累積（包括引物序列或探針結(jié)合部位），從而出現(xiàn)假陰性的情況。OIE參考實(shí)驗(yàn)室對(duì)市場(chǎng)上的RT-PCR試劑盒進(jìn)行比較分析（Podgorska et al.， 2015），結(jié)果表明一些商業(yè)化的RT-PCR試劑盒不能檢測(cè)出大多數(shù)基因1型的豬藍(lán)耳病病毒（PRRSv），這些病毒主要起源于東歐。由于源自東歐的基因1型豬藍(lán)耳病病毒（PRRSv）的有效序列十分有限，因此，目前這種方法使用的大多數(shù)引物和探針都是以基因2型和基因1型1亞型的經(jīng)典株為基礎(chǔ)，而2-4亞型的東歐毒株從遺傳角度來(lái)看具有較大的差異（Stadejek et al. 2013）。而且，相關(guān)研究已證實(shí)，其中一些東歐的豬藍(lán)耳病病毒（PRRSv）要比目前在西歐和中歐流行的毒株毒力更強(qiáng)，因此我們應(yīng)該對(duì)這種毒株給予更多的關(guān)注，以確保能夠早期檢測(cè)出它們向外蔓延的情況。

到目前為止，沒(méi)有任何一種RT-PCR的檢測(cè)方法可推薦作為一種通用的檢測(cè)方法，以用于檢測(cè)所有的豬藍(lán)耳病病毒（PRRSv）且具有最佳的靈敏度?？偟膩?lái)說(shuō)，上述的內(nèi)容強(qiáng)調(diào)了，對(duì)于目前豬藍(lán)耳病病毒（PRRSv）的流行毒株來(lái)說(shuō)，全面評(píng)估目前使用的檢測(cè)方法及其不斷重新驗(yàn)證的必要性。對(duì)此，豬藍(lán)耳病（PRRS）參考實(shí)驗(yàn)室已開(kāi)始盡可能多的收集具有代表性的豬藍(lán)耳病病毒（PRRSv），以覆蓋病毒的遺傳多樣性，這是這些參考實(shí)驗(yàn)室目前最重要的工作之一，從而更全面的監(jiān)測(cè)和了解豬藍(lán)耳病病毒（PRRSv）的流行動(dòng)態(tài)和變異情況。

備注：

1）抗體的檢測(cè)

ELISA：

結(jié)果呈陽(yáng)性：（1）感染豬藍(lán)耳病病毒（疫苗毒或野毒）；（2）母源抗體（持續(xù)3至5周），未感染豬藍(lán)耳病病毒；（3）非特異性抗體與檢測(cè)板上的抗原相結(jié)合，為感染豬藍(lán)耳病病毒；（4）外源性的豬藍(lán)耳病病毒抗體（僅唾液）。

結(jié)果呈陰性：（1）未感染豬藍(lán)耳病病毒；（2）剛感染豬藍(lán)耳病病毒，但抗體尚未產(chǎn)生（小于9天）；（3）抗體的含量很低未能檢測(cè)出；（4）感染期結(jié)束，呈血清反應(yīng)陰性；（5）持續(xù)感染豬群，但呈血清反應(yīng)陰性；（6）對(duì)非常特異的病毒株所產(chǎn)生的抗體檢測(cè)失敗。

2）抗原的檢測(cè)

PCR：

結(jié)果呈陽(yáng)性：（1）感染豬藍(lán)耳病病毒（疫苗毒或野毒）；（2）存在非傳染性病毒感染；（3）樣品污染，豬群未感染病毒。

結(jié)果呈陰性：（1）不存在病毒RNA；（2）病毒的含量很低未能檢測(cè)出；（3）樣品降解不能檢出病毒；（4）引物或探針不匹配不能檢出病毒；（5）樣品中檢測(cè)不到病毒RNA，但豬群持續(xù)感染病毒；（6）樣品中檢測(cè)不到病毒RNA，但豬群呈隱形帶毒感染。