顧磊，蔣春暉，孫隆慈，劉曄，周鴻，許春杰，徐慶

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院 胃腸外科，上海 200127）

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1，25（OH）2D3體外抑制小鼠Th17細(xì)胞分化的作用研究

顧磊，蔣春暉，孫隆慈，劉曄，周鴻，許春杰，徐慶

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院 胃腸外科，上海 200127）

［摘 要］目的 探討1，25（OH）2D3對(duì)Th17細(xì)胞分化的體外抑制作用。方法 通過(guò)對(duì)分離出的脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行CD4+T細(xì)胞分選，將不同濃度的1，25（OH）2D3加入到CD4+T細(xì)胞中并在誘導(dǎo)因子的作用下誘導(dǎo)其分化。通過(guò)ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL-17A和IL-22的濃度；流式細(xì)胞儀分析Th17細(xì)胞的比例及RT-PCR檢測(cè)Th17細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。結(jié)果 培養(yǎng)上清ELISA檢測(cè)顯示：與對(duì)照組相比，1，25（OH）2D3組的IL-17A和IL-22濃度隨著加入1，25（OH）2D3濃度的增大而呈現(xiàn)逐漸降低的現(xiàn)象，差異且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；流式結(jié)果顯示：誘導(dǎo)分化后對(duì)照組Th17細(xì)胞比例最多，1，25（OH）2D3組處理后Th17細(xì)胞比例降低，且呈劑量依賴性；RTPCR檢測(cè)顯示：與對(duì)照組相比，1，25（OH）2D3組IL-17A、IL-22，RORγt和RORα表達(dá)量隨著劑量的增加而逐漸降低，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論 體外實(shí)驗(yàn)表明，1，25（OH）2D3具有抑制Th17細(xì)胞分化的作用，表現(xiàn)為Th17細(xì)胞比例、分泌的細(xì)胞因子及特異的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)均減少。

［關(guān)鍵詞］肝纖維化；1，25-二羥基維生素D3；Th17；小鼠

眾所周知，1，25（OH）2D3在免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖和分化、抗纖維化等各種生物過(guò)程中可發(fā)揮重要作用［1］。1，25（OH）2D3可抑制免疫細(xì)胞的增殖和免疫球蛋白的產(chǎn)量，且能阻止B細(xì)胞前體細(xì)胞分化成漿細(xì)胞［2］。此外，1，25（OH）2D3抑制T細(xì)胞的增殖，特別是Th1細(xì)胞產(chǎn)生干擾素和IL-2的能力，激活巨噬細(xì)胞和Th17細(xì)胞產(chǎn)生IL-17和IL-22［3-4］。近年來(lái)，越來(lái)越多的文獻(xiàn)報(bào)道指出，1，25（OH）2D3在治療各種免疫疾病中與其調(diào)節(jié)獲得性免疫密切相關(guān)。Correale等［5］發(fā)現(xiàn)，1，25（OH）2D3在治療多發(fā)性硬化癥的過(guò)程中，在維持T細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)定方面起著重要的作用。在活化和靜止的T細(xì)胞中，1，25（OH）2D3誘導(dǎo)維生素D3受體（vitamin D receptor，VDR）的表達(dá)且大量抑制新鮮分離的CD4+T細(xì)胞和特異性髓鞘堿性蛋白T細(xì)胞的增殖。而且1，25（OH）2D3提高IL-10進(jìn)行性細(xì)胞的發(fā)育，并減少IL-6和IL-17分泌細(xì)胞的數(shù)量。最后，1，25（OH）2D3增加吲哚胺2，3-二氧酶的基因表達(dá)和生物活性，并顯著調(diào)節(jié)增加Treg細(xì)胞的數(shù)量。Takeda等［6］發(fā)現(xiàn)，口服1，25（OH）2D3可以通過(guò)改變樹(shù)突狀細(xì)胞和Treg的功能與分化，來(lái)防止動(dòng)脈粥樣硬化病情的發(fā)展。Tang等［7］發(fā)現(xiàn)，1，25（OH）2D3通過(guò)抑制Th17反應(yīng)來(lái)抑制固有免疫應(yīng)答，包括樹(shù)突狀細(xì)胞支持Th17細(xì)胞引發(fā)的能力、將CD4+T細(xì)胞變?yōu)門h17細(xì)胞群的能力和Th17細(xì)胞產(chǎn)生IL-17的能力。Chang等［8］證明，在體外1，25（OH）2D3通過(guò)維生素D3受體信號(hào)抑制產(chǎn)生IL-17的Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的分化。1，25（OH）2D3通過(guò)減少IL-2的數(shù)量來(lái)調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞的產(chǎn)生，但對(duì)Th17細(xì)胞無(wú)效。1，25（OH）2D3通過(guò)抑制Th17細(xì)胞的分化和遷移來(lái)防止實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的發(fā)生、發(fā)展。顯然，這些研究似乎都與1，25（OH）2D3抑制Th17細(xì)胞有關(guān)，其主要的作用機(jī)制可能就是通過(guò)對(duì)Th17的抑制來(lái)影響獲得性免疫相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1，25（OH）2D3對(duì)可能是通過(guò)抑制Th17細(xì)胞和Th1細(xì)胞的增殖來(lái)發(fā)揮其對(duì)肝纖維化的治療作用。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谘芯矿w外1，25（OH）2D3對(duì)Th17細(xì)胞分化的抑制作用。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：8周齡健康C57小鼠30只，購(gòu)于常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，由仁濟(jì)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供喂養(yǎng)條件，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)階段。1.1.2 主要試劑：1，25（OH）2D3，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Trizol試劑，美國(guó)Invitrogen公司；刺激劑混合物（PMA/Ionomycin/Brefeldin A/Monensin）、重組人細(xì)胞因子（TGF-β、IL-6、IL-1β），以色列ProSpec公司；Percoll分離液，天津TBD公司；RPMI1640培養(yǎng)液，美國(guó)Hyclone公司；CD4、IL-17A、IL-2、CD3/CD28、IFN-γ一抗，英國(guó)Abcam公司；ELISA試劑盒（IL-22、IL-17A），BIOSH公司；SYBRGreen PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，美國(guó)Thermo公司，CD4+T細(xì)胞分選試劑盒，美國(guó)Selleck公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化：無(wú)菌條件下，剖取小鼠脾臟組織；研磨后200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，離心5 min，收集細(xì)胞；8 mL PBS重懸細(xì)胞沉淀，將細(xì)胞懸液與40%的分離液混合，緩慢加到70%分離液上，離心20 min；吸取兩層溶液之間的白細(xì)胞就能獲得淋巴細(xì)胞；磁珠分選初始CD4+T細(xì)胞（按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作）；用含10%的胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)CD4+T細(xì)胞，加入抗人CD3/CD28單抗、抗人IL-2、IFN-γ單抗和重組人細(xì)胞因子（TGF-β、IL-6、IL-1β），分為4組：對(duì)照組、1，25（OH）2D3低劑量組（1×10-9mol/L）、1，25（OH）2D3中劑量組（1×10-8mol/L）、1，25（OH）2D3高劑量組（1× 10-7mol/L），培養(yǎng)過(guò)程中按照以上分組加入等量不同濃度的的1，25（OH）2D3，對(duì)照組加入等量的PBS液；5 d后收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清備用。

1.2.2流式細(xì)胞儀分析：將制備的各組脾臟淋巴細(xì)胞加入RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)；加入終濃度為2 μL/mL的刺激劑混合物，恒溫孵育5 h；取100 μL分配流式管內(nèi)，加入5 μL的CD4 mAb，避光30 min；樣品加入固定破膜劑，避光30 min；洗滌2次，樣品中加入5 μL IL-17A mAb，避光孵育30 min；洗滌2次，24 h上機(jī)檢測(cè)各組Th17細(xì)胞比例。

1.2.3細(xì)胞上清ELISA檢測(cè)：根據(jù)試劑盒要求，用ELLSA法檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中IL-17A和IL-22的濃度。

1.2.4RT-PCR：采用Trizol法抽提中RNA；逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA；RT-PCR擴(kuò)增；數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件（ABI Prism 7500 SDS Software）分析，對(duì)RORγt與RORα的表達(dá)量進(jìn)行相對(duì)定量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Origin 6.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料用（±s）來(lái)表示，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.11，25（OH）2D3對(duì)Th17細(xì)胞分化的影響

圖1為Th17細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中不同濃度1，25（OH）2D3作用后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th17細(xì)胞比例。從結(jié)果可以看出，無(wú)1，25（OH）2D3干預(yù)時(shí)（對(duì)照組），Th17細(xì)胞比例最高（62.9%），當(dāng)1，25（OH）2D3干預(yù)后，Th17細(xì)胞比例降低，并且具有劑量效應(yīng)，即Th17細(xì)胞比例隨著1，25（OH）2D3干預(yù)濃度增加而逐漸減少。

2.21，25（OH）2D3影響細(xì)胞因子的分泌

圖1　1，25（OH）2D3對(duì)Th17細(xì)胞誘導(dǎo)分化的干預(yù)

Th17細(xì)胞可特征性分泌IL-17，同時(shí)也分泌IL-22炎癥性細(xì)胞因子，對(duì)兩種細(xì)胞因子的檢測(cè)結(jié)果（圖2）顯示：與對(duì)照組相比，1，25（OH）2D3作用下IL-17A和IL-22的表達(dá)減少，隨著1，25（OH）2D3濃度逐漸升高呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞因子的mRNA水平

RT-PCR結(jié)果（圖3）顯示：細(xì)胞因子IL-17A和IL-22的mRNA水平變化與ELISA檢測(cè)結(jié)果一致，即兩者mRNA在對(duì)照組中表達(dá)最高，隨著1，25（OH）2D3作用濃度的增加，IL-17A和IL-22的mRNA表達(dá)逐漸降低，并且具有顯著差異（P＜0.01）。RORγt與RORα是Th17細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子，在對(duì)照組中，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)刺激物的誘導(dǎo)，Th0細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，RORγt與RORα的mRNA表達(dá)量較高，細(xì)胞在誘導(dǎo)分化過(guò)程中給予1，25（OH）2D3作用后，轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量明顯下降且具有劑量依賴性，與對(duì)照組相比，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖2　細(xì)胞因子IL-17A和IL-22的濃度

圖3　Th17細(xì)胞特異轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)

3　討論

Th17細(xì)胞是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種不同于Th1和Th2細(xì)胞，能夠分泌IL-17的輔助性T細(xì)胞［9］，在自身免疫性疾病和機(jī)體防御反應(yīng)中具有重要的意義［10］。通過(guò)分泌IL-17A/F、IL-22、IL-23等炎癥相關(guān)細(xì)胞因子來(lái)參與機(jī)體防御胞外感染、抗寄生蟲(chóng)免疫、自身免疫疾病和腫瘤發(fā)病等重要生理或病理進(jìn)程，尤其在銀屑病發(fā)病機(jī)制研究中，Th17細(xì)胞的作用受到廣泛關(guān)注［11-13］。因此，Th17細(xì)胞分化和免疫功能調(diào)控的研究具有重要的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用價(jià)值。有研究表明，初始T細(xì)胞在TGF-β和IL-6共同作用下分化為Th17細(xì)胞，T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞后可高表達(dá)RORγt、IL-17F，而RORγt和RORα雙突變將導(dǎo)致Th17細(xì)胞分化徹底停止，并抑制實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的發(fā)生和發(fā)展［14］。Peng X等［15］發(fā)現(xiàn)，TH17細(xì)胞分泌的TH17細(xì)胞因子通過(guò)RANTES介導(dǎo)的白細(xì)胞浸潤(rùn)對(duì)腎纖維化有促進(jìn)作用。1，25（OH）2D3是類固醇激素之一，是維生素D3在體內(nèi)的活性形式，主要通過(guò)其特異性受體-VDR介導(dǎo)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)［16］。有研究發(fā)現(xiàn)肝臟中存在VDR，并且在肝臟中豐富的Kupffer細(xì)胞與HSC等均有VDR表達(dá)［17-18］。鄧文升等［19］發(fā)現(xiàn)1，25（OH）2D3通過(guò)減少TGF-β1的表達(dá)以及抑制HSC的激活，抑制肝纖維化發(fā)展。而且維生素D與諸多肝臟疾病關(guān)系密切，如非酒精性脂肪性肝病、酒精性肝病、病毒性肝炎、肝細(xì)胞肝癌等。因此，1，25（OH）2D3可能與肝纖維化發(fā)生密切相關(guān)，本研究采用目前認(rèn)為較好的Th17細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的方法，在培養(yǎng)液中同時(shí)加入CD3/CD28、IFN-γ、IL-2和重組人細(xì)胞因子（TGF-β、IL-6、IL-1β），其中CD3/CD28單抗為CD4+T細(xì)胞的增殖提供活化信號(hào)，IL-2和IFN-γ單抗可有效防止CD4+T細(xì)胞向Th1、Th2細(xì)胞分化，而重組人細(xì)胞因子可以高效誘導(dǎo)CD4+T向Th17細(xì)胞分化。本研究發(fā)現(xiàn)對(duì)照組的Th17細(xì)胞分化明顯（Th17細(xì)胞比例最高），細(xì)胞因子IL-17A和IL-22、轉(zhuǎn)錄因子RORγt和RORα的表達(dá)也最高，但在1，25（OH）2D3干預(yù)后表達(dá)都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，表明1，25（OH）2D3可有效地抑制Th17細(xì)胞的分化。這說(shuō)明1，25（OH）2D3可有效地調(diào)節(jié)T細(xì)胞的免疫反應(yīng)，通過(guò)對(duì)T細(xì)胞的平衡調(diào)節(jié)來(lái)參與治療肝纖維化等疾病。

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（本文編輯：魯翠濤）

·經(jīng)驗(yàn)交流·

Inhibition effect of 1，25（OH）2D3on TH17 cell differentiation in mice in vitro

GU Lei， JIANG Chun-hui， SUN Long-ci， LIU Ye， ZHOU Hong， XU Chun-jie， XU Qing. Department of Gastrointestinal Surgery，Renji Hospital Affiliated to School of Medicine， Shanghai Jiaotong University， Shanghai 200127， China

AbstractObjective To study and confirm the inhibition effect of 1，25（OH）2D3on Th17 cells differentiation in vitro. Methods Lymphocytes were separated from spleen. Different concentrations of 1，25（OH）2D3were added to the CD4+T cells. Th17 cell differentiation was induced by CD4+T Cell Isolation Kit. The level of IL-17A and IL-22 were detected by ELISA. Flow cytometry was used to analyze the proportion of Th17 cells while RT-PCR was used to detect the expression of transcription factors of th17 cells. Results Cytokines detection in culture supernatant by ELISA showed that IL-17A and IL-22 concentrations gradually decreased， with an increasing addition of 1，25（OH）2D3concentration. The proportion of Th17 cells reduced in 1，25（OH）2D3treatment group and presented a dose dependent. The mRNA levels of IL-17A， IL-22， RORγt and RORα were significantly decrease in 1，25（OH）2D3treatment group than that in control group （P＜0.01）. Conclusion 1，25（OH）2D3plays a role in inhibiting the differentiation of Th17 cells， reduces the cytokines secretion （IL-17A and IL-22） and expression of specific transcription factors（IL-17A， IL-22， RORγt， RORα）.

Key wordsliver fibrosis； 1，25（OH）2D3； Th17； mice

［通訊作者簡(jiǎn)介］徐慶，主任醫(yī)師，博士，E-mail：renjixuqing@163.com。

［第一作者簡(jiǎn)介］顧磊（1981-），男，浙江寧波人，主治醫(yī)師，在讀博士。

［基金項(xiàng)目］上海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研課題（20154Y0207）。

［收稿日期］2015-12-28

［中圖分類號(hào)］R575

［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A

DOI：10.11952/j.issn.1007-1954.2016.03.010