馬淑敏，法　蕾，孫長(zhǎng)忠，辛學(xué)兵

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院華北林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心，北京 102300)

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半干旱黃土區(qū)藍(lán)藻液體培養(yǎng)條件研究

馬淑敏，法蕾，孫長(zhǎng)忠，辛學(xué)兵*

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院華北林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心，北京 102300)

摘要：以半干旱黃土區(qū)藻類結(jié)皮中的藍(lán)藻為研究對(duì)象，對(duì)其室內(nèi)液體培養(yǎng)所需營(yíng)養(yǎng)、光照及溫度條件進(jìn)行研究，揭示不同條件下藍(lán)藻生長(zhǎng)的規(guī)律。結(jié)果表明：N、P濃度不同藻種生長(zhǎng)情況不同，N10、P1濃度下藻種生物量最大；不同光照時(shí)間對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，光照12h藻種生長(zhǎng)穩(wěn)定，而且生物量高峰值最大，長(zhǎng)時(shí)間光照16h繁殖快衰亡也快，生長(zhǎng)不穩(wěn)定；溫度也是影響藻種生長(zhǎng)的重要條件，15℃、室溫和20℃時(shí)，藻種生長(zhǎng)均比較穩(wěn)定，但15℃藻種生物量一直比較低，35℃條件下，藻種生長(zhǎng)不穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞：黃土高原；藍(lán)藻結(jié)皮；生物量；液體培養(yǎng)

我國(guó)干旱、半干旱地區(qū)面積占總國(guó)土總面積1/2[1]，黃土高原區(qū)作為水土流失和生態(tài)環(huán)境破壞最嚴(yán)重的地區(qū)之一，因其水分養(yǎng)分匱乏，生態(tài)環(huán)境脆弱，生態(tài)環(huán)境治理是一項(xiàng)艱巨而重要的任務(wù)[2-6]。在干旱、半干旱地區(qū)，70%以上的范圍覆蓋著生物結(jié)皮[7-8]，土壤生物結(jié)皮是由細(xì)菌、真菌、藻類、地衣和苔蘚等形成的一種混合體[9]，在我國(guó)西部和北部地區(qū)有著廣泛的分布[10]，其中藻結(jié)皮是生物結(jié)皮的主要組成部分，藻類結(jié)皮是指生長(zhǎng)在于旱、半干旱地區(qū)的藻類與其下層很薄的土壤共同形成的一個(gè)復(fù)合的生物土壤層[11]，藻類作為先鋒生物，常在條件惡劣的環(huán)境下生存，并影響改變著周圍環(huán)境[10，12-13]。

藍(lán)藻結(jié)皮在藻結(jié)皮中占據(jù)重要地位，在干旱和半干旱地區(qū)廣泛分布，藍(lán)藻結(jié)皮中的大量絲狀藍(lán)藻形成膠鞘和分泌藍(lán)藻細(xì)胞胞外多糖[14]，絲狀藍(lán)藻和其分泌的胞外多糖起著捆綁、黏結(jié)沙粒和固定沙粒的作用，最終產(chǎn)生減少水蝕和風(fēng)蝕的生態(tài)效應(yīng)，藍(lán)藻在藻結(jié)皮的形成及藻結(jié)皮演替中都具有重要作用[15]。

鑒于藻類結(jié)皮對(duì)半干旱黃土區(qū)水土保持的重要意義，許永霞等[16]對(duì)人工培養(yǎng)藻結(jié)皮的環(huán)境條件進(jìn)行了研究，而藻種來(lái)源則成為人工培育藻結(jié)皮的首要條件。藻類生物量的影響因子包括水分、光照、PH值、溫度及養(yǎng)分等等，各因子間的交互作用使得生物量對(duì)各因子的反應(yīng)效果不同[12，17-18]。 例如，低溫光照明顯抑制藍(lán)藻結(jié)皮活性，而低溫黑暗卻能促進(jìn)藍(lán)藻活性和形態(tài)恢復(fù)[19]，藻生長(zhǎng)需要光照，但是紫外輻射過強(qiáng)會(huì)影響藻結(jié)皮的生產(chǎn)力[20]。研究藍(lán)藻室內(nèi)水培條件具有重要意義，為大批量生產(chǎn)藻種提供技術(shù)基礎(chǔ)，進(jìn)而為人工野外反接培育人工藻結(jié)皮治理黃土區(qū)水土流失提供豐富的藻種資源。

1材料與方法

1.1藻種

把在半干旱黃土高原區(qū)采集土壤藻類結(jié)皮，裝入塑料袋中，帶回室內(nèi)分離藍(lán)藻并純化，用小罐頭瓶進(jìn)行液體培養(yǎng)。

1.2培養(yǎng)基

選用BG-11培養(yǎng)基配方，主要成份為：NaNO3，K2HPO4，MgSO4·7H2O，CaCl2·2H2O，Na2CO3，檸檬酸，檸檬酸鐵，EDTANa2，微量元素溶液A5。

1.3培養(yǎng)方法

將培養(yǎng)藍(lán)藻用的罐頭瓶洗凈，然后倒入配置好的BG-11培養(yǎng)基，每瓶約60 mL，用封口膜封口，在121℃高壓下滅菌20 min.。收集已分離培養(yǎng)的生長(zhǎng)狀況良好的藍(lán)藻，破碎25 min，攪勻后用移液槍取10 mL接種到罐頭瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，藍(lán)藻培養(yǎng)過程中每天進(jìn)行手動(dòng)震蕩搖勻。

1.4試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 營(yíng)養(yǎng)成分含量試驗(yàn) 在BG-11培養(yǎng)基基本養(yǎng)分含量及室內(nèi)室溫且自然光條件下進(jìn)行。每個(gè)處理設(shè)90個(gè)樣，連續(xù)監(jiān)測(cè)30 d，每天取樣3個(gè)(即3個(gè)重復(fù))進(jìn)行測(cè)定。

(1) N元素含量試驗(yàn)： K2HPO4含量(即P含量)不變，設(shè)置加入150 g·L-1NaNO3共4個(gè)處理，即0、5、10、20 mL。

(2)P元素含量試驗(yàn)：NaNO3含量(即N含量)不變，設(shè)置加入40 g·L-1K2HPO4共4個(gè)處理，即0、1、2、5 mL。

1.4.2光照時(shí)間試驗(yàn)在BG-11培養(yǎng)基基本養(yǎng)分含量及室溫室內(nèi)培養(yǎng)架上進(jìn)行，采用日光燈照射，每個(gè)培養(yǎng)架上安裝光照時(shí)間分控器；試驗(yàn)監(jiān)測(cè)45 d，進(jìn)行18次取樣測(cè)定；光照時(shí)間設(shè)3個(gè)處理，即16、12、8 h。

1.4.3溫度控制試驗(yàn)在BG-11培養(yǎng)基基本養(yǎng)分含量、室內(nèi)自然光照條件下，培養(yǎng)箱中進(jìn)行；監(jiān)測(cè)45 d，進(jìn)行18次取樣測(cè)定；溫度設(shè)4個(gè)處理，即15℃、20℃、室溫(27℃左右)、35℃。

1.5測(cè)定方法

藻種生物量用UV-2600型紫外可見分光光度計(jì)680 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值，繪制生長(zhǎng)曲線。具體測(cè)定方法見文獻(xiàn)[21]。

1.6數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與相關(guān)性分析采用Excel2007和SPSS16.0分析軟件。

2試驗(yàn)結(jié)果

2.1不同營(yíng)養(yǎng)條件對(duì)藍(lán)藻生長(zhǎng)的影響

藻類的生長(zhǎng)與培養(yǎng)液的營(yíng)養(yǎng)條件密切相關(guān)，N、P是影響藻種繁殖的兩大主要營(yíng)養(yǎng)成分。通過研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基成分N或P濃度為0的情況下藍(lán)藻生長(zhǎng)停滯，3～5 d時(shí)間藻種全部變黃死亡；藻類的繁殖速度與濃度和時(shí)間呈現(xiàn)明顯的相關(guān)關(guān)系，其余各組分，各濃度藻種在生長(zhǎng)到10～14 d左右時(shí)，增長(zhǎng)速度最快，且均在15 d左右達(dá)到高峰值，然后進(jìn)入平穩(wěn)生長(zhǎng)時(shí)期，在約18 d左右開始平緩下降，逐漸衰亡，這一過程比較緩慢(圖1、圖2)。

由圖1可以看出，P1含量不變的情況下，N營(yíng)養(yǎng)各濃度梯度下藻種生物量高峰值不同。N10濃度藻種生物量高峰值最大，分別比N5、N20高出97.07%和96.95%，經(jīng)方差分析，N10濃度下藻種繁殖高峰期生物量與N5、N20濃度藻種繁殖高峰期生物量有極顯著差異(p<0.01)；由圖2可見，N10含量不變的情況下，P2濃度下藻種生物量的高峰值與P5濃度下藻種生物量的高峰值有極顯著差異(p<0.01)。通過圖1 、圖2對(duì)比分析， 配方N10P1與N10P2相比較，N10P1藻種生物量最大值極顯著高于N10P2藻種生物量最大值(p<0.01)，可以得出，最合適的營(yíng)養(yǎng)比例為N10P1配方。

2.2不同光照時(shí)間對(duì)藍(lán)藻生長(zhǎng)的影響

光照是影響藻類生長(zhǎng)的重要環(huán)境條件之一。由圖3可見，光照時(shí)間16 h的藻種生物量在第4 d時(shí)達(dá)到最大，當(dāng)藻種生長(zhǎng)到第11 d時(shí)，生物量大幅下降,隨后開始平緩生長(zhǎng)且逐漸衰亡，而光照12 h和8 h的藻種前期生長(zhǎng)比較緩慢，生物量均在15 d左右達(dá)到高峰，由此表明，在藻類培養(yǎng)初期，持續(xù)而充足的光照有利于藻類的快速繁殖。通過方差分析，光照時(shí)間12 h的藻種生物量高峰值與8 h、16 h光照的藻種生物量高峰值均有極顯著差異(p<0.01)；光照時(shí)間12 h的藍(lán)藻生物量在第18 d左右大幅下降，隨后進(jìn)入平緩生長(zhǎng)期，光照時(shí)間8 h的藍(lán)藻整個(gè)生長(zhǎng)過程都平緩，由此表明，藻類培養(yǎng)后期，適當(dāng)減弱光照反而有利于藻種培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，因?yàn)樵孱惙敝吃缙冢枰罅抗庹者M(jìn)行光合作用，而后期，由于培養(yǎng)基養(yǎng)分消耗殆盡，減弱光照，就可以減慢藻類的生長(zhǎng)速度，減緩藻類的死亡。

圖1　N含量不變條件下不同P濃度藍(lán)藻生長(zhǎng)曲線

圖2　P含量不變條件下不同N濃度藍(lán)藻生長(zhǎng)曲線

2.3不同溫度水平對(duì)藍(lán)藻生長(zhǎng)的影響

溫度也是影響藻類生長(zhǎng)的一個(gè)重要環(huán)境條件。研究表明(圖4)，在高溫35℃條件下藻種前期繁殖最快，生長(zhǎng)到第3 d時(shí)，生物量是其它溫度水平的3倍多，第7 d生物量即達(dá)到高峰值，之后,進(jìn)入10 d左右的波動(dòng)期，到第21 d前后生物學(xué)大幅下降。由此可見，高溫條件下，藻種繁殖快衰亡也快；室溫下，藻種平緩生長(zhǎng)至第18 d左右生物量達(dá)到高峰值，而且一直持續(xù)到第27 d左右才開始大幅度下降，藻種的快速繁殖期時(shí)間最長(zhǎng)，隨后平緩生長(zhǎng)逐漸衰亡，說明室溫是最利于藻種生長(zhǎng)的溫度條件；20℃條件下藍(lán)藻在21 d左右生物量最大，比室溫下藻種生物量最大值低24.9%，隨后生物量大幅下降；15℃條件下藻種一直平穩(wěn)緩慢生長(zhǎng)，沒有出現(xiàn)藻種大量繁殖的現(xiàn)象，表明溫度過低不利于藻種的生長(zhǎng)。

圖3　不同光照時(shí)間下藍(lán)藻生長(zhǎng)曲線

圖4　不同溫度條件下藍(lán)藻生長(zhǎng)曲線

3結(jié)論與討論

本研究從野外藻類結(jié)皮中分離出藍(lán)藻并進(jìn)行室內(nèi)液體培養(yǎng)，在藻種生長(zhǎng)繁殖環(huán)境發(fā)生巨大變化，藻種液體培養(yǎng)適應(yīng)期后，收集生長(zhǎng)狀況良好的藻種,再轉(zhuǎn)接到不同營(yíng)養(yǎng)條件的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)和光譜條件下試驗(yàn),結(jié)果為營(yíng)養(yǎng)條件不同與藻類繁殖生長(zhǎng)呈現(xiàn)明顯的相關(guān)關(guān)系:N、P、K作為藻類生長(zhǎng)重要的營(yíng)養(yǎng)成分，當(dāng)N、P含量不同時(shí)，藻種的生長(zhǎng)繁殖受到很大影響，在N10P1營(yíng)養(yǎng)配方下藻種的生物量顯著高于其它營(yíng)養(yǎng)配方，說明藻種的繁殖不僅需要營(yíng)養(yǎng)，而且各養(yǎng)分還需保持合適的濃度比例，才會(huì)實(shí)現(xiàn)藻種的快速繁殖和大量繁殖；光照時(shí)間不同，藻種生長(zhǎng)呈現(xiàn)不同的規(guī)律，光照12 h的藻種生長(zhǎng)情況最好，最長(zhǎng)光照16 h的藻種繁殖速度快但衰亡也最快，由此說明，藻類生長(zhǎng)初期，充足的光照有利于藻類的快速繁殖，而中后期減少光照反而有利于藻種生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，原因可能是藻類繁殖早期，需要大量光照進(jìn)行光合作用，而到了中后期，隨著培養(yǎng)基養(yǎng)分的消耗，減弱光照，可以減慢藻類的生長(zhǎng)速度，從而減緩藻類的死亡；不同溫度水平影響藻種的生長(zhǎng)繁殖，20℃和室溫下藻種生長(zhǎng)穩(wěn)定，室溫下藻種繁殖更多，溫度過高(35℃)藻種快速繁殖，但也加快了藻種的死亡，溫度過低(15℃)，藍(lán)藻生長(zhǎng)情況較穩(wěn)定，但生物量較低，可能低溫在一定程度上抑制了藻種生長(zhǎng)，不利于藻種的繁殖。

藍(lán)藻室內(nèi)液體的培養(yǎng)，控制好藻種生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)、溫度、光照等環(huán)境條件非常重要，以此可以為今后用大桶、大池子人工培養(yǎng)繁殖大批量藻種奠定一定基礎(chǔ)，進(jìn)而提供野外人工培養(yǎng)藻結(jié)皮治理黃土區(qū)水土流失所需的藻種資源。關(guān)于人工培養(yǎng)藍(lán)藻今后仍需要進(jìn)行深入研究，比如：藻種生長(zhǎng)繁殖與生長(zhǎng)時(shí)間的相關(guān)性，因?yàn)檠芯堪l(fā)現(xiàn)，不同環(huán)境條件下，藻種繁殖速度、繁殖的量以及衰亡時(shí)間都有所不同，通過何種手段控制藻種衰亡，延長(zhǎng)繁殖時(shí)間或是恢復(fù)其活性，都需要深入地研究。

參 考 文 獻(xiàn)

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Liquid Culture Conditions of Cyanobacteria in Semi-arid Region of Loess Plateau

MA Shu-min1，F(xiàn)A Lei1，SUN Chang-zhong1

(1.NorthExperimentalCenterofForestry,CAF,Beijing102300)

Abstract:Cyanobacteria of algal crust in semi-arid region of Loess Plateau as object,its liquid culture conditions regarding nutrition,illumination strength and temperature were studied to reveal the influence of different conditions on algae growth. The results showed that N and P concentrations influenced the growth of algae. The biomass of algae was maximum under the N10 and P1 treatments. The algae grew stably under the 12 hours light and the biomass peak is maximum. The algae grew unstably under 16 hours light，propagated and degradedly quickly. The temperature is an important condition influencing the growth of algae. The algae grew stably at the 15℃,20℃and the room temperatures,but the biomass of algae was low at 15℃.

Key words:Loess Plateau; cyanobacterial crusts; biomass; liquid culture

中圖分類號(hào):Q949.22

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1001-2117(2016)02-0001-04

作者簡(jiǎn)介：馬淑敏(1981-)，女，漢，山東德州人，碩士，工程師，主要從事土壤生態(tài)學(xué)研究。

基金項(xiàng)目：“十二五”國(guó)家科技支撐項(xiàng)目(2015BAD07B0202)。

收稿日期：2015-07-18