●溫乾輝許林林田祖國(guó)潘娟

Pim-3蛋白在急性白血病中的表達(dá)及意義

●溫乾輝1許林林2田祖國(guó)1潘娟1

目的：探討pim-3蛋白在急性白血病(AL)中的表達(dá)及意義。方法：采用免疫組化SP法檢測(cè)30例急性髓細(xì)胞白血病(AML)和20例急性淋巴白血病(ALL)患者中pim-3蛋白的表達(dá)情況，同時(shí)選取15例非惡性血液病的患者作為對(duì)照，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各組間Pim-3蛋白的表達(dá)差異。結(jié)果：Pim-3蛋白在急性白血病患者中的表達(dá)陽(yáng)性率顯著低于非惡性血液病患者，但在急性髓細(xì)胞白血病患者中和急性淋巴白血病患者中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；結(jié)論：Pim-3蛋白在急性白血病中的異常表達(dá)可能與白血病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

Pim-3蛋白；免疫組化；急性白血病；異常表達(dá)

急性白血病（AL）是造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，細(xì)胞在骨髓

及其他造血組織中發(fā)生增殖失控、分化障礙和凋亡，停滯在生長(zhǎng)發(fā)育的不同階段，嚴(yán)重危害患者的健康，但其病因和發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，難治和復(fù)發(fā)一直是臨床醫(yī)生在白血病治療過(guò)程中所面臨的最為棘手的問(wèn)題，由于白血病發(fā)病迅速、惡性程度高、預(yù)后較差及治療費(fèi)用高，嚴(yán)重地威脅著患者的生命和生活質(zhì)量[1]。Pim-3是一個(gè)保守的蛋白激酶類原癌基因家族成員，其表達(dá)受眾多生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的調(diào)控[2]。研究發(fā)現(xiàn)Pim-3在多種內(nèi)胚層衍生來(lái)源的腫瘤，如肝癌、胰腺癌、大腸癌、胃癌等組織中高表達(dá)。本研究旨在探討Pim-3蛋白在急性白血病中的表達(dá)及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015年12月一2016年2月期間在遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院住院和門診被確診為急性白血病患者50例，其中急性髓細(xì)胞白血病30例，急性淋巴細(xì)胞白血病20例；選取15例非惡性血液病患者作為對(duì)照組，包含貧血、溶血、感染、血小板減少等疾病。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

上海奧林巴斯光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS BX53),光明電熱恒溫水箱( HHW21.420AII),上海精科電子天平(EA1204B),合肥美的電冰箱(BCD-195SM（Q）)。

1.2.2 試劑

兔抗人多克隆抗體Pim-3（bs-4528R）、免疫組化SP試劑盒（SP-0023）、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒（C-0010）均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，蘇木精購(gòu)于貴陽(yáng)恒因公司。

1.3 方法（免疫組化）

采用鏈霉素抗生物素蛋白—過(guò)氧化物酶（SP)法檢測(cè)pim-3蛋白的表達(dá)。將每個(gè)標(biāo)本用4%多聚甲醛固定20分鐘，PBS（PH6.4—6.8）沖洗5次（每次清洗3分鐘）；滴加3%的過(guò)氧化氫孵育20分鐘，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，PBS沖洗3次（每次清洗3分鐘）；滴加正常山羊血清工作液封閉，室溫孵育20分鐘，傾去，勿洗；滴加用PBS稀釋100：1倍的兔抗人多克隆抗體pim-3，37℃孵育3小時(shí),PBS沖洗3次（每次清洗3分鐘）；滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG，37℃孵育20分鐘，PBS沖洗3次（每次清洗3分鐘）；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，37℃孵育20分鐘，PBS沖洗3次（每次清洗3分鐘）。滴加DAB顯色劑顯色，室溫10分鐘，自來(lái)水充分沖洗。加蘇木素復(fù)染10分鐘，PBS沖洗3次（每次清洗1分鐘）至反藍(lán)。

結(jié)果判定：采用半定量積分法判斷結(jié)果[3]：總共計(jì)數(shù)200個(gè)粒細(xì)胞，按照陽(yáng)性細(xì)胞所占比例及染色深淺進(jìn)行結(jié)果判定：①按陽(yáng)性細(xì)胞所占的比例來(lái)評(píng)分：≤5%為0分，6% ～25%為1分,26% ～50%為2分，50%～75%為3分,＞75%為4分；②按照細(xì)胞的染色深淺來(lái)評(píng)分：細(xì)胞無(wú)著色為0分，染成淡黃色為1分，染成黃色為2分，染成黃棕色3分；計(jì)算兩項(xiàng)之和，判斷染色強(qiáng)度：0～1分（—），2～3分（+），4～5分（++），≥6分（+++）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

免疫組化SP法測(cè)定的Pim-3蛋白表達(dá)陽(yáng)性率組間比較采用x2檢驗(yàn)，而分析各組間Pim-3蛋白表達(dá)強(qiáng)度的差異采用秩和檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Pim-3蛋白定位與判斷

Pim-3蛋白陽(yáng)性結(jié)果是定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，其被染成淺黃色至黃棕色，見(jiàn)圖1。

圖1 Pim-3蛋白在不同骨髓組織中的表達(dá)情況

2.2 免疫組化SP法檢測(cè) Pim-3蛋白水平結(jié)果

Pim-3蛋白在非惡性血液病及急性白血病（AL）患者中的陽(yáng)性率分別為100%和78%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具體見(jiàn)表1。急性髓細(xì)胞白血?。ˋML)和急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）患者中的Pim-3蛋白的表達(dá)強(qiáng)度均顯著低于非惡性血液病患者，而急性髓細(xì)胞白血?。ˋML）患者Pim-3蛋白表達(dá)強(qiáng)度與急性淋巴白血?。ˋLL）患者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具體見(jiàn)表2。

表1 pim-3蛋白在AL和非惡性血液病患者中的表達(dá)陽(yáng)性率

在細(xì)胞質(zhì)中，出現(xiàn)淺黃色或黃棕色為陽(yáng)性反應(yīng)。陰性（-）：無(wú)著色；弱陽(yáng)性（+）：呈淺黃色；陽(yáng)性（++）：呈黃色；強(qiáng)陽(yáng)性（+++）：呈黃棕色。

表2 pim-3蛋白在非惡性血液病和AML與ALL患者中的表達(dá)強(qiáng)度

3 討論

急性白血病（AL）為血液系統(tǒng)惡性疾病，起病急、進(jìn)展快、自然病程短，若不經(jīng)及時(shí)特殊有效治療，大概只有3個(gè)月的生存時(shí)間，短者可能在診斷數(shù)天后即發(fā)生死亡。所以，對(duì)急性白血病的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療顯為十分重要，而進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)有針對(duì)性的白血病新特異性標(biāo)志物很是迫切。而腫瘤特異性標(biāo)志物的特點(diǎn)應(yīng)該可以調(diào)控腫瘤細(xì)胞的過(guò)度增殖，并在其中起到了不可或缺作用，且在腫瘤組織的表達(dá)與正常組織中存在明顯差異。

Pim激酶家族是與鈣/鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)(CAMP)相關(guān)的原癌基因，有3個(gè)成員：Pim-1、Pim-2、Pim-3，它們都有一個(gè)共同的ATP錨活化位點(diǎn)，并在結(jié)構(gòu)序例上有高度的相似性，且在大多數(shù)組織和細(xì)胞的進(jìn)化過(guò)程中高度保守。目前盡管有大量的研究資料顯示pim激酶的升高與抑制細(xì)胞的凋亡有顯著的關(guān)系，但也有一些研究資料表明pim激酶對(duì)細(xì)胞的凋亡也有一定的促進(jìn)作用。

Fujii等研究發(fā)現(xiàn)在人類組織中，Pim-3mRNA存在于心肌、骨骼肌、大腦、腎、肺、脾、胎盤和白細(xì)胞中，且在心肌和骨骼肌中高度表達(dá)[4]。研究顯示，Pim家族中Pim-1、Pim-2在多種腫瘤組織中被證實(shí)均有異常的表達(dá)，李穎等人發(fā)現(xiàn)Pim-1mRNA在白血病表達(dá)顯著增高，且急性淋巴細(xì)胞白血病患者組的pim-1mRNA表達(dá)高于急性髓細(xì)胞白血病和慢性髓細(xì)胞白血病患者組[5]。黃綠葉等發(fā)現(xiàn)急性淋巴細(xì)胞白血病患者初治和復(fù)發(fā)Pim-2的表達(dá)低于正常人，急性髓細(xì)胞白血病患者的Pim-2表達(dá)情況與正常人無(wú)明顯差異[6]。而Pim-3蛋白在胃癌、食管鱗癌、心肌缺氧、胰腺癌等多種腫瘤細(xì)胞中均有異常表達(dá)[7]。

目前對(duì)于Pim激酶家族在急性白血病研究中的主要集中于Pim-1和Pim-2，而相對(duì)于Pim-3激酶在急性白血病中的研究要較少，周震滄等研究發(fā)現(xiàn)未經(jīng)過(guò)化療的急性髓細(xì)胞白血病中的Pim-3基因表達(dá)低于正常對(duì)照組，而經(jīng)化療治療過(guò)的急性髓細(xì)胞白血病的Pim-3基因表達(dá)與正常對(duì)照組的Pim-3基因表達(dá)差異不明顯[12]。本文實(shí)驗(yàn)SP法顯示：Pim-3蛋白在急性白血病患者中表達(dá)的陽(yáng)性率是低于非惡性血液病患者，急性髓細(xì)胞白血病及急性淋巴細(xì)胞白血病患者Pim-3蛋白的表達(dá)強(qiáng)度均低于非惡性血液病患者，急性髓細(xì)胞白血病與急性淋巴白血病患者Pim-3蛋白表達(dá)強(qiáng)度不存在明顯差異，初步說(shuō)明了Pim-3蛋白的下調(diào)對(duì)急性白血病的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮了一定的作用。由于本研究病例數(shù)相對(duì)較少，論據(jù)不夠充分，需要進(jìn)一步加大標(biāo)本量，長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)Pim-3蛋白隨白血病病程的變化并與臨床相結(jié)合，從而更深入探討pim-3在白血病中的作用。

本研究結(jié)果顯示，急性白血病患者中的Pim-3蛋白表達(dá)陽(yáng)性率及表達(dá)強(qiáng)度均低于非惡性血液病，而急性髓細(xì)胞白血病與急性淋巴白血病患者Pim-3蛋白表達(dá)無(wú)差異， 提示pim-3蛋白在急性白血病中的異常表達(dá)可能與該病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。對(duì)于Pim-3蛋白表達(dá)的變化能否成為今后急性白血病有效的診斷及病情監(jiān)測(cè)的指標(biāo)，有待于后續(xù)的深入研究。

（作者單位：1遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科；2遵義市口腔醫(yī)院）

[1]許文榮，谷俊俠．臨床血液學(xué)檢驗(yàn)[M]．南京：東南大學(xué)出版社，2001：207．

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[2]孫守亮. Pim-3和p-Bad蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及意義[D]. 蚌埠醫(yī)學(xué)院, 2012.

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[3]中華病理學(xué)雜志編輯委員會(huì)．全國(guó)免疫組化技術(shù)與診斷標(biāo)準(zhǔn)化專題研討會(huì)》會(huì)議記要[J]．中華病理學(xué)雜志，2006，25（6）：326．

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[4]寇煒, 趙晉, 吳靜,等. 原癌基因Pim-3蛋白表達(dá)與食管癌術(shù)后生存的關(guān)系[J]. 中國(guó)老年學(xué)雜志, 2011, 31(14)：2647-2648.

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[5]劉星宏, 溫桂蘭. Pim-1在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其與c-M yc的相關(guān)性[J]. 重慶醫(yī)學(xué), 2015(15)：2031-2033.

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[6]幸雅薇. Pim-2基因?qū)θ毖鯊?fù)氧條件下H9c2細(xì)胞凋亡的影響[D].南昌大學(xué), 2013.

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[7]桂俊康. 異常高表達(dá)的Pim-3抑制胃癌細(xì)胞凋亡促進(jìn)胃癌發(fā)生發(fā)展的實(shí)驗(yàn)研究[D]. 蘇州大學(xué), 2014.

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[8]張彩, 郭切, 蘭培祥,等. 靶向Pim-3的雙功能shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)小鼠肝癌的治療作用[C]// 全國(guó)免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì). 2012.

[8]張彩，郭切，蘭培祥，等．靶向Pim-3的雙功能shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)小鼠肝癌的治療作用[C]//第八屆全國(guó)免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文集，重慶，2012：頁(yè)碼范圍缺失．

[9]閔新文, 汪引芳, 錢航,等. Pim-3在大鼠脂肪組織中的表達(dá)及其與脂肪胰島素抵抗的關(guān)系[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2011, 27(8)：1609-1614.

[9]閔新文，汪引芳，錢航，等．Pim-3在大鼠脂肪組織中的表達(dá)及其與脂肪胰島素抵抗的關(guān)系[J]．中國(guó)病理生理雜志，2011，27（8）：1609-1614．

田祖國(guó)，副主任醫(yī)師

貴州省科學(xué)技術(shù)基金（項(xiàng)目編號(hào)：黔科合J字LKZ[2012]09）