石健　張雯婕　馮汛　胡雨婷　瑤池

(南通大學(xué)　江蘇南通 226019)

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尼羅紅熒光染色法的優(yōu)化及應(yīng)用*

石健張雯婕馮汛胡雨婷瑤池

(南通大學(xué)江蘇南通 226019)

摘要以自主篩選的小球藻為材料對尼羅紅熒光染色進行條件優(yōu)化，并用該方法追蹤微藻在污水中的油脂含量變化。實驗發(fā)現(xiàn)，微藻只有經(jīng)過超聲波破碎，染色才會出現(xiàn)熒光，DMSO的添加會增強熒光反應(yīng)。最終確定其染色條件為：DMSO與藻液體積比為1∶5，超聲波破碎5 min后染色5 min，NR質(zhì)量濃度1.5 μg/mL。在其應(yīng)用方面發(fā)現(xiàn)，微藻的油脂積累量只有培養(yǎng)基的一半，說明污水不利于微藻油脂的積累；最佳采收時期為平穩(wěn)期，此時微藻的產(chǎn)量和油脂含量達到最高。

關(guān)鍵詞小球藻尼羅紅超聲波污水油脂

0引言

微藻因其生長快速、產(chǎn)量大、油脂含量高成為生物柴油的熱門候選來源[1]。其中，小球藻具有高耐污、高含油特性，可利用污水飼養(yǎng)節(jié)約生產(chǎn)成本。因其兼具再生能源與污水處理的特點[2]，小球藻在微藻生物柴油的研究中引起了人們的廣泛關(guān)注。雖然已有大量的研究證明小球藻對污水處理的能力，但其在污水中的油脂積累情況卻研究較少。油脂的產(chǎn)量直接決定微藻生物柴油的生產(chǎn)價值，監(jiān)測污水中小球藻的油脂含量對其工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。

尼羅紅(Nile Red,NR)是一種脂溶性的熒光染料，可以準確地將細胞內(nèi)脂類物質(zhì)與其他貯藏物區(qū)分開[3], 因此經(jīng)常被用于檢測動物以及微生物細胞內(nèi)油脂情況。尼羅紅熒光染色法具有快速、簡便、靈敏，樣品需求量少且能連續(xù)活體檢驗等優(yōu)點[4]，已在多種生物中證明了尼羅紅熒光染色的準確性。HUANG等人[5]就曾用尼羅紅對凍干的小球藻藻粉進行油脂定量檢測，發(fā)現(xiàn)其相關(guān)度高達0.99。利用尼羅紅熒光染色建立快速簡便低能耗的微藻脂質(zhì)測定方法無論是對優(yōu)良藻種的篩選，培養(yǎng)條件的優(yōu)化或是藻采收時期的確定都十分有益。

雖然尼羅紅熒光染色法已成功地應(yīng)用在其他藻類中，但在小球藻這種高含油、高耐污的微藻的研究方面還沒有廣泛應(yīng)用，其原因主要在于小球藻較厚的細胞壁阻礙了尼羅紅與微藻胞內(nèi)油脂的結(jié)合[6]。本實驗中，熒光染色法的條件優(yōu)化將著重對微壁進行研究，以期找到一種能夠應(yīng)用于所有微藻的技術(shù)，可以顯著提高尼羅紅熒光染色法的染色效果。1試驗材料和試劑

藻種：采用從南通郊區(qū)篩選得到7號小球藻為實驗材料。這是一種高耐污微藻，已用索氏提取法測定其油脂含量在35%左右。污水：本實驗所用污水分別取自某污水處理廠和某養(yǎng)豬場(簡稱污水與養(yǎng)殖)，具體參數(shù)見表1。采取水樣后，若水質(zhì)較渾濁可用兩層紗布過濾去除固體懸浮物，經(jīng)121 ℃，30 min高壓蒸汽滅菌后備用。

表1　污水參數(shù)

試劑有BG-11培養(yǎng)基，PBS緩沖液 (pH=7.2),二甲基亞砜 (DMSO), 質(zhì)量濃度為100 μg/mL的尼羅紅 (丙酮配制)等。儀器有離心機，RF-5301型熒光分光光度計、可見分光光度計、冷凍干燥機、搖床(定制帶光照)、超聲波清洗儀等。

2實驗方法

2.1NR熒光染色

取進入平穩(wěn)期的藻液，以4 000 r/min的速度離心分離10 min棄去上層培養(yǎng)液，隨后用PBS重復(fù)清洗3次后懸浮OD750至0.8，NR染色5 min測樣，測樣時Ex=480 nm，掃描500～650 nm之間熒光，并在550～600 nm之間尋峰，其峰值代表油脂相對含量。

2.2污水中微藻生長曲線的測定

每兩天測定藻液OD750，因污水具有濁度，測樣時，先以4 000 r/min的速度離心分離10 min，用蒸餾水清洗3次后，再用蒸餾水懸浮至同體積測樣。

2.3污水中微藻油脂的測定

取自污水處理廠的工業(yè)污水可直接培養(yǎng)微藻(下文簡稱污水)，而養(yǎng)殖污水由于濃度過高，不能直接用于微藻的培養(yǎng)，實驗中使用稀釋5倍后的養(yǎng)殖污水進行實驗(簡稱養(yǎng)殖)，稀釋采用蒸餾水稀釋。試驗每隔4 d取樣，利用優(yōu)化后的NR熒光染色法測定樣品油脂的熒光強度。

3結(jié)果與討論

3.1尼羅紅(NR)熒光染色法的優(yōu)化

3.1.1不同添加物對熒光掃描結(jié)果的影響

試驗分別測定尼羅紅(NR),二甲基亞砜(DMSO)及二者同時添加對微藻油脂熒光掃描結(jié)果的影響，并用藻液作為對比(CK) ，結(jié)果見圖1，DMSO和藻液的體積比為1∶5，1 mL藻液中尼羅紅的添加量為15 μL。

從圖1可知，當激發(fā)波長為480 nm時，微藻的油脂峰位于550～600 nm之間，圖1中4條曲線沒有出現(xiàn)油脂峰，說明沒有油脂被檢出。本實驗使用的7號藻油脂含量在35%左右，無油脂熒光峰說明染色方法有誤，微藻油脂未被成功染色。其原因可能與小球藻的細胞結(jié)構(gòu)有關(guān)。已有研究表明由于綠藻綱的一些小球藻具有較厚的細胞壁，阻擋NR與胞內(nèi)油脂結(jié)合，因而無熒光產(chǎn)生。還有實驗證明DMSO的添加可顯著提高染色效果[7]，可圖中結(jié)果表明DMSO的加入也未能使NR成功與胞內(nèi)油脂結(jié)合。為了得到7號藻油脂的熒光峰，需要對微藻的細胞壁進行處理，增加它的通透性。

圖1　微藻的熒光掃描圖譜

3.1.2細胞壁的處理條件優(yōu)化

發(fā)現(xiàn)DMSO對7號藻無效后，又分別采用不同的有機溶劑處理微藻。甲醇作為一種極性溶劑，可與細胞膜的極性脂結(jié)合從而破壞細胞膜的通透性，而石油醚、乙醇也經(jīng)常被用在微藻的油脂提取中，它們能與細胞壁作用促進油脂的提取，因此在實驗中選擇這3種試劑進行細胞壁的處理，有機試劑與藻液的體積比為1∶5，1 mL藻液中NR為15 μL，見圖2。

圖2　加入有機試劑的掃描圖譜

從圖2可知，所有曲線在550～600 nm之間都無峰值出現(xiàn)，說明這些有機試劑對7號藻全部無效，這可能與7號藻的高耐污能力有關(guān)：一個堅固、致密的細胞壁可以阻擋掉大部分有害物質(zhì)，使其能夠在各種污水中保持活性并處理污水，但其堅固的細胞壁對有機試劑也有很強的抵御能力，不會輕易被破壞結(jié)構(gòu)。將有機試劑法排除后，借鑒微藻油脂的提取方法，進行直接破壁的探究。 超聲波破壁法是一種適合大多數(shù)藻細胞的破壁方法，因此采用超聲波破壁法對7號藻進行預(yù)處理，1 mL藻液中NR為15 μL，有機試劑與藻液的體積比為1∶5，見圖3。

圖3　超聲波與有機試劑相結(jié)合的熒光掃描圖譜

在嘗試超聲波破碎細胞發(fā)現(xiàn)在550～600 nm之間出現(xiàn)熒光峰后，與有機試劑相結(jié)合進行染色。從圖3看出，7號藻經(jīng)過超聲波在550～600 nm之間出現(xiàn)明顯的油脂峰，而甲醇和DMSO的加入增強了油脂的熒光反應(yīng)，經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)超聲波破碎與DMSO結(jié)合的效果最好，說明DMSO可以增強染色效果。

分析圖1和圖3的熒光曲線，可知DMSO的主要作用在于促進NR和微藻油脂的結(jié)合，增強它們的熒光反應(yīng)而非促進NR對于微藻細胞的滲透。有研究證明DMSO可增加生物膜的通透性，其原因在于DMSO可與生物膜的脂質(zhì)作用[8]，引起脂質(zhì)雙分子層厚度的減小甚至融合[9]，從而促進溶質(zhì)分子透過細胞膜。由此可見，DMSO對于由纖維素和果膠組成的小球藻細胞壁沒有明顯作用。DMSO同時具有疏水基和親水基，可與水和有機溶劑互溶，該特性使其成為高效溶劑。當微藻經(jīng)超聲波破碎，細胞結(jié)構(gòu)被破壞，油脂外露時，DMSO可以增加微藻油脂與NR的接觸，進而增強了它們的熒光反應(yīng)效果。

3.1.3尼羅紅的最佳濃度

在確定了微藻的破壁方法后，對NR染色時的濃度進行了探究，具體結(jié)果見圖4，曲線對應(yīng)的1 mL藻液中尼羅紅質(zhì)量分別為5,10,15，20,25，30 mg。

圖4　不同尼羅紅濃度的熒光掃描圖譜

從圖4可知，藻液中不同濃度的NR對微藻的熒光強度有一定的影響，比較幾條曲線后發(fā)現(xiàn)15 μL/mL藻液的染色效果最好，可在OD750為0.8左右的小球藻的染色中使用。

3.2小球藻在污水中的油脂含量變化

在掃描微藻的油脂峰時發(fā)現(xiàn)其熒光峰無固定位置，都在550～600 nm之間移動，見圖5。這是因為微藻油脂是多種脂肪的混合物，不同的污水，不同的生長階段都會對微藻油脂的組成產(chǎn)生影響，如圖5中同種微藻在同種培養(yǎng)基中其生長天數(shù)不同，油脂的熒光峰的位置也發(fā)生變化。為了更加準確評價微藻油脂的含量，本實驗不固定測定某一波長的熒光值，而是在550～600 nm之間尋找峰值，扣除空白樣后以此表征油脂含量。

圖5　7號藻在不同生長階段的熒光曲線

將NR熒光染色法優(yōu)化并確定了測定相對油脂的方法后，利用其對微藻在BG-11、污水、20%養(yǎng)殖廢水中的油脂含量的變化進行了測定。油脂變化曲線和微藻生長曲線顯示在圖6中。

圖6　微藻在不同污水中的油脂積累

觀察圖6中油脂的含量變化，發(fā)現(xiàn)微藻在前期和中期的油脂含量變化基本一致，都為前4天下降，4～8天上升。前4天微藻處于對數(shù)生長期，在該階段由于環(huán)境適宜、營養(yǎng)充分，微藻大量繁殖，其營養(yǎng)都供給細胞自身的構(gòu)建，沒有轉(zhuǎn)化為油脂貯存，甚至之前積累的油脂也被消耗，因而微藻油脂含量最低；經(jīng)過一段時間的生長，微藻的生長環(huán)境惡化，其生長停止，開始積累油脂，所以在4～8天藻油上升。觀察生長曲線，發(fā)現(xiàn)在BG-11中的微藻在8天后仍處于平穩(wěn)期，油脂含量有所上升，而污水和養(yǎng)殖沒有明顯的平穩(wěn)期，直接進入衰亡期，此階段油脂下降。這說明微藻生長中，平穩(wěn)期的延長有利于油脂的積累。

比較圖6中的生長曲線和油脂積累情況，發(fā)現(xiàn)在最大產(chǎn)量上養(yǎng)殖與標準培養(yǎng)基不相上下；而在油脂積累上，2種污水明顯不如BG-11，這是因為微藻油脂的積累主要發(fā)生在平穩(wěn)期，而污水中的平穩(wěn)期時間遠遠小于標準培養(yǎng)基。

4結(jié)語

(1)超聲波破碎法可有效破除微藻細胞壁的阻礙，增強NR的染色效果，尤其是對于厚壁的小球藻，其與DMSO相結(jié)合的染色效果更好。

(2)DMSO在尼羅紅熒光染色法中的主要作用是增強染色效果而非增加微藻細胞壁的通透性。

(3)利用NR追蹤微藻在培養(yǎng)過程中油脂含量的變化，發(fā)現(xiàn)平穩(wěn)期的延長有利于微藻油脂的積累。

(4)微藻在污水中的油脂含量不到培養(yǎng)基的一半說明污水不適合微藻積累油脂。

參考文獻

[1]SCOTT S A, DAVEY M P, DENNIS J S, et al. Biodiesel from algae:challenges and prospects[J]. Current Opinion in Biotechnology，2010,21(3):277-286.

[2]LIM S L, CHU W L, PHANG S M. Use ofChlorellavulgarisfor bioremediation of textile wastewater[J]. Bioresource Technology,2010,101(19):7314-7322.

[3]KRANZ R G， GABBERT K K，MADIDAN M T. Positive selection systems for discovery of novel polyester biosynthesis genes based on fatty acid detoxification[J]. Applied Microbiology,1997,63(8):3010-3013.

[4]石玉新, 穆迪, 武洪慶, 等. 微藻油脂含量的幾種快速測定方法[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012, 40(21): 11067-11069.

[5]HUANG G H，CHEN G，CHEN F. Rapid screening method for lipid production in alga based on Nile red fluorescence[J]. Biomass & Bioenergy,2009,33(10):1386-1392.

[6]王海英,符茹, 黃寶祥. 基于尼羅紅熒光染色的小球藻脂質(zhì)快速檢測方法研究[J]. 中國油脂，2012,37(3):78-81.

[7]CHEN W, ZHANG C, SONG L, et al. A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae[J]. Journal of Microbiological Methods,2009,77(1):41-47.

[8]方志聰, 戚智. 二甲基亞砜對生物膜的作用機理[J]. 生物物理學(xué)報，2012,28(8):638-643.

[9]AHKONG Q F, FISHER D, TAMPION W, et al. Mechanisms of cell fusion[J]. Nature. 1975,253(5488):194-195.

The Optimization and Application of Nile Red Fluorescent Determination

SHI JianZHANG WenjieFENG XunHU YutingYAO Chi

(NantongUniversityNantong,Jiangsu226019)

AbstractThe chlorella is screened as material to optimize Nile red fluorescent measure, and it is used to trance the variation on microalgae oil in sewage. The experiment finds out that the dye won’t work until microalgae is broken by ultrasonic, and the addition of DMSO will enhance fluorescence reaction. The optimization result is determined: VDMSO∶Vsewage=1∶5，5 min broke cell by ultrasonic and dye 5min,NR 1.5 μg/mL. As to the application, microalgae oil accumulation is only half compared to medium, indicating that sewage is not conducive to microalgae oil accumulation, and the best harvesting time is stationary phase, when the yield and oil content reaches the highest of micro algae.

Key WordschlorellaNile redultrasonicsewageoil

(收稿日期：2015-03-13)

作者簡介石健，女，1972年生，教授，主要研究方向為水污染控制技術(shù)。

*基金項目：國家自然科學(xué)基金(21177067)，江蘇省自然科學(xué)基金重點項目(BK2010034)，江蘇省基礎(chǔ)研究基金(BK2011009)，南通市社會發(fā)展項目(HS2012001)，南通市重點實驗室項目(CP12011001)，江蘇省青藍工程計劃項目。