范淑芳 簡大為 周志翔 寧國貴
摘要:【目的】篩選適宜藍莓品種陽光藍(Sunshine Blue)的離體繁殖條件,建立陽光藍組培快繁體系。【方法】以陽光藍無菌苗莖段為外植體進行離體繁殖,篩選適合其芽增殖及生根的培養(yǎng)基類型、莖段起始芽數(shù)、細胞分裂素、生長素、pH及活性炭(AC)添加量。【結(jié)果】陽光藍莖段在WPM培養(yǎng)基中增殖芽數(shù)最多,培養(yǎng)60 d時平均芽長較長,可作為陽光藍莖段增殖較佳的基本培養(yǎng)基;以起始芽數(shù)2芽莖段接種到WPM+2.0 mg/L ZT+0.01 mg/L IBA培養(yǎng)基上,培養(yǎng)30 d時增殖芽數(shù)為10.25個,顯著多于其他增殖培養(yǎng)基(P<0.05),培養(yǎng)60 d時增殖芽數(shù)達17.43個,增殖效果明顯優(yōu)于其他增殖培養(yǎng)基。在生根培養(yǎng)中,當生長素為0.10 mg/L IBA、添加1000.0 mg/L AC、培養(yǎng)90 d時生根率達87.50%,明顯優(yōu)于其他生根培養(yǎng)基?!窘Y(jié)論】陽光藍組培苗的離體繁殖以帶2個芽莖段在WPM+2.0 mg/L ZT+0.01 mg/L IBA中進行增殖培養(yǎng)、在1/2WPM+0.10 mg/L IBA+1000.0 mg/L AC中進行生根培養(yǎng)效果較佳。
關(guān)鍵詞: 藍莓;陽光藍;離體繁殖;條件篩選
中圖分類號: S663.035.3 文獻標志碼:A 文章編號:2095-1191(2016)11-1897-06
Abstract:【Objective】The present study was conducted to screen in vitro propagation condition for Vaccinium spp. Sunshine Blue in order to establish a rapid propagation system for blueberry Sunshine Blue. 【Method】In this experiment,using Sunshine Blues aseptic seedling stems as explants, proper medium, initial shoot number, cytokinins, auxins, pH value and activated carbon(AC) content which were suitable for shoot proliferation and rooting were screened. 【Result】At shoot proliferation stage,the stems cultured in WPM medium had the largest number of proliferation shoots and the average shoot length was long after 60 days of culture. Therefore, WPM medium could be used as a proper medium for stem proliferation. Inoculating the stems with two initial shoots into WPM+2.0 mg/L ZT+0.01 mg/L IBA medium, the number of proliferation shoots was 10.25 after 30 days of culture, significantly more than those in other media(P<0.05); the number reached 17.43 after 60 days of culture, which was more than those in other media. At rooting stage,the stems cultured in medium with 0.10 mg/L IBA auxin, 1000.0 mg/L activated carbon realized 87.5% rooting rate after 90 days of culture, which was higher than those cultured in other media. 【Conclusion】In terms of in vitro propagation of Vaccinium spp. Sunshine Blue stems with two initial shoots, the optimal medium for shoot proliferation is WPM+2.0 mg/L ZT+0.01 mg/L IBA, the most appropriate rooting medium is 1/2WPM+0.10 mg/L IBA+1000.0 mg/L AC.
Key words: Vaccinium spp.; Sunshine Blue; in vitro propagation; condition screening
0 引言
【研究意義】藍莓(Vaccinium spp.)又名越橘、藍漿果,為杜鵑花科(Ericaceae)烏飯樹(越橘)屬(Vaccinium)多年生落葉灌木,其果實富含花色素苷、黃酮等生理活性成分,具有增強心臟功能、明目及抗癌等獨特功效(Bliss,2002;Atalay et al.,2003;周劍忠等,2014),能有效預防腦神經(jīng)衰老及糖尿病等疾病發(fā)生(楊紅澎和蔣與剛,2010)。藍莓是美國主栽果樹品種(於虹和賀善安,2013),近年來在我國得到迅速發(fā)展,已成為我國最具發(fā)展?jié)摿Φ墓麡淦贩N之一,種苗供不應求(饒寶蓉等,2014)。通過組織培養(yǎng)和脫毒技術(shù)育苗可比常規(guī)方法育苗獲得更多、更健壯的種苗,但藍莓品種間差異較明顯,組織培養(yǎng)過程中所使用的基本培養(yǎng)基各不相同。陽光藍(Sunshine Blue)作為國內(nèi)新引進的優(yōu)良藍莓品種(葉振風等,2015),其離體繁殖的最佳培養(yǎng)條件尚未清楚。因此,篩選適合陽光藍離體繁殖的條件,建立其組培快繁體系,對實現(xiàn)其工廠化育苗具有重要意義。【前人研究進展】在藍莓增殖培養(yǎng)過程中生長素的應用必不可少。Line等(1990)使用IAA、Cao和Hammerschlag(2000)使用NAA、邵振中和吳曉波(2013)使用IBA均取得了較好的增殖效果。董朝莉(2009)研究認為,細胞分裂素的種類和濃度對藍莓離體增殖培養(yǎng)影響較明顯,加入1.0~2.0 mg/L ZT或10.0~20.0 mg/L 2ip增殖效果較佳。在藍莓試管苗生根培養(yǎng)方面,以1/2WPM為培養(yǎng)基添加不同濃度IBA在不同藍莓品種上均取得了較好的生根效果(孫書偉,2009;約旦等,2011;張彩玲和朱延明,2011;Zhao et al.,2011;楊艷敏等,2012;邵振中和吳曉波,2013);王平紅(2010)研究發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)基中添加1%~2%活性炭有利于誘導藍莓生根,但當活性炭用量超過2%時生根率反而下降;梁曉晶(2012)研究認為,pH對篤斯越橘組培苗的生根率具有顯著影響,最佳生根培養(yǎng)基的pH為4.8~6.0。【本研究切入點】目前,針對陽光藍離體繁殖的研究鮮見報道?!緮M解決的關(guān)鍵問題】以陽光藍莖段為外植體,探討不同培養(yǎng)基、不同莖段起始芽數(shù)、不同激素濃度、不同pH及活性炭用量等對其不定芽增殖分化、生根培養(yǎng)的影響,旨在建立陽光藍的組培快速繁體系,為其種苗的工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。
1 材料與方法
1. 1 試驗材料
剪取陽光藍當年生新枝為外植體,在初培培養(yǎng)基(Anderson+10.0 mg/L 2ip+0.10 mg/L IAA+30.0 g/L蔗糖+8.0 g/L瓊脂,pH 5.0)中培養(yǎng)30~60 d,視叢生芽誘導情況,將叢生苗切成0.8~1.0 cm長的莖段后接種到繼代培養(yǎng)基(Anderson+15.0 mg/L 2ip+0.10 mg/L IAA+ 30.0 g/L蔗糖+8.0 g/L瓊脂,pH 5.0)中,每60 d繼代1次,繼代培養(yǎng)2~3次獲得的組培苗用于增殖培養(yǎng)。
1. 2 試驗方法
1. 2. 1 增殖培養(yǎng)基類型及培養(yǎng)條件優(yōu)選 采用單因素設(shè)計,分別開展增殖培養(yǎng)基類型、莖段起始芽數(shù)、細胞分裂素、生長素優(yōu)選試驗。從上述試驗結(jié)果中選擇最佳因子,進行細胞分裂素和生長素雙因素設(shè)計,開展不同激素組合優(yōu)選試驗。每組試驗均選取生長一致的叢生苗,在超凈工作臺上切成長0.5~1.5 cm的小莖段(每組小莖段長度保持相對一致),每瓶接種4株,10次重復。接種后置于培養(yǎng)室,分別培養(yǎng)30和60 d后記錄叢生芽數(shù)量和計算平均芽長。
1. 2. 1. 1 增殖培養(yǎng)基類型優(yōu)選 在前期試驗的基礎(chǔ)上,分別在MS、WPM和Anderson培養(yǎng)基中添加15.0 mg/L 2ip和0.10 mg/L IAA,同時添加30.0 g/L蔗糖和8.0 g/L瓊脂,pH調(diào)至5.0,篩選出增殖效果最優(yōu)的基本培養(yǎng)基。
1. 2. 1. 2 增殖莖段起始芽數(shù)的優(yōu)選 將無菌苗分別切成帶2、4、6、8個腋芽的莖段和帶頂芽的8芽莖段,分別接種至Anderson+15.0 mg/L 2ip+0.10 mg/L IAA+ 30.0 g/L蔗糖+8.0 g/L瓊脂培養(yǎng)基上,pH調(diào)至5.0,篩選出最適增殖培養(yǎng)的莖段起始芽數(shù)。
1. 2. 1. 3 增殖細胞分裂素優(yōu)選 在Anderson+0.10 mg/L IAA+30.0 g/L蔗糖+8.0 g/L瓊脂培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,分別添加10.0、15.0和20.0 mg/L 2ip,或0.5、1.0和1.5 mg/L ZT,或0.50、1.00和1.50 mg/L 6-BA,pH調(diào)至5.0,共組成9個處理,篩選出增殖效果最優(yōu)的細胞分裂素。
1. 2. 1. 4 增殖生長素優(yōu)選 在Anderson+15.0 mg/L 2ip+30.0 g/L蔗糖+8.0 g/L瓊脂培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,分別添加0.05、0.10和0.20 mg/L的IAA、NAA和IBA,pH調(diào)至5.0,共組成9個處理,篩選出增殖效果最優(yōu)的生長素。
1. 2. 1. 5 增殖激素處理組合優(yōu)選 根據(jù)以上單因素試驗結(jié)果,以WPM為基本培養(yǎng)基,分別添加1.0、2.0和3.0 mg/L ZT及0.01、0.05和0.25 mg/L IBA,另外添加30.0 g/L蔗糖和8.0 g/L瓊脂,pH調(diào)至5.0,采用完全隨機試驗法組成9個處理,篩選出增殖效果最佳的激素處理組合。
1. 2. 2 生根培養(yǎng)基確定及培養(yǎng)條件優(yōu)選 結(jié)合前期試驗和增殖培養(yǎng)試驗結(jié)果,生根培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基確定為1/2WPM。采取單因素設(shè)計,分別開展生長素、pH、活性炭(AC)濃度優(yōu)選試驗。每組試驗均選取生長一致的叢生苗,在超凈工作臺上切成長2.0~2.5 cm的小莖段(每組小莖段長度保持相對一致),每瓶接種4株,10次重復。接種后置于培養(yǎng)室,90 d后記錄生根株數(shù)、每株生根條數(shù)并計算平均根長。
1. 2. 2. 1 生根pH優(yōu)選 以1/2WPM+0.50 mg/L IBA+ 20.0 g/L蔗糖+8.0 g/L瓊脂為生根培養(yǎng)基,將pH分別調(diào)至4.5、5.0、5.5和6.0,篩選出誘導生根效果最佳的pH。
1. 2. 2. 2 生根生長素優(yōu)選 在1/2WPM培養(yǎng)基中分別添加0.10、0.50和1.00 mg/L的IAA、NAA和IBA,同時添加20.0 g/L蔗糖、8.0 g/L瓊脂,pH調(diào)至5.0,共組成9個處理,篩選出誘導生根效果最佳的生長素。
1. 2. 2. 3 生根AC優(yōu)選 在1/2WPM+0.50 mg/L IBA+20.0 g/L蔗糖+8.0 g/L瓊脂的培養(yǎng)基中分別添加0 (CK)、200.0、500.0和1000.0 mg/L AC,篩選出誘導生根效果最佳的AC濃度。
1. 3 其他培養(yǎng)條件
設(shè)培養(yǎng)室溫度為(25±2)℃、相對濕度70%、光照度2000 lx,每天光照14 h。
1. 4 統(tǒng)計分析
試驗數(shù)據(jù)以Excel 2003和SAS 9.2進行統(tǒng)計分析。
2 結(jié)果與分析
2. 1 不同基本培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件對陽光藍莖段的增殖效果
2. 1. 1 不同基本培養(yǎng)基的增殖效果 由表1可知,陽光藍莖段在MS、WPM和Anderson 3種基本培養(yǎng)基中均能進行增殖培養(yǎng),但增殖效果差異較明顯。在增殖培養(yǎng)30和60 d時,陽光藍莖段在WPM培養(yǎng)基中的增殖芽數(shù)均最多,分別為4.75和12.88個,顯著多于MS和Anderson培養(yǎng)基(P<0.05,下同);培養(yǎng)30 d時,陽光藍莖段在MS培養(yǎng)基中的平均芽長最長,顯著長于WPM培養(yǎng)基,培養(yǎng)60 d時仍以MS培養(yǎng)基中的平均芽長最長,但與WPM和Anderson培養(yǎng)基的差異不顯著(P>0.05,下同)。綜合考慮,確定WPM培養(yǎng)基是最有利于陽光藍莖段增殖培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基。
2. 1. 2 不同起始芽數(shù)莖段的增殖效果 由表2可知,隨著陽光藍莖段起始芽數(shù)的增多,培養(yǎng)60 d的增殖芽數(shù)及培養(yǎng)30和60 d的單芽增殖芽數(shù)均逐漸減少。其中,在增殖培養(yǎng)30 d時,起始芽數(shù)為2芽莖段的增殖芽數(shù)最少,起始芽數(shù)為4芽莖段次之,二者差異不顯著,但均顯著少于起始芽數(shù)為6和8芽(含頂芽)莖段,培養(yǎng)至60 d時,起始芽數(shù)為2芽莖段的增殖芽數(shù)最多,4芽莖段次之,與6和8芽莖段差異不顯著;在增殖培養(yǎng)30和60 d時,起始芽數(shù)為2芽莖段平均單芽的增殖芽數(shù)分別為1.99和5.14個,均顯著多于其他起始芽數(shù)莖段。由表2還可看出,在增殖培養(yǎng)30 d時,起始芽數(shù)為2芽莖段的平均芽長除顯著短于起始芽數(shù)為4芽莖段外,與其他起始芽數(shù)莖段差異均不顯著,在增殖培養(yǎng)60 d時,起始芽數(shù)為2芽莖段的平均芽長除顯著短于起始芽數(shù)為8芽(含頂芽)莖段外,與其他起始芽數(shù)莖段差異也不顯著。綜合考慮,起始芽數(shù)為2芽的莖段增殖芽數(shù)最多、最節(jié)約起始材料,可確定2個芽為最適合陽光藍莖段增殖培養(yǎng)的起始芽數(shù)。
2. 1. 3 不同細胞分裂素的增殖效果 由表3可知,在增殖培養(yǎng)30 d時,添加1.5 mg/L ZT培養(yǎng)基的陽光藍莖段增殖芽數(shù)最多,為5.13個,顯著多于其他8個處理;至增殖培養(yǎng)60 d時,仍以添加1.5 mg/L ZT培養(yǎng)基的增殖芽數(shù)最多,為13.50個,除與添加20.0 mg/L 2ip培養(yǎng)基的增殖芽數(shù)差異不顯著外,均顯著多于其他7個處理;在添加2ip、ZT及6-BA的各處理中,增殖芽數(shù)均隨添加濃度的升高而增多。從表3還可看出,在增殖培養(yǎng)30和60 d時,添加不同濃度ZT培養(yǎng)基的陽光藍莖段平均芽長均顯著長于添加2ip培養(yǎng)基的芽長,且各濃度處理平均芽長多數(shù)長于6-BA處理或與6-BA處理相當。綜合考慮增殖芽數(shù)和芽長表現(xiàn)認為,添加較高濃度細胞分裂素更有利于陽光藍莖段的增殖培養(yǎng),尤以添加1.5 mg/L ZT的增殖效果更佳。
2. 1. 4 不同生長素的增殖效果 由表4可知,陽光藍莖段的增殖芽數(shù)均隨著IAA、IBA和NAA濃度的升高而減少;同種生長素均以低濃度更有利于陽光藍莖段腋芽增殖。其中,在添加NAA的處理中,0.10和0.20 mg/L NAA處理容易誘導產(chǎn)生大量愈傷組織,或剛開始可誘導產(chǎn)生少量芽叢,但隨后愈傷組織生長速度明顯快于芽叢,最終導致芽叢趨于死亡(各組數(shù)據(jù)記為0.00)。由表4還可看出,在增殖培養(yǎng)60 d時,添加不同濃度IBA處理的芽長總體上略長于添加相應濃度IAA處理的芽長,且個別處理差異達顯著水平。綜合考慮增殖芽數(shù)和芽長表現(xiàn)認為,0.05~0.10 mg/L IBA可作為藍莓莖段增殖培養(yǎng)較佳的生長素。
2. 1. 5 不同激素組合的增殖效果 由表5可知,當ZT濃度一定時,隨著IBA濃度的升高,陽光藍莖段的增殖芽數(shù)逐漸減少,而芽長逐漸增長;當IBA濃度一定時,隨著ZT濃度的升高,陽光藍莖段的增殖芽數(shù)呈先上升后下降趨勢,芽長呈逐漸降低趨勢。在增殖培養(yǎng)30 d時,2.0 mg/L ZT+0.01 mg/L IBA組合陽光藍莖段的增殖芽數(shù)最多,為10.25個,顯著多于其他激素組合,但芽長較短,僅0.70 cm;在增殖培養(yǎng)60 d時,各激素組合的增殖芽數(shù)均明顯增加,仍以2.0 mg/L ZT+0.01 mg/L IBA組合的增殖芽數(shù)最多,顯著多于除2.0 mg/L ZT+0.05 mg/L IBA和3.0 mg/L ZT+0.01 mg/L IBA組合外的其他激素組合,芽長為1.57 cm,與多數(shù)激素組合差異不顯著。綜合考慮增殖芽數(shù)和芽長表現(xiàn),可確定2.0 mg/L ZT+0.01 mg/L IBA為陽光藍莖段增殖培養(yǎng)較佳的激素組合。
2. 2 不同培養(yǎng)條件對陽光藍莖段增殖苗的生根效果
2. 2. 1 不同pH的生根效果 由表6可知,在1/2WPM 培養(yǎng)基中,不同pH對陽光藍莖段增殖苗的生根率、平均生根數(shù)和根長均有明顯影響,當培養(yǎng)基pH為4.5和5.0時生根率較高,平均生根數(shù)較多,根長較長,且均顯著高于pH為5.5和6.0的培養(yǎng)基。因此,可確定4.5~5.0為適宜陽光藍莖段增殖苗生根培養(yǎng)的pH。
2. 2. 2 不同生長素的生根效果 由表7可知,在1/2WPM培養(yǎng)基中,0.10 mg/L IBA、IAA和NAA處理陽光藍莖段增殖苗的生根率、平均生根數(shù)和根長均較高,三者間差異不顯著,但明顯優(yōu)于其他濃度生長素處理。其中,0.10 mg/L IBA處理陽光藍莖段增殖苗的生根率最高,平均生根數(shù)最多,平均根長最長,可確定為藍莓莖段增殖苗生根培養(yǎng)較佳的生長素。
2. 2. 3 不同濃度AC的生根效果 由表8可知,在1/2WPM培養(yǎng)基中添加不同濃度AC均有利于陽光藍莖段增殖苗生根,隨著AC濃度的增加其生根率、平均生根條數(shù)和根長均明顯增加。其中,添加1000.0 mg/L AC處理的生根率最高,為87.50%,顯著高于0和200.0 mg/L處理;根長最長,為1.69 cm,顯著長于0、200.0和500.0 mg/L處理;平均生根條數(shù)最多,為3.83條。因此,可確定添加1000.0 mg/L AC較有利于陽光藍莖段增殖苗生根。
3 討論
本研究結(jié)果表明,MS、Anderson和WPM 3種基本培養(yǎng)基均可應用于藍莓品種陽光藍的增殖培養(yǎng),以WPM培養(yǎng)基的增殖培養(yǎng)效果更佳,與Wolfe等(1983)的研究結(jié)果相同,也與當前藍莓組培生產(chǎn)或研究中多應用WPM培養(yǎng)基或改良WPM培養(yǎng)基為增殖培養(yǎng)基的情況相符(約旦等,2011;張彩玲和朱延明,2011;楊艷敏等,2012;邵振中和吳曉波,2013)。
針對不同起始芽數(shù)莖段對增殖效果影響的研究至今未見報道。在本研究中,隨著陽光藍莖段起始芽數(shù)的增多,總的增殖芽數(shù)逐漸增加,但對單芽增殖芽數(shù)而言,起始芽數(shù)為4、6和8芽莖段的增殖芽數(shù)比起始芽數(shù)為2芽莖段的增殖芽數(shù)少,平均芽長總體上相差不明顯,說明起始芽數(shù)少的莖段增殖效果更佳,可能是由于起始芽數(shù)多的莖段中激素或營養(yǎng)物質(zhì)輸送受阻,致使莖段基部的芽較上部的芽更容易萌發(fā)增殖,而莖段上部的芽萌發(fā)少或完全不能萌發(fā)增殖。就實際生產(chǎn)而言,若用芽數(shù)更少的莖段就能達到與芽數(shù)較多莖段相同的增殖效果,既可節(jié)約外植體,又減少操作工時,提高擴繁效率。
本研究結(jié)果表明,細胞分裂素ZT處理的陽光藍莖段增殖效果優(yōu)于2ip處理,與董朝莉(2009)研究認為1.0~2.0 mg/L的ZT或10~20 mg/L 2ip對藍莓增殖效果較好的觀點相似。在本研究中,0.05 mg/L IBA、IAA和NAA配合細胞分裂素均可有效促進陽光藍莖段增殖,以IBA配合細胞分裂素的增殖效果略優(yōu)于IAA,與Litwin■czuk和Wadas(2008)對藍莓的增殖培養(yǎng)結(jié)果一致;稍高濃度(0.10和0.20 mg/L)NAA處理陽光藍莖段會產(chǎn)生大量的愈傷組織并萌生叢生芽,且叢生芽不能正常生長,與寧志怨等(2007對藍莓的研究結(jié)果存在差異,可能與進行組培增殖所用品種不同有關(guān);在不同激素組合篩選試驗中,ZT的濃度不是越高越好,以2.0 mg/L ZT+0.01 mg/L IBA組合的增殖效果最佳,與邵振中和吳曉波(2013)的研究結(jié)果一致。
在本研究中,低濃度(0.10 mg/L)IBA誘導生根效果較佳,與宋剛等(2011)、王淑珍等(2011)的研究結(jié)果一致,但0.10 mg/L為本研究設(shè)計的最低使用濃度,更低濃度IBA的生根效果是否更佳,有待進一步探究證實;在pH對生根影響方面,pH為4.5~5.0培養(yǎng)基的誘導生根效果較佳,與梁曉晶(2012)對篤斯越橘的研究結(jié)果相似;在生根培養(yǎng)基中添加1000.0 mg/L AC最有利于陽光藍生根,生根率達87.50%,與王平紅(2010)對藍莓生根的研究結(jié)果一致,但1000.0 mg/L AC為本研究設(shè)計的最高濃度,更高濃度AC的生根效果是否更佳,也有待進一步證實。
4 結(jié)論
本研究結(jié)果表明,以藍莓品種陽光藍帶2個腋芽的組培苗莖段進行離體繁殖,其最佳增殖培養(yǎng)基為WPM+2.0 mg/L ZT+0.01 mg/L IBA,最佳生根培養(yǎng)基為1/2WPM+0.1 mg/L IBA+1000.0 mg/L AC。
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(責任編輯 思利華)