趙永紅 李嬋 梅嘉洺

摘 要 利用SCoT分子標(biāo)記對47個(gè)菌草種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析。從20個(gè)SCoT引物中篩選出10個(gè)擴(kuò)增效果好的引物，對47份菌草種質(zhì)材料的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共獲得282個(gè)多態(tài)片段。結(jié)合UPGMA聚類分析方法，算出47份種質(zhì)材料間的遺傳相似系數(shù)（SM）在0.77-0.96，所有47份材料被區(qū)分開來，在遺傳相似系數(shù)為0.815時(shí)，47份材料可分為5大類群。研究結(jié)果表明，SCoT分子標(biāo)記技術(shù)可有效用于菌草資源的遺傳多樣性分析。

關(guān)鍵詞 菌草 ；SCoT分子標(biāo)記 ；種質(zhì)資源 ；遺傳多樣性

中圖分類號 S216

Abstract The genetic diversity of 47 Juncao germplasms was analyzed by SCoT markers. Twenty ScoT primers were first used for screening on a subset of four germplasms， of which 10 gave good amplification patterns and were then used for analyzing the DNA of 47 JUNCAO germplasms. A total of 282 polymorphic DNA fragments were scored among the 47 JUNCAO germplasms from the electrophoresis patterns of the 10 selected SCoT primers. By using the NTSYS-pc 2.1 software combined with UPGMA clustering analysis method， the genetic similarity coefficient （SM） was calculated among all accessions and ranged from 0.77 to 0.96. All the 47 accessions were distinguished from each other. The 47 JUNCAO germplasms were clustered into five groups when the genetic similarity coefficient was 0.815. Our results showed that the SCoT markers could be effectively used for analysis of genetic diversity of Juncao germplasms.

Key words Juncao ； ScoT ； Germplasm ； Genetic diversity

菌草（JUNCAO）是指可用于栽培食用菌、藥用菌、培養(yǎng)基的野生和人工栽培的草本植物[1]，如：蘆竹、蘆葦、類蘆等野生系列，還包括綠洲系列蘆竹、巨菌草、象草等人工栽培系列，廣義的菌草還包括甘蔗、玉米、高粱等作物。菌草一般叢生、直立，根系發(fā)達(dá)，產(chǎn)量高，多數(shù)菌草適應(yīng)性廣，抗逆性強(qiáng)，適應(yīng)于各種類型的土壤，酸性粗砂質(zhì)紅壤和輕度鹽堿地均能生長。菌草用途廣泛，可作為豬、牛、羊等動(dòng)物的飼料，可用于栽培食用菌，還可做非木材纖維制漿造紙?jiān)?，制造燃料乙醇等能源，同時(shí)還可以用于防止水土流失等。隨著菌草技術(shù)的完善和產(chǎn)業(yè)不斷壯大，關(guān)于菌草種質(zhì)資源的收集、保存、鑒定及利用工作變得越來越迫切和重要。但是，由于可用作菌草的植物種類繁多，使得菌草種質(zhì)資源在管理上存在一定盲目性和重復(fù)性。因而從分子水平上研究菌草種質(zhì)資源遺傳的多樣性以及建立菌草種質(zhì)分子鑒定技術(shù)非常重要。

隨著DNA分子標(biāo)記技術(shù)以及結(jié)構(gòu)和功能基因組學(xué)的飛速發(fā)展，標(biāo)記類型已由隨機(jī)DNA分子標(biāo)記（RDMs， random DNA markers）向功能性分子標(biāo)記（FMs，functional markers）和目的基因分子標(biāo)記（GTMs，gene targeted markers）發(fā)展。RDMs（如AFLP、RAPD、RFLP等）基于基因組中隨機(jī)多態(tài)性位點(diǎn)開發(fā)而成，檢測的多態(tài)性在基因組的位置大多隨機(jī)分布，因此獲得的位點(diǎn)通常與目標(biāo)性狀基因距離較遠(yuǎn)，這使得它在應(yīng)用上與其目標(biāo)有一定的偏差[2-3]。GTMs（如SCoT、SPAR等）和FMs因其本身可能是目的基因的一部分或者與目的基因緊密連鎖而受到研究者的重視[4]。

目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性（SCoT，start codon targeted polymorphism）標(biāo)記是Collard和Mackill[5]于2009年在水稻上新開發(fā)的一種目的基因分子標(biāo)記。其原理是利用植物基因組中ATG翻譯起始位點(diǎn)側(cè)翼保守序列來設(shè)計(jì)引物，進(jìn)而擴(kuò)增產(chǎn)生偏向候選功能基因區(qū)顯性多態(tài)性標(biāo)記。這種標(biāo)記不僅能獲得與性狀聯(lián)系緊密的目的基因，并能對性狀進(jìn)行跟蹤，具有操作簡單、多態(tài)性高、遺傳信息豐富、成本低廉、引物通用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[4]。經(jīng)過近幾年的迅速發(fā)展，該類標(biāo)記已被成功應(yīng)用于花生[6]、芒果[7]、枇杷[8]、草莓[9]、苜蓿[10]、甘蔗[11]、高牛鞭草[12]、木瓜[13]、枝稷[14]、鴨茅[15]等多種植物和多個(gè)研究領(lǐng)域的相關(guān)遺傳研究中，在植物種質(zhì)資源遺傳多樣性與親緣關(guān)系分析、種質(zhì)鑒定和指紋圖譜構(gòu)建、基因差異表達(dá)和分子圖譜構(gòu)建等方面均取得了階段性的進(jìn)展。目前，有關(guān)菌草種質(zhì)資源多樣性的研究報(bào)道較少，梅嘉洺等[16]在菌草上利用PCR-RFLP技術(shù)對46份種質(zhì)資源PEPC基因進(jìn)行了多樣性分析。本研究在此基礎(chǔ)上，采用SCoT分子標(biāo)記技術(shù)對47份菌草種質(zhì)材料遺傳多樣性進(jìn)行較為系統(tǒng)的分析，初步揭示不同菌草種質(zhì)間親緣關(guān)系，為菌草種質(zhì)資源管理和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

47份菌草材料取自福建農(nóng)林大學(xué)國家菌草工程技術(shù)研究中心福州種質(zhì)資源圃（表1）。采集各品種（系）幼嫩葉片，裝入編號袋，保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取和檢測

采用改良的CTAB法提取基因組DNA[17]，然后進(jìn)行1.2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品質(zhì)量，并在Nanodrop 2000（Thermo Fisher）分光光度計(jì)上測定DNA樣品濃度。先將母液濃度稀釋至200 ng/mL，再取少量配置成濃度20 ng/mL溶液，置于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SCoT-PCR反應(yīng)體系

PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為10 μL。其中包括DNA模板（20 ng/μL）2 μL，引物0.5 μL，2×Taq PCR Starmix（GenStar）5 μL，dd H2O 2.5 μL。引物由上海生工合成。PCR酶試劑購自北京康潤誠生物技術(shù)有限公司。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；隨后72 ℃延伸7 min，最后4 ℃恒溫保存。

1.3 PCR產(chǎn)物凝膠電泳和成像分析

取5 μL PCR擴(kuò)增液，在1.2 %瓊脂糖、TAE×1、120 V條件下電泳50 min，在凝膠成像儀（伯樂）上觀察結(jié)果并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

對每個(gè)SCoT引物在47份材料上的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果進(jìn)行人工比對校正，在相同遷移位置，有強(qiáng)帶或清晰弱帶記“1”，無條帶記為“0”，建立原始數(shù)據(jù)（0，1）矩陣。利用NTSYS-pc 2.1軟件中的子程序SIMQUAL對矩陣進(jìn)行樣本之間的相似性系數(shù)（SM）計(jì)算，然后用子程序SAHN中的非加權(quán)類平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析，最后用Tree plot繪制樹狀聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR引物篩選

首先，用20個(gè)引物對4個(gè)菌草材料（象草、綠洲4號、聚穗高粱、甘蔗MOL-6081）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明：所有20個(gè)引物都能在部分或全部供試材料上擴(kuò)增出多條強(qiáng)度不同的DNA片段（圖1）。其中10個(gè)引物擴(kuò)增結(jié)果清晰、均勻（如圖1中的SCoT01，SCoT02和SCoT15），因而用來作進(jìn)一步擴(kuò)增材料。而剩下的10個(gè)引物條帶不夠清晰（如圖1中的SCoT14和SCoT18）或在某個(gè)材料上條帶較弱甚至無任何條帶（如圖1中的SCoT13），而未被選擇作進(jìn)一步分析。

2.2 遺傳多樣性分析

用篩選出的10個(gè)引物對47份菌草種質(zhì)材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳。分析結(jié)果表明：在47份試驗(yàn)材料上，單個(gè)SCoT引物可以給出18-38個(gè)多態(tài)DNA片段，10個(gè)SCoT引物共給出了282個(gè)多態(tài)片段，平均每個(gè)引物給出28.2片段（表2）。引物SCoT06和SCoT07在47份菌草種質(zhì)材料上的PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖2。

2.3 菌草種質(zhì)的聚類分析

47份菌草種質(zhì)材料的SCot分子標(biāo)記的UPGMA聚類分析結(jié)果見圖3。聚類分析表明，供試材料之間的遺傳相似系數(shù)（SM）分布在0.77-0.96，在遺傳相似系數(shù)為0.815時(shí)，可以將47份菌草種質(zhì)材料分成I、II、III、IV 、V 5個(gè)類群。

第I類群包括23份種質(zhì)材料，是最大的一個(gè)類群，其中包含巨菌草1號、紅象草、雜交象草、萊牧、雜交狼尾草、海南象草、象草N85、象草、漳州象草、熱研4號粗莖象草、細(xì)莖象草、桂草1號、桂閔引象草、巨菌草、桂牧1號、巴西蔗、王草、萊牧1號、南牧2號、臺(tái)灣甜草、高丹草變種、象草N51、矮象草等，該類群內(nèi)的23份材料都屬于狼尾草屬（Pennisetum）植物。在遺傳相似系數(shù)為0.85時(shí)，可以將該類群的23份材料進(jìn)一步分為3個(gè)亞類群：第一亞類群包括巨菌草1號、紅象草、雜交象草、萊牧、雜交狼尾草、海南象草、象草N85、象草、漳州象草、熱研4號粗莖象草、細(xì)莖象草、桂草1號等12份材料；第二亞類群包括桂閔引象草、巨菌草、桂牧1號、巴西蔗、王草、萊牧1號、南牧2號等7份材料；第三亞類群包括臺(tái)灣甜草、高丹草變種、象草N51、矮象草等4份材料。其中，臺(tái)灣甜草和高丹草變種之間的遺傳距離最相近，遺傳相似系數(shù)高達(dá)0.965；象草N85和象草之間的遺傳距離也較為相近，遺傳相似系數(shù)為0.962。

第II和第III類群各分別包含1份種質(zhì)。第II類含狼尾草，第III類群含美洲狼尾草，二者與第I大類群的23份材料都屬狼尾草屬（Pennisetum）植物。

第IV類群包含13份種質(zhì)材料，其中包括81.95象草（Pennisetum）、海南水竹（Phyllostachys）、斑毛（Saccharum）、高粱（Sorghum）2個(gè)、薏苡（Coix）、類蘆（Neyraudia）、莆田蘆葦（Phragmitas）、五節(jié)芒（Miscanthus）、彼特草（Saccharum）、閩牧42、甘蔗（Saccharum）2個(gè)共13份種質(zhì)。在遺傳相似系數(shù)為0.825時(shí)，可以將該類群的13份材料進(jìn)一步分為2個(gè)亞類群：第一個(gè)亞類群包括81.95象草、海南水竹、斑毛、高粱2個(gè)、薏苡、類蘆、莆田蘆葦、五節(jié)芒9份材料；第二個(gè)亞類群包括彼特草、閩牧42、甘蔗2個(gè)共4份材料。其中，2個(gè)高粱材料之間的遺傳距離最相近，遺傳相似系數(shù)高達(dá)0.942；2個(gè)甘蔗材料之間的遺傳距離也較為相近，遺傳相似系數(shù)為0.878。

第V類群包括了所有蘆竹屬（Arundo）的9份材料，其中綠洲8號和花葉蘆竹之間的遺傳距離最為相近，遺傳相似系數(shù)高達(dá)0.962；綠洲4號和綠洲5號之間的遺傳距離也較為相近，遺傳相似系數(shù)為0.946；而綠洲3號和綠洲6號與其余的7份材料明顯區(qū)別開來，它們之間的遺傳相似系數(shù)僅為0.810。

3 討論與結(jié)論

隨著DNA分子標(biāo)記技術(shù)及其結(jié)構(gòu)和功能基因組學(xué)的飛速發(fā)展，分子標(biāo)記種類越來越多，但是，與傳統(tǒng)分子標(biāo)記相比，SCoT是一種能產(chǎn)生與功能性狀遺傳連鎖的標(biāo)記，可以對研究目標(biāo)性狀進(jìn)行有效跟蹤，具有操作簡單、多態(tài)性高、遺傳信息豐富、成本低廉、引物通用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[4]，因此，其在相關(guān)重要功能基因研究以及分子標(biāo)記輔助育種中具有十分重要的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，受到眾多研究學(xué)者的青睞。

種質(zhì)資源是菌草產(chǎn)業(yè)技術(shù)發(fā)展的重要基礎(chǔ)，而遺傳多樣性是種質(zhì)資源研究的重要內(nèi)容。近年來，隨著菌草產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，我國已積累了一定的菌草種質(zhì)資源，但針對菌草種質(zhì)資源的深入研究仍相對較少，這在一定程度上限制了菌草產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。梅嘉洺等[15]在菌草上利用PCR-RFLP技術(shù)對46份種質(zhì)資源PEPC基因進(jìn)行了多樣性分析，利用12對PEPC特異性引物對供試材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物再經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶Hae III酶切、電泳，在46份材料上共獲得176個(gè)變異類型，UPGMA聚類分析表明供試材料間遺傳相似系數(shù)在0.86-1，在遺傳相似系數(shù)為0.865時(shí)，可以將46份材料分為四大類群。本研究在此基礎(chǔ)上，采用SCoT新型分子標(biāo)記技術(shù)對47份菌草種質(zhì)材料遺傳多樣性進(jìn)行了較為系統(tǒng)的分析，選出的10個(gè)SCoT引物在47份菌草種質(zhì)材料上共給出了282條多態(tài)片段，UPGMA聚類分析表明，供試材料間遺傳相似系數(shù)在0.77-0.96，在遺傳相似系數(shù)0.815時(shí)，可以將47份材料分為5個(gè)類群（圖3）。本結(jié)果中的第I、IV和V類群和梅嘉洺等[14]聚類圖中的第I、II和III類群相對應(yīng)，但也給出了新的結(jié)果內(nèi)容：（1）先前的研究未能將海南象草和細(xì)莖象草、漳州象草和熱研4號粗莖象草、臺(tái)灣甜草和高丹草變種等三對材料區(qū)別開來，而本研究利用10個(gè)SCoT引物將所有47份供試材料全部區(qū)別開來，顯示了SCoT標(biāo)記技術(shù)在菌草品系材料鑒定方面應(yīng)用潛力；（2）先前的研究結(jié)果顯示狼尾草、美洲狼尾草和81.95象草和其它23份同屬狼尾草屬（Pennisetum）植物遺傳距離較遠(yuǎn)但被分配到同一個(gè)類群中，而本研究中，狼尾草和美洲狼尾草各自形成單獨(dú)的類群（II和III），81.95象草被分配到了另一個(gè)含有甘蔗、高粱等材料的第IV類群中，揭示了狼尾草屬的菌草種質(zhì)材料間存在巨大的遺傳多樣性；（3）先前的研究結(jié)果顯示類蘆和莆田蘆葦形成一個(gè)單獨(dú)的類群，而在本研究中，這2個(gè)材料被分配到含有甘蔗、高粱等材料的第IV類群中；（4）目前沒有閔牧42這份材料的植物學(xué)分類信息，在本研究的聚類分析中，它被分配在彼特草（Saccharum）和2個(gè)甘蔗材料（Saccharum）之間，結(jié)合先前的聚類分析結(jié)果，推斷閔牧42應(yīng)該屬于甘蔗屬（Saccharum）；（5）本研究聚類分析顯示，第I、III和V大類群內(nèi)有明顯的亞類群結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果雖然還不夠完善，但為菌草種質(zhì)資源的鑒定提供了初步的分子依據(jù)和技術(shù)手段，未來可望將該技術(shù)在菌草上進(jìn)一步推廣，通過采用更多的SCoT引物以及分析更多的菌草種質(zhì)材料，同時(shí)還可以結(jié)合采用其它分子標(biāo)記技術(shù)，如ISSR[18]、SRAP[19]、iPBS[20]等，以獲得更加全面、可靠的聚類分析結(jié)果，為菌草種質(zhì)資源的收集、管理和利用提供參考。

致謝 感謝福建農(nóng)林大學(xué)國家菌草工程技術(shù)研究中心劉斌、林輝、吳金壽等老師提供的植物材料。

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