王繼剛　華子春　林青松

2015年，中國科學(xué)家屠呦呦因發(fā)現(xiàn)青蒿素而獲諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。青蒿素的發(fā)現(xiàn)為治療瘧疾做出了革命性貢獻(xiàn)，然而其精確的抗瘧機(jī)理幾十年來卻依然不甚明了。最近，科學(xué)家利用化學(xué)蛋白組學(xué)的手段更加清晰地闡明了青蒿素特異高效的抗瘧機(jī)理，從分子層面解開了青蒿素抗瘧的神秘面紗。

瘧疾是一種由寄生蟲感染而引起的惡性疾病。世界衛(wèi)生組織估計(jì)每年約有2億人感染，66萬人死于瘧疾。絕大多數(shù)受害者是不到5歲的兒童，受到瘧疾威脅的人口則多達(dá)32億人。瘧原蟲感染人體后會在短時間內(nèi)破壞人體內(nèi)80%的紅細(xì)胞，威脅患者生命。

在眾多的治療瘧疾藥物中，青蒿素是最為有效的一種。青蒿素是從一種稱為黃花蒿的植物中提取的天然化合物。30多年前，中國科學(xué)家屠呦呦最早發(fā)現(xiàn)并證明青蒿素在治療瘧疾中的重要作用。青蒿素的發(fā)現(xiàn)和廣泛使用使得每年數(shù)百萬瘧疾感染者免于死亡的威脅。雖然青蒿素作為一種最有效的抗瘧藥物得到廣泛使用，但其抗瘧機(jī)制仍不明了。更令人擔(dān)憂的是，最新的研究還發(fā)現(xiàn)了對青蒿素產(chǎn)生抗藥性的病例，一旦瘧原蟲對青蒿素產(chǎn)生耐藥性并大面積傳播，必將給人類帶來一場大災(zāi)難。因此，研究青蒿素內(nèi)在的抗瘧機(jī)制對于控制青蒿素的抗藥性及開發(fā)新型抗瘧藥物有著重要意義。

瘧疾與青蒿素

人們往往以為獅子和鯊魚是兇猛殘暴的動物，然而據(jù)研究，每年死于這些猛獸的僅有幾十人。蚊子是人們熟悉又討厭的昆蟲，大家絕對不會想到，世界上最危險的動物居然是小小的蚊子。有些蚊子攜帶著具有傳播性的瘧原蟲，人被這些蚊子叮咬后，會染上致命的疾病——瘧疾。

青蒿素是目前最強(qiáng)有效的抗瘧藥物。它能夠在幾小時內(nèi)起效，并快速殺滅人體血細(xì)胞內(nèi)的寄生蟲，被認(rèn)為是抗擊瘧疾的最后一道防線。青蒿素是一種特殊的具有過氧橋結(jié)構(gòu)的倍半萜內(nèi)酯類化合物，為無色針狀晶體，易溶于醋酸乙酯、氯仿丙酮、乙醚等溶劑，但幾乎不溶于水，相對分子質(zhì)量282.33，是從菊科植物黃花蒿中分離出來的。近年來，青蒿素及其多種衍生物被廣泛應(yīng)用于瘧疾的臨床治療，其中包括雙氫青蒿素、青蒿琥酯和蒿乙醚，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)中都帶有具活性的過氧橋結(jié)構(gòu)。

主流的青蒿素抗瘧機(jī)理假說

青蒿素在其被發(fā)現(xiàn)并廣泛運(yùn)用幾十年后，其準(zhǔn)確的作用機(jī)制依然沒有定論。在東南亞某些地區(qū)，已發(fā)現(xiàn)一些青蒿素逐步耐藥的跡象，一旦青蒿素耐藥并大面積傳播，必將給人類帶來一場大災(zāi)難。

青蒿素抗瘧機(jī)理的研究有兩個難點(diǎn)：第一，青蒿素是一個前體藥物，本身沒有很活躍的性質(zhì)，需要通過其他物質(zhì)的激活，才能變成高殺傷力的藥物，但對于激活劑及其來源是什么，一直都有很多爭論。第二，青蒿素被激活后，是通過結(jié)合哪些生物分子來殺滅瘧原蟲的，也一直是懸而未決的問題。

在青蒿素如何被激活的問題上，游離的二價鐵離子和血紅素都曾被認(rèn)為是青蒿素活化所需要的二價鐵離子的來源，但是相關(guān)研究的結(jié)果卻互相矛盾。關(guān)于青蒿素的作用靶點(diǎn)，可從眾說紛紜中歸納為以下幾種假說。

（1）血紅素結(jié)合模型。梅什尼克（S.Meshnick）早期在質(zhì)譜研究中觀察到血紅素被青蒿素烷基化的結(jié)合產(chǎn)物，并在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)青蒿素與血紅素的反應(yīng)產(chǎn)物能氧化紅細(xì)胞膜上的巰基。類似的青蒿素烷基化血紅素的結(jié)果，在其他實(shí)驗(yàn)室的研究中也得到了驗(yàn)證。之后，羅伯特（A.Robert）在用青蒿素治療處理后的被鼠瘧感染的小鼠的脾臟和尿液中，也分離鑒定到青蒿素與血紅索的烷基化產(chǎn)物。但隨后的實(shí)驗(yàn)揭示青蒿素對血紅素的烷基化并不是其抗瘧作用所必需的。

（2）肌漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣ATP酶靶點(diǎn)理論。該理論最早由克里什納（S.Krishna）提出。他根據(jù)青蒿素在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與毒胡蘿卜素（thapsigargin）的相似性，及后者能特異地結(jié)合并抑制肌漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣ATP酶（PfATP6），推測青蒿素可能會對PfATP6有潛在抑制作用。他利用在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中表達(dá)PfATP6來進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)青蒿素的確對這類蛋白有抑制作用。此理論曾風(fēng)靡一時，但后來越來越多的學(xué)者質(zhì)疑該理論：有些實(shí)驗(yàn)不能被重復(fù)，或者認(rèn)為PfATP6即使是青蒿素的靶蛋白，但也不一定是最重要的靶蛋白。

此外，還有一些其他蛋白被認(rèn)為是青蒿素的靶蛋白，如轉(zhuǎn)移控制腫瘤蛋白，氯喹抗性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，消化泡上的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等，但都沒有足夠證據(jù)證明這些蛋白與青蒿素抗瘧作用有直接關(guān)系。

（3）線粒體模型理論。有研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素能抑制釀酒酵母在非發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長，而對在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)的釀酒酵母的生長沒有明顯影響，這種現(xiàn)象暗示青蒿素與線粒體功能有密切聯(lián)系。電子傳遞鏈的組分也顯示出對青蒿素的敏感性，但最近的一些研究結(jié)果表明，在青蒿素處理過的瘧原蟲中，線粒體的形態(tài)與功能并沒有受到嚴(yán)重影響。

以上這些假說是幾十年來幾代科學(xué)家利用生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等方法建立的青蒿素機(jī)理模型，但它們都不能很好地解釋青蒿素對瘧原蟲的高效、高特異性的殺傷作用。

利用化學(xué)蛋白組學(xué)研究青蒿素的作用機(jī)理

化學(xué)蛋白組學(xué)是近十幾年來快速發(fā)展起來的一門集生物學(xué)、化學(xué)與質(zhì)譜技術(shù)于一體的交叉學(xué)科。它提供了一種直接的有效的分析藥物或者小分子化合物結(jié)合蛋白，以及分子的分離和鑒定手段，被越來越多地運(yùn)用于揭示天然產(chǎn)物、藥物的作用機(jī)理及其靶點(diǎn)的研究領(lǐng)域。

其中的主要原理是利用修飾后的藥物或小分子探針去與生物大分子（靶標(biāo)）結(jié)合，有效地標(biāo)記或富集出與探針結(jié)合的生物靶標(biāo)，然后運(yùn)用凝膠電泳和生物質(zhì)譜等手段鑒定這些靶蛋白。探針的修飾包括連接熒光素、同位素，或與固相載體作用。

筆者實(shí)驗(yàn)室利用化學(xué)蛋白組學(xué)的方法，系統(tǒng)鑒別出124種與青蒿素共價結(jié)合的靶蛋白。這些蛋白大多與瘧原蟲的重要生物過程有關(guān)，它們通過較廣泛的靶點(diǎn)范圍破壞寄生蟲的生化環(huán)境，導(dǎo)致其死亡。研究人員利用體外結(jié)合的方法，證實(shí)了激活青蒿素的物質(zhì)是血紅素，而非游離的二價鐵離子。為青蒿素殺滅瘧原蟲的功能與特異性提供了一個最為合理的解釋，加快了青蒿素抗藥性的研究進(jìn)程。

鑒定青蒿素作用的靶蛋白

為更全面系統(tǒng)地研究青蒿素的作用機(jī)制，鑒定其作用靶點(diǎn)，筆者實(shí)驗(yàn)室利用化學(xué)生物學(xué)的平臺，設(shè)計(jì)合成了一系列青蒿素類似物的化學(xué)探針。經(jīng)過測試，這些青蒿素類似物探針同未修飾的青蒿素具有相似的藥物活性，且保持了其結(jié)合位點(diǎn)的特異性，在藥理學(xué)上與青蒿素相似，所以其作用方式及靶點(diǎn)能夠代表青蒿素。

這些青蒿素類似物探針的修飾結(jié)構(gòu)非常小巧，只加人了一個生物正交反應(yīng)基團(tuán)（炔基）。此修飾保證了最小化地影響藥物結(jié)構(gòu)及其生物利用度，又能夠在后期通過自由連接熒光染料來示蹤藥物靶點(diǎn)，或者連接生物素來親和純化靶蛋白。另外一個突出的優(yōu)點(diǎn)就是，小巧的化學(xué)修飾使青蒿素探針依然具有良好的穿膜性與生物利用度，這樣可以進(jìn)行活細(xì)胞的孵育，從而檢測青蒿素在活體細(xì)胞內(nèi)的結(jié)合作用蛋白。這種方法不同于傳統(tǒng)的先裂解細(xì)胞，再進(jìn)行孵育純化的藥物靶點(diǎn)鑒定方法，研究者采用的是能在活體細(xì)胞內(nèi)作用的探針，它能更好地反映藥物在生理?xiàng)l件下的結(jié)合與作用方式。

通過將活的瘧原蟲與青蒿素類似物共同孵育、提取粗蛋白、親和純化、電泳和串聯(lián)質(zhì)譜等一系列實(shí)驗(yàn)，最終鑒定出124種青蒿素直接作用的靶蛋白。值得注意的是，實(shí)驗(yàn)過程中所采用的洗去非特異蛋白的過程極為苛刻，經(jīng)過反復(fù)多輪的清洗，在對照組中未發(fā)現(xiàn)任何寄生蟲的蛋白。同時，為了提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果和青蒿素靶點(diǎn)的可信度，選取三組重復(fù)探針，親和純化實(shí)驗(yàn)中共同鑒定出的蛋白作為青蒿素靶蛋白。在這些靶蛋白中，有33種蛋白之前被認(rèn)為有可能是比較優(yōu)秀的潛在抗瘧藥物的靶點(diǎn)，包括SERCA/PfATP6這一已知的青蒿素靶蛋白。這些靶蛋白參與了瘧原蟲許多重要的生物過程，包括羧酸代謝過程、細(xì)胞生物胺代謝過程、核苷代謝過程和核糖核苷生物合成過程等。

青蒿素靶蛋白參與多種瘧原蟲生存相關(guān)的生理過程

筆者團(tuán)隊(duì)還驗(yàn)證了一些參與瘧原蟲重要代謝途徑的酶在體外與青蒿素類似物的相互作用。這些酶包括鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶（OAT），丙酮酸激酶（PyrK），L-乳酸脫氫酶（LDH），亞精胺合酶（spdSyn）以及S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAMS）。實(shí)驗(yàn)證實(shí)青蒿素類似物可與這5種酶直接發(fā)生作用。與青蒿素結(jié)合后，參與瘧原蟲生理過程的關(guān)鍵酶都被龐大的倍半萜內(nèi)酯共價修飾，其酶活性因此被不可逆地破壞，瘧原蟲快速死亡。

闡明青蒿素的活化機(jī)制

有了青蒿素的靶蛋白信息，就可利用純化的靶蛋白與青蒿素的體外作用實(shí)驗(yàn)完美地解決青蒿素的活化機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)青蒿素類似物與靶蛋白的結(jié)合需要添加血紅素，并且這種結(jié)合會在添加了維生素c、Na2S2O4或者谷胱甘肽（GSH）之后得到強(qiáng)化，這些試劑都可以將氯化血紅素還原成血紅素。與之形成對比的是，添加了二價鐵離子之后，并不能檢測出兩者之間的結(jié)合。當(dāng)添加鐵螯合劑去除二價鐵離子之后，青蒿素類似物與靶蛋白的結(jié)合也沒有受到影響。但是，當(dāng)添加蛋白酶抑制劑阻斷血紅蛋白消化從而減少血紅素的釋放之后，兩者的結(jié)合受到明顯抑制。這說明在青蒿素活化過程中，起決定作用的是血紅素，而非游離鐵離子。

隨后檢測青蒿素對不同時期瘧原蟲的活性。可以觀察到青蒿素對不同生長期的寄生蟲都有作用，青蒿素類似物可與所有生長期的寄生蟲蛋白結(jié)合，但在早期環(huán)狀體期的效果弱于晚期階段（如滋養(yǎng)體和裂殖體階段）。這與之前報(bào)道的青蒿素在寄生蟲晚期階段的殺傷效果比早期環(huán)狀體期強(qiáng)100倍的結(jié)果相吻合。

環(huán)狀體期的青蒿素活化主要依靠瘧原蟲體內(nèi)血紅素的生物合成。由于這一階段血紅素的產(chǎn)量較低，青蒿素的活化程度也相對較低。在后期，蟲體內(nèi)合成的血紅素也可活化青蒿素，但是血紅蛋白降解釋放出的血紅素對藥物活化起了主要作用。寄生蟲后期的血紅素大量產(chǎn)生導(dǎo)致了青蒿素的高活性，這使得青蒿素表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗瘧性。

青蒿素抗瘧機(jī)理與未來研究方向

綜上所述，瘧原蟲感染人體后，會如同吸血鬼一般瘋狂地吞噬人體紅細(xì)胞。青蒿素本身只是一個藥物前體，它需要被“激活”后才能發(fā)揮作用。血紅素分子恰恰是青蒿素的特異性激活劑。而血紅素分子是人血紅蛋白的一個重要組成成分。當(dāng)瘧原蟲在大量吞噬紅細(xì)胞的時候，會釋放出非常高濃度的血紅素分子，這樣青蒿素就會在瘧原蟲代謝旺盛的地點(diǎn)被激活。激活后的青蒿素就會與瘧原蟲體內(nèi)數(shù)以百計(jì)的寄生蟲蛋白結(jié)合，致使其失去活性，進(jìn)而殺死瘧原蟲。與此相對應(yīng)的是，正常紅細(xì)胞中的血紅素分子由于被牢牢地結(jié)合在血紅蛋白中而無法激活青蒿素。因此青蒿素對于正常細(xì)胞的毒副作用非常小。這也就是說，瘧原蟲噬血的本性使其不可避免地成為青蒿素攻擊的目標(biāo)。

筆者團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)合成的青蒿素類似物可以在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中直觀地顯示藥物活性，由此揭示青蒿素在不同寄生蟲生存階段的活化機(jī)制，并鑒別出其廣泛的靶蛋白位點(diǎn)。這些靶蛋白的識別有助于人們進(jìn)一步了解瘧原蟲的生長代謝規(guī)律，針對某些地區(qū)出現(xiàn)的日益嚴(yán)重的瘧原蟲抗藥性，設(shè)計(jì)出更有效的用藥方案。

青蒿素獨(dú)有的激活方式也與目前發(fā)現(xiàn)的青蒿素抗藥性有著緊密的聯(lián)系。通過現(xiàn)有的研究成果，可以針對瘧原蟲代謝特點(diǎn)和生存周期，科學(xué)地設(shè)計(jì)與測試新的青蒿素治療周期與用藥方案，減緩耐藥性的發(fā)生。與此同時，可以運(yùn)用結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法，更加準(zhǔn)確地解析青蒿素與其靶蛋白結(jié)合的精準(zhǔn)方式，從而設(shè)計(jì)更加高效的青蒿素衍生藥物。目前的研究還不能檢測非共價鍵連接的靶點(diǎn)，因此，開發(fā)新的青蒿素類似物用以捕捉暫時性的青蒿素一蛋白間的相互作用是一個非常有意義的研究方向。確定每個共價或者非共價連接的青蒿素靶蛋白在寄生蟲殺傷中的作用也將是未來研究的熱點(diǎn)。

青蒿素也許是自然界中最聰明的一類藥物，誰會想到大自然會設(shè)計(jì)出一種巧妙利用寄生蟲噬血的特性去對付它呢？青蒿素治療瘧疾只是一個例子，也許還有一些現(xiàn)代醫(yī)學(xué)束手無策的疾病在大自然中已經(jīng)有了解決方案，自然界生物進(jìn)化過程中有著太多的東西值得我們?nèi)W(xué)習(xí)和了解，并運(yùn)用它們來解決人類面臨的問題。