許木果　劉忠妹　李海泉　楊焱　徐榮

摘 要 以諾麗果干粉為原料，優(yōu)化超聲波輔助提取諾麗果多糖的工藝，測定多糖的提取總量。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以超聲波處理時間、處理溫度、處理功率、料液比四因素，三水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，以諾麗果多糖提取率為考察結(jié)果。結(jié)果表明：諾麗果粉粒度60目、料液比1 ∶ 25、提取功率300 W、提取時間45 min、提取溫度70 ℃，提取次數(shù)2次為多糖的最佳提取條件。在正交實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果證明，采用優(yōu)化后的提取工藝提取諾麗果多糖的效率高，研究結(jié)果為提取諾麗果多糖提供了一定實(shí)際生產(chǎn)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 諾麗果；多糖；超聲波；提取工藝；優(yōu)化

中圖分類號 S567 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract Dry powder of Morinda fruit was selected as the raw material to determine the gross extraction of polysaccharide by optimize ultrasonic-assisted extraction process of polysaccharide from Morinda fruit. To determine the extraction rate of polysaccharide in Morinda fruit， main technological parameters like ultrasonic treating time， treating temperature， treating power and solid-liquid ratio， were investigated by a single factor method coupled with L9（34）orthogonal array design. The results showed that the optimal conditions of extracting polysaccharide from Morinda fruit was a two-step extract with Morinda fruit powder size of 60， solid-to-liquid ratio of 1 ∶ 25， ultrasonic power 300 W， extracting 45 min at a temperature of 70 ℃. The verification test was carried out based on an orthogonal experiment， it was proved that this extracting technology was efficient， the result provided theoretical parameters for the practical production of the extraction of Morinda fruit polysaccharide.

Key words Morinda； Polysaccharide； Ultrasonic； Extraction process； Optimization

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.06.030

諾麗（Morinda cirtifolia L.）為茜草科巴戟天屬植物，熱帶常綠多年生小喬木或闊葉灌木，約80種，中國有12種和2個變種，主要分布于中國西南部到東南部，臺灣和香港地區(qū)[1-3]。諾麗發(fā)源于太平洋南部島嶼，當(dāng)?shù)鼐用穹Q之為NONI，被波利尼亞人食用已有2000多年歷史，在南太平洋一帶素有“仙果”之美稱[4]。諾麗果實(shí)、葉子、枝干、根部均可入藥[5]，果實(shí)為白色葉莖果，作為一種傳統(tǒng)藥用植物，藥名海巴戟，富含多種微量元素的同時，還含有較為豐富的活性物質(zhì)，如生物堿、蒽醌類、多酚、脂肪酸類、木脂素、多糖、甾醇和萜類化合物等。在治療方面，諾麗被證實(shí)對多種病癥有顯著療效，如抗病毒、抗癌，對治療自身免疫疾病，阻止和減少急、慢性病痛的發(fā)生，對哮喘等呼吸道疾病、糖尿病、腎炎、關(guān)節(jié)炎、癔癥、敏感癥、動脈粥樣硬化、瘀血、消化系統(tǒng)疾病、多種硬化癥、心血管疾?。ǜ哐獕骸⑿募」Ｋ溃┒季哂幸欢ǒ熜1-3，6-8]。實(shí)驗(yàn)表明，從諾麗果中提取的水溶性多糖具有明顯的免疫增強(qiáng)作用[9]。Furusawa[10-11]研究小組發(fā)現(xiàn)，諾麗果多糖中含有一種關(guān)鍵的抗腫瘤物質(zhì)，它主要通過調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)抑制腫瘤的生長，通過對其多糖的分離提純和藥理實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抗腫瘤的成分主要集中在乙醇沉淀的多糖組分中，在腫瘤的臨床治療中，諾麗多糖將是一種重要的藥物輔助劑[12]。目前，國內(nèi)對諾麗多糖的相關(guān)研究報(bào)道主要集中在其藥理作用方面，對于該成分的分離純化及其活性成分的研究相對較少，本研究主要利用超聲波輔助提取工藝，對諾麗果多糖的提取過程進(jìn)行優(yōu)化，以期為后續(xù)研究奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

諾麗鮮果采摘于云南省熱帶作物科學(xué)研究所科研試驗(yàn)基地。所用試劑為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、乙醚、濃硫酸、苯酚、丙酮、無水乙醇，除葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品為優(yōu)級純外（GR），其余試劑均為分析純（AR）。

KQ500超聲波清洗器，昆山舒美超聲儀器有限公司；ME204E電子分析天平，梅特勒-托利多（常州）稱重設(shè)備系統(tǒng)有限公司；2XZ型直聯(lián)真空泵，上海陽光泵業(yè)制造有限公司；SP-722型紫外可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；TDL-5臺式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；BGZ-140電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 諾麗鮮果，清水洗凈，切片后放入45 ℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥，高速中藥粉碎機(jī)粉碎，超臨界二氧化碳脫脂，過20、40、60、80、100目篩，得諾麗果干粉樣品備用。

1.2.2 諾麗果多糖提取工藝流程 諾麗果干粉樣品→以蒸餾水作為提取劑超聲提取→抽濾濃縮→加入4倍體積無水乙醇→靜置48 h（低溫2～6 ℃）→3 000 r/min離心15 min→去漂浮物得沉淀→無水乙醇、乙醚、丙酮各淋洗2次→60 ℃干燥→諾麗果多糖。

1.2.3 供試樣品的制備 稱取諾麗果干粉樣品5 g→按照1.2.2的工藝流程提取諾麗果多糖→稱重→加蒸餾水溶解定容至100 mL→再將所定容的多糖溶液稀釋50倍→上機(jī)測定→計(jì)算多糖得率。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì) 在固定溫度60 ℃、時間60 min、料液比1 ∶ 25、超聲功率300 W，提取次數(shù)3次的條件下，探討不同顆粒度20、40、60，80、100目對超聲提取諾麗果多糖的影響；固定原料顆粒度60目、溫度60 ℃、時間45 min、料液比1 ∶ 25、超聲功率300 W條件下，研究提取次數(shù)對超聲提取諾麗果多糖的影響；固定原料顆粒度60目、溫度60 ℃、時間45 min、超聲功率300 W、提取次數(shù)2次的條件下，研究不同料液比對諾麗果多糖提取率的影響；固定原料顆粒度60目、溫度60 ℃、時間45 min、料液比1 ∶ 30、提取次數(shù)2次的條件下，研究不同提取功率對諾麗果多糖提取率的影響；在固定原料顆粒度60目、溫度60 ℃、料液比1 ∶ 30、提取功率300 W、提取次數(shù)2次的條件下，研究不同提取時間對諾麗果多糖提取率的影響；在固定原料顆粒度60目、料液比1 ∶ 30、提取功率300 W、提取時間45 min、提取次數(shù)2次的條件下，研究不同提取溫度對諾麗果多糖提取率的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取葡萄糖（105 ℃干燥至恒重）0.020 3 g，以蒸餾水定容至200 mL的容量瓶中，搖勻，得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別準(zhǔn)確吸取濃度為100 mg/L的葡萄糖溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.4、1.6、1.8 mL于10 mL刻度試管中，以加入葡萄糖0.0 mL作為空白對照，分別加入蒸餾水至2 mL，然后各加入6%的苯酚溶液1 mL及硫酸5.0 mL，靜置5min，搖勻，靜置30 min（冷確至室溫）。在最大吸收波長為490 nm處測吸光度，以葡萄糖濃度為縱坐標(biāo)，吸光度值為橫坐標(biāo)，繪制工作曲線圖，并計(jì)算回歸方程為：A=215.7C+3.447，R2=0.999 7，式中A為葡萄糖的濃度，單位為mg/L。結(jié)果表明，葡萄糖濃度在10～90 mg/L范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系（圖1）。

精密度試驗(yàn)：精密吸取對照品溶液1.0 mL，按照“2.1”項(xiàng)所設(shè)定的方法測定其吸光度，連續(xù)測定6次，吸光度的RSD為0.09%，表明儀器精密良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取供試液1.0 mL，按照“2.1”項(xiàng)操作，測定其吸光度。每隔10 min測定一次，連續(xù)1 h考察其穩(wěn)定性，吸光度的RSD為1.17%，結(jié)果表明樣品溶液在1 h內(nèi)顯色穩(wěn)定。

2.2 換算因素的確定

精密稱取所提取的諾麗果多糖0.016 1 g，置于100 mL的容量瓶中，蒸餾水溶解并定容至刻度，得多糖供試液。精密吸取1 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線下的方法測定吸光度，計(jì)算多糖溶液中的葡萄糖含量，并計(jì)算出換算因子f=W/CD。式中W為多糖含量，C為多糖溶液中葡萄糖的含量，D為諾麗果多糖的稀釋因素。

2.3 超聲波提取諾麗果多糖單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 不同顆粒度對多糖提取率的影響 不同顆粒度的提取及測定結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，在20～60目之間的諾麗果多糖的提取率變化相對明顯，在超過60目之后多糖含量增減變化不大，維持相對穩(wěn)定。綜合考慮粉碎不同目數(shù)的諾麗果粉的難易程度以及所消耗的能量，選取過60目篩的樣品為宜。

2.3.2 提取次數(shù)對多糖提取率的影響 提取次數(shù)的測定結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，在提取次數(shù)達(dá)到2次以上之后，多糖的提取已較為充分，提取率幾乎沒有明顯變化，保持相對穩(wěn)定，因此，提取次數(shù)選取2次。

2.3.3 不同料液比對多糖提取率的影響 不同料液比提取及測定結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，當(dāng)料液比達(dá)到1 ∶ 30時，多糖的提取率達(dá)到最大值，超過1 ∶ 30之后，多糖的提取率有下降的趨勢，這可能是由于開始提取時細(xì)胞內(nèi)部的多糖濃度比外部環(huán)境中的低，當(dāng)增加水分時內(nèi)部多糖不斷的浸出，當(dāng)料液比超過1 ∶ 30后，內(nèi)外濃度幾乎相同，多糖浸出量減少。因此，選擇1 ∶ 20、1 ∶ 25、1 ∶ 30作為正交實(shí)驗(yàn)3個因素水平。

2.3.4 不同提取功率對多糖提取率的影響 不同提取功率下多糖提取率的結(jié)果如圖5所示。通過圖5的分析結(jié)果可知，當(dāng)超聲功率達(dá)到300 W之后，多糖的提取率呈現(xiàn)了較為明顯的下降，這可能是因?yàn)槌暡ㄔ谧饔脮r間固定時，超聲波的破碎作用主要取決于超聲波的功率，其功率越大破碎作用越強(qiáng)，機(jī)械振動的強(qiáng)度增大，但當(dāng)超聲強(qiáng)度達(dá)到一定范圍之后，極有可能造成多糖分子糖苷鍵的斷裂，從而影響多糖的提取效果，導(dǎo)致多糖提取率降低。因此，選擇100、200、300 W作為正交實(shí)驗(yàn)3個因素水平。

2.3.5 不同提取時間對多糖提取率的影響 不同提取時間下多糖的提取率結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，當(dāng)提取在一定時間范圍內(nèi)，隨著超聲波作用時間的延長，多糖的提取率逐漸升高，在45 min左右時，提取效果較好。在45～60 min有一個明顯的下降過程，這可能是由于隨著提取時間的延長，超聲波對細(xì)胞壁的破壞作用增強(qiáng)，植物細(xì)胞進(jìn)一步破碎，雜質(zhì)的溶出相應(yīng)的增多，導(dǎo)致多糖的提取率出現(xiàn)了明顯的下降；同時，由于超聲波具有較強(qiáng)的機(jī)械剪切作用，長時間作用也會造成大分子的多糖鍵的斷裂，從而影響多糖的提取效果；當(dāng)超聲作用時間在60～90 min時，提取率沒有明顯變化，相對增減的幅度較小。因此，為了進(jìn)一步驗(yàn)證隨時間延長是否會影響諾麗多糖的提取效果，本實(shí)驗(yàn)選取45、60、75 min作為正交實(shí)驗(yàn)的3個因素水平。

2.3.6 不同提取溫度對多糖提取率的影響 不同提取溫度對多糖提取率的影響結(jié)果見圖7?？梢?，當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃多糖提取率達(dá)到最高，在50 ℃時諾麗果多糖，溶質(zhì)與浸提劑蒸餾水之間的擴(kuò)散基本達(dá)到平衡。超過50 ℃之后出現(xiàn)了較為明顯的下降，這可能是由于溫度升高之后，超聲波的機(jī)械剪切作用增強(qiáng)，對浸出部分的多糖分子造成了破壞，導(dǎo)致提取率的降低；當(dāng)溫度超過70 ℃時，也有明顯的一個降幅，這應(yīng)該是溫度過高，導(dǎo)致部分糖蛋白變性沉淀，在抽濾和離心的過程中被去除的緣故。因此，綜合考慮不同溫度提取條件，選取50、60、70 ℃作為正交實(shí)驗(yàn)的3個因素水平。

2.4 正交實(shí)驗(yàn)

2.4.1 正交實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，同時參照超聲提取多糖的相關(guān)文獻(xiàn)資料[13-18]，選擇主要影響多糖提取效率的料液比（g/mL）/A、提取功率（W）/B、提取時間（min）/C、溫度（℃）/D為因素，設(shè)計(jì)4因素、3水平的L9（34）的正交實(shí)驗(yàn)，見表1。

2.4.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 按照表1所設(shè)置的條件，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)，為了全面考察多糖的提取工藝參數(shù)，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，多糖提取的結(jié)果如表2所示。

通過各因素極差分析結(jié)果可知，對多糖提取率影響大小順序依次是A、D、B、C，即料液比>提取溫度>提取功率>提取時間，最佳方案是A2B3C1D3，即優(yōu)化條件為料液比1 ∶ 25、提取功率300 W、提取時間45 min、提取溫度70 ℃。而在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中沒有出現(xiàn)這一方案，為了確定、驗(yàn)證上述方案是否為最佳方案，按照A2B3C1D3條件對樣品進(jìn)行超聲波提取測定，結(jié)果見表3。由表3可知，該方案可行。

2.4.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析 利用spss19.0軟件對正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，多糖的提取率為因變量，固定因子分別為料液比、提取功率、提取時間、提取溫度，其結(jié)果如表4所示。方差分析的結(jié)果顯示，料液比和溫度對諾麗果多糖提取率影響起到了最主要的作用，超聲時間和提取功率在此實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)差異相對較小，與極差分析的結(jié)果相吻合，超聲優(yōu)化條件重現(xiàn)性良好。

2.4.4 常規(guī)提取諾麗果多糖實(shí)驗(yàn) 在已優(yōu)化后的條件，顆粒度60目、提取次數(shù)2次、料液比1 ∶ 25、提取溫度70 ℃。延長提取時間為250 min，用常規(guī)水提醇沉法提取多糖，除不使用超聲儀器外，提取的工藝流程與“1.2.2”相同，此條件下多糖的提取率為6.189%。提取結(jié)果如表5所示。

3 討論

本研究采用超聲波輔助提取工藝，水提醇沉法提取諾麗果多糖，苯酚-硫酸法顯色測定多糖含量，其過程簡單、快速、靈敏、結(jié)果重現(xiàn)性好。通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到多糖提取的優(yōu)化條件為顆粒度60目、提取次數(shù)2次、料液比1 ∶ 25、提取功率300 W、提取時間45 min、提取溫度70 ℃，該條件下多糖的提取率為8.293 1%。并且考察了該方法的可行性和實(shí)用性，若確定以諾麗果多糖作為質(zhì)量檢測指標(biāo)時，該方法可行。比較常規(guī)提取方法“2.4.4”和超聲提取方法的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲提取諾麗果多糖具有較高的提取效率：提取時間縮短了5倍以上，收率提高33.97%。

參照相關(guān)文獻(xiàn)資料[19-22]對植物水溶性多糖的提取及測定方法，本研究在對樣品前處理過程中，采用超臨界二氧化碳脫脂，有效的排除了相應(yīng)雜質(zhì)的干擾；在對水溶性多糖進(jìn)行提取的過程中，采用了真空泵抽濾分離水溶性多糖，大大加快固、液分離的速度和效率，避免有效成分的流失；用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，紫外分光光度計(jì)對諾麗果粉多糖含量進(jìn)行測定，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程R2=0.999 7，線性關(guān)系良好；采用單因素和正交實(shí)驗(yàn)的方法，通過極差分析及驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，該工藝穩(wěn)定性較好。

趙二勞等[23]對南瓜多糖的超聲輔助提取結(jié)果表明，對于一定頻率和一定發(fā)射面的超聲來說，功率增大，聲強(qiáng)隨之增強(qiáng)，則聲壓幅值以及液體中壓力亦增大，空化泡崩潰所需的時間將變得更短，從而有利于提取率的提高；但無限制通過增加功率，提高聲強(qiáng)，可能會由于聲強(qiáng)的過度增大，導(dǎo)致空化泡在聲波中壓縮相內(nèi)來不及發(fā)生崩潰，從而不利于提取，使提取量減少。另一方面，當(dāng)溫度升高到一定程度時，多糖的提取率出現(xiàn)下降，但Karacabey等[24]認(rèn)為較高的溫度會導(dǎo)致植物組織的軟化，破壞多糖與酚類化合物、蛋白質(zhì)之間的相互作用，使多糖的溶解度上升，提高擴(kuò)散速率，從而使提取量升高。因此，筆者認(rèn)為這兩種因素有較強(qiáng)的交互作用，在一定的超聲強(qiáng)度下，多糖的提取效率隨溫度變化趨于平緩。對比劉海青等[25]對諾麗果多糖提取過程，本試驗(yàn)所用儀器簡單，操作方便，超聲儀器自動化程度極高，全過程無需高溫，增加提取效率的同時，有效的避免了因高溫對糖分子結(jié)構(gòu)的破壞和多糖活性的降低。

目前，植物水溶性多糖提取方法有超聲法、微波輔助法、響應(yīng)面分析法等。從經(jīng)濟(jì)實(shí)用性考慮，超聲具有省時、節(jié)能、提出率高等優(yōu)點(diǎn)，便于大規(guī)模生產(chǎn)。由于影響多糖提取率的因素較為復(fù)雜，包括：料液比、提取時間、提取溫度、提取功率、提取次數(shù)、原料的顆粒度、醇沉濃度、醇沉?xí)r間等。本研究僅選取前面4個主要因素作為正交試驗(yàn)的優(yōu)選條件，在今后的工作中還應(yīng)考慮對多糖的功能性成分進(jìn)一步純化分離，以便為后續(xù)諾麗果功能性多糖的研究奠定一定的基礎(chǔ)。

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