王榮春，韓利文，陳錫強，何秋霞，王希敏，彭維兵，孫晨，韓建，劉可春

(山東省科學院生物研究所，山東省生物傳感器重點實驗室，山東 濟南 250014)

?

【藥理與毒理】

利用斑馬魚模型研究蘆薈大黃素對宮頸癌細胞SiHa的抑制作用

王榮春，韓利文，陳錫強，何秋霞，王希敏，彭維兵，孫晨，韓建，劉可春*

(山東省科學院生物研究所，山東省生物傳感器重點實驗室，山東 濟南 250014)

摘要：通過細胞增殖實驗(MTT)研究不同濃度蘆薈大黃素(Aloe emodin，AE)對人宮頸癌細胞SiHa生長的抑制作用，并將SiHa細胞注入48 hpf的斑馬魚胚胎卵黃囊，建立斑馬魚移植瘤模型，然后用不同濃度AE進行處理，考察腫瘤細胞在斑馬魚體內(nèi)的增殖和遷移情況。結(jié)果顯示，AE對SiHa細胞的生長抑制率隨濃度和作用時間的增加而呈明顯上升趨勢，表現(xiàn)出一定的濃度-時間-效應依賴關系；體內(nèi)實驗表明AE對斑馬魚移植瘤的增殖和轉(zhuǎn)移具有抑制作用。本研究表明，AE具有開發(fā)成抗宮頸癌藥物的潛能，同時斑馬魚移植瘤模型也可以成為宮頸癌研究和藥物評價的重要模型。

關鍵詞：蘆薈大黃素；斑馬魚；宮頸癌細胞；SiHa；移植瘤模型

蘆薈大黃素(Aloe emodin，AE)是蘆薈和大黃的重要有效成分，是一種蒽醌衍生物的單體化合物，化學名稱為1，8-二羥基-3-羥甲基蒽醌，分子式為C15H10O5，分子質(zhì)量270.23，結(jié)構式見文獻[1]。AE具有多種藥理學作用，如抗菌、免疫抑制、瀉下和降脂減肥等，同時藥理研究發(fā)現(xiàn)，大黃蒽醌衍生物、大黃酸、大黃素和AE均有明顯的抗癌作用，能抑制多種腫瘤細胞的生長，抗腫瘤活性明顯[2-4]。

AE能抑制白血病細胞HL-60的生長，誘導人肝癌細胞、人舌鱗癌細胞和人肺癌細胞等多種腫瘤細胞的凋亡，其機制涉及PKC的激活及caspase的活化[4-6]。但AE對宮頸癌增殖和轉(zhuǎn)移的影響，尚缺乏深入研究。

斑馬魚是近年來藥物篩選和安全評價普遍使用的新型模式生物，其在基因水平上與人類具有87%的同源性，而且具有繁殖周期短、胚胎透明易于觀察、遺傳操作簡單以及飼養(yǎng)簡便等優(yōu)點，很快成為分子發(fā)育生物學、遺傳學、環(huán)境毒理學和免疫學等學科的模式生物[6-8]。近幾年斑馬魚移植瘤動物模型在國際藥理學研究領域迅速興起，在腫瘤增殖和遷移機制的研究方面成為廣泛接受的模型[9-12]。本文以斑馬魚為動物載體，建立斑馬魚移植瘤模型，并研究了AE對SiHa細胞增殖和遷移的影響。

1實驗材料和儀器

1.1實驗材料

人宮頸癌細胞SiHa，購自中國科學院上海細胞庫。細胞用含100 mL/L胎牛血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃和CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代一次。

1.2實驗動物

實驗用魚為AB野生型斑馬魚品系，魚種由山東省科學院斑馬魚藥物篩選平臺保存。斑馬魚在14 h光照/10 h黑暗的光周期、28 ℃ 的條件下培養(yǎng)。采卵時，取健康性成熟的斑馬魚按♀:♂=1: 1的比例放入交配缸內(nèi)，次日9～10 h獲取受精卵。對受精卵進行消毒和洗滌后，移入斑馬魚胚胎培養(yǎng)用水(含5.0 mmol/L NaCl，0.17 mmol/L KCl，0.4 mmol/L CaCl2，0.16 mmol/L MgSO4)中，置于28 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)待用。

1.3藥品和儀器

DMEM培養(yǎng)基、新鮮胎牛血清和質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL的胰蛋白酶購自美國Gibco公司；青霉素鈉與鏈霉素購自上海生工生物科技有限公司；麻醉劑三卡因、噻唑藍(MTT)和DMSO購自美國Sigma Aldrich公司；脫膜劑Pronase E購自Solarbio公司；CM DiL活細胞染色劑購自美國Invitrogen公司；微量注射儀購自力鈞生物科技有限公司；激光掃描共聚焦顯微鏡(FV1000)購自日本Olympus公司；無菌操作臺SWCJ2購自蘇州Airtech公司；5840R離心機購自Eppendof公司；全自動酶標儀為美國Biotek產(chǎn)品；體視熒光顯微鏡購自重慶光學儀器公司。

2實驗方法

2.1細胞增殖實驗(MTT)

取對數(shù)生長期的SiHa細胞，用質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL的胰蛋白酶消化SiHa細胞，用含100 ml/L胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞濃度5×104cells/mL，每孔100 μL接種于96孔板，置于CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸盡培養(yǎng)基，每孔依次加入100 μL對照和AE樣品(終濃度分別為0.5、1、2.5、5、10 μg/mL)，每個劑量設置6個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h后，棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌一次，加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，37 ℃ 繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)，棄上清，每孔加入100 μL DMSO，搖床振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，全自動酶標儀測定吸光度，波長為490 nm。測定各孔的吸光度值(A值)，按公式計算細胞抑制率：細胞抑制率(IR)=(1-用藥組A值/對照組A值)×100%，并以每個實驗組與對照組比較，以時間為橫軸，抑制率為縱軸繪制生長抑制曲線。

2.2顯微注射

2.2.1斑馬魚胚胎的獲得

當受精卵發(fā)育至24 h，使用1 mg/mL的Pronase E溶液脫去卵膜。在體視顯微鏡下挑選發(fā)育正常的斑馬魚胚胎，備用。無菌條件下將培養(yǎng)瓶中SiHa細胞除去培養(yǎng)基，PBS清洗2次后，加入質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL的胰蛋白酶消化，然后加入DMEM培養(yǎng)基終止消化，離心后換新的培養(yǎng)基，每毫升細胞懸液加入活細胞染色劑CM DiL 10 μL，37 ℃孵育5 min，然后在冰箱4 ℃孵育15 min，1 500 g離心5 min后去除上清液，PBS清洗2次后，加入無血清DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，鏡下調(diào)整細胞密度達到1×107cells/mL。

2.2.2微量注射

微量注射條件參照文獻[13]，選用新配制的質(zhì)量濃度為0.3 μg/mL的苯硫脲(抑制色素形成)孵育48 hpf的斑馬魚胚胎準備微量注射，用質(zhì)量濃度為200 μg/mL的三卡因輕度麻醉，放置在體視顯微鏡下，用上述調(diào)整好濃度的SiHa細胞進行注射。

6 h后將死亡斑馬魚吸出，隨機分為對照組與用藥組(0.25、0.5、1 μg/mL AE)，每組不少于10條。分別處理48 h后，將幼魚麻醉后在激光掃描共聚焦顯微鏡下拍照。

2.2.3統(tǒng)計學方法

移植瘤遷移評價方法參照文獻[13-14]，以斑馬魚卵黃囊注射點為原點，按照周邊移植瘤劃出最遠遷移直線距離，利用Image J軟件測量腫瘤遷移最遠距離和面積，并進行統(tǒng)計處理。各組幼魚逐條檢測剔除失敗樣本。

2.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件SPSS 16.0對實驗數(shù)據(jù)求均值，并進行樣本均數(shù)間多重比較。

3結(jié)果及分析

圖1　AE對SiHa細胞增殖的影響Fig.1　Anti-proliferative effect of AE on SiHa

3.1AE對人宮頸癌細胞SiHa增殖的影響

MTT法檢測AE對人宮頸癌細胞SiHa的生長抑制作用，從圖1可見，AE對SiHa細胞的生長抑制率隨濃度和作用時間的增加而呈明顯上升趨勢，表現(xiàn)出一定的濃度-時間-效應依賴關系。同時，可以看出在濃度5 μg/mL時抑制效率明顯增強，當濃度加倍至10 μg/mL時，抑制作用加強，但并未表明加倍。因此，可以選擇5 μg/mL的AE作為參考濃度值。

3.2AE對斑馬魚移植瘤的影響

3.2.1人宮頸癌細胞SiHa斑馬魚移植瘤模型的特點

人宮頸癌細胞SiHa經(jīng)CM Dil染色后，每個斑馬魚胚胎注射約200個腫瘤細胞，然后熒光顯微鏡下挑選注射部位和細胞數(shù)量一致的斑馬魚進行藥物處理。48 h以后細胞主要集中于卵黃部并向卵黃延伸部生長和遷移(圖2)。

3.2.2AE抑制斑馬魚移植瘤的增殖和轉(zhuǎn)移

模型組在藥物處理48 h后，激光共聚焦顯微鏡下可見SiHa紅色腫瘤細胞在胚胎中的分布，較集中于卵黃部、卵黃延伸部。用藥組(0.5、1 μg/mL)與對照組相比較，紅色腫瘤灶面積減少(圖3)，而且最大遷移距離也減小(圖4)(P<0.05)。說明蘆薈大黃素對腫瘤細胞的增殖和遷移有抑制作用。

A 對照組；B 0.25 μg/mL AE；C 0.5 μg/mL AE；D 1 μg/mL AE圖2　斑馬魚移植瘤模型的構建與藥物AE處理Fig.2　Establishment of zebrafish xenograft model and drug AE treatment

與對照組相比，*P<0.05圖3　AE處理對斑馬魚移植瘤細胞增殖的影響Fig.3Anti-proliferative effect of AE treatment on SiHa in zebrafish xenograft model

與對照組相比，*P<0.05。圖4　AE處理對斑馬魚移植瘤細胞遷移的影響Fig.4Anti-migration effect of AE treatment on SiHa in zebrafish xenograft model

4討論

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，是女性第二大常見惡性腫瘤。全世界每年約有50萬新發(fā)病例，25萬人死亡，其中大部分發(fā)生在發(fā)展中國家，中國宮頸癌的發(fā)病率世界第一，每年新發(fā)病例接近13萬。腫瘤轉(zhuǎn)移是導致患者死亡的主要原因。人子宮頸鱗癌細胞SiHa，該細胞系建自一個日本病人的外科手術的原位組織樣品。電鏡觀察表明在細胞連接處有典型的橋粒，在胞質(zhì)中有豐富的張力絲。在裸鼠中，此細胞能形成低分化的表皮樣癌(三級)，癌蛋白PRB和P53呈陽性[15]。

我國具有豐富的中藥資源，在中醫(yī)藥理論指導下，利用現(xiàn)代醫(yī)學的先進技術，研究中藥成分的藥理學作用和相關的分子、細胞機制，能夠為中藥學的發(fā)展和進步提供更多的支持。大黃是具有全球影響的十幾種傳統(tǒng)藥物之一，對大黃有效成分特別是蒽醌類化合物的藥理作用研究應進一步加強。AE能抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231體外侵襲能力，其作用機制可能與下調(diào)FAK的表達和減少MMP-9的分泌有關[16]，但其在宮頸癌方面的研究尚需要進一步深入。目前，斑馬魚作為模式動物，越來越多地用于腫瘤相關基因功能的研究和抗腫瘤藥物的篩選研究。小鼠/大鼠模型仍然是最經(jīng)典的動物疾病模型，但是其成本高、周期長且操作繁瑣。斑馬魚移植腫瘤模型具有成本較低、實驗周期短(4～6 d)，受精后1周內(nèi)無明顯免疫系統(tǒng)排異反應，原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶細胞清晰可見等優(yōu)點[17-19]。因此，本研究利用斑馬魚作為動物模型研究AE對人宮頸癌SiHa細胞的抑制作用。

本研究通過MTT法檢測AE對人宮頸癌細胞SiHa的抑制作用，結(jié)果顯示AE對SiHa細胞具有明顯的生長抑制作用，且生長抑制率隨濃度增加和作用時間的延長而增強，呈現(xiàn)一定的濃度-時間-效應依賴關系。同時我們建立了宮頸癌斑馬魚移植瘤模型，利用該模型，我們發(fā)現(xiàn)1.0、0.5 μg/mL的AE對斑馬魚移植瘤具有抑制作用，腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移能力明顯降低。本實驗結(jié)果表明，AE具有開發(fā)成抗宮頸癌藥物的潛能，同時斑馬魚移植瘤模型也可以成為宮頸腫瘤研究和藥物評價的重要模型。

參考文獻:

[1]王俊杰，付云芝．蘆薈中蒽醌化合物的提取和檢測及藥用價值研究進展[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學，2010，38( 21)：11131-11133.

[2] 李牧，杜智敏．蘆薈大黃素的藥理作用研究進展[J]．中國臨床藥理學雜志，2015，31(9)：765-768.

[3] LEE H Z. Protein kinase C involvement in aloe-emodin and emodin-induced apoptosis in lung carcinoma cell [J]．Br J Pharmacol，2001，134(5)：1093-1103.

[4] HUANG P H，HUANG C Y，CHEN M C. Emodin and aloe-emodin suppress breast cancer cell proliferation through ER α inhibition [J/OL]．2013：376123. http://dx.doi.org/10.1155/2013/376123.

[5] PECERE T，GAZZOLA M V，MUCIGNAT C，et al. Aloe-emodin is a new type of anticancer agent with selective activity against neuroectodermal tumors [J]．Cancer Res，2000，60(11)：2800-2804.

[6] KUOP L，LIN T C，LIN C C. The antiproliferative activity of aloe-emodin is through p53-dependent and p21-dependent apoptotic pathway in human hepatoma cell lines [J]. Life science，2002，71(16)：1879-1892.

[7] 何秋霞，董貞蘭，楚杰，等．蘆薈大黃素對斑馬魚胚胎發(fā)育及運動行為學的毒性研究[J]．山東科學，2015，28(3)：23-28.

[8] MOSHAL K S，F(xiàn)ERRI-LAGNEAU K F，LEUNG T C. Zebrafish model:worth considering in defining tumor angiogenesis [J]．TCM，2010，20(4)：114-119.

[9] Van der ENT W，BRELLO C，TEUNISSE A F，et al. Modeling of human uveal melanoma in zebrafish xenograft embryos [J]．Invest Ophtha Vis Sci，2014，55(10)：6612-6622.

[10] MIMEAULT M，BATRA S K. Emergence of zebrafish models in oncology for validating novel anticancer drug targets and nanomaterials [J]．Drug Discov Today，2013，18(3/4)：128-140.

[11] MARQUES I J，WEISS F U，VLECKEN D H，et al. Metastatic behaviour of primary human tumours in a zebrafish xenotransplantation model [J]．BMC Cancer，2009，9：128. doi:10.1186/1471-2407-9-128.

[12] SHIVE H R，WEST R R，EMBREE L J，et al. brca2 and tp53 collaborate in tumorigenesis in zebrafish [J]．PLoS One，2014，9(1)：e87177.

[13] LEE S L C，ROUHIA P，DAHL JENSEN L，et al. Hypoxia-induced pathological angiogenesis mediates tumor cell dissemination, invasion, and metastasis in a zebrafish tumor model[J]．PNAS，2009，106(46)：19485-19490.

[14] 陳錫強，韓利文，王希敏，等．人乳腺癌斑馬魚移植瘤模型建立[J]．中國藥理學通報，2016，32(1)：128-132.

[15] CHEN J Y，YAO D S，ZHAO S，et al. MiR-1246 promotes SiHa cervical cancer cell proliferation, invasion, and migration through suppression of its target gene thrombospondin 2 [J]．Gynecologic Oncology，2014，290(4)：725-732.

[16] LIU K D，PARK C，LI S Q，et al. Aloe-emodin suppresses prostate cancer by targeting the mTOR complex 2 [J]．Carcinogenesis，2012，33(7)：1406-1411.

[17]何振輝，何太平，翁閃凡，等.蘆薈大黃素對高轉(zhuǎn)移乳腺癌細胞MDA-MB-231體外轉(zhuǎn)移潛能的影響[J]．中國藥理學通報，2013，29(8)：1114-1118.

[18]TENG Y，XIE X Y，WALKER S，et al. Evaluating human cancer cell metastasis in zebra fish [J]．BMC Cancer，2013，13：453-465.

[19]TAYLOR A M，ZON L I. Zebrafish tumor assays: The state of transplantation [J]．Zebrafish，2009，6(4)：339-346.

Inhibitory effect of aloe emodine on cervical cancer cell line SiHa with zebrafish xenograft model

WANG Rong-chun，HAN Li-wen，CHEN Xi-qiang，HE Qiu-xia，WANG Xi-min，PENG Wei-bing，SUN Chen，HAN Jian，LIU Ke-chun*

(Shandong Provincial Key Laboratory of Biosensors, Biology Institute,Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014, China)

Abstract∶We employ MTT to investigate inhibitory effect of different concentrations of aloe emodin (AE) on the proliferation of cervical cancer cell SiHa. We further establish zebrafish xenograft model by injecting SiHa into the yolk sac of 48 hpf zebrafish. The zebrafish is then treated with different concentrations of AE to investigate proliferation and migration of cancer cell in zebrafish. Results show that growth inhibition rate of AE on SiHa significantly increases with the increase of AE concentration and action time, a certain concentration-time-effect dependence. In vivo experiment shows that AE has inhibitory effect on the proliferation and metastasis of zebrafish xenograft. Our research indicates that AE has the potential of cervical anticancer drug. The zebrafish xenograft model can also be an important model of cervical cancer research and its drug assessment.

Key words∶ aloe emodine; zebrafish; cervical cancer cell; SiHa; xenograft model

中圖分類號：R965.1;R737.33

文獻標識碼：A

文章編號：1002-4026(2016)02-0014-05

作者簡介：王榮春(1983-)，男，博士，研究方向為腫瘤生物學。1wangrongchun@163.com*通訊作者，劉可春(1964-)，男，博士，研究方向為藥物篩選。Email:hliukch@sdas.org

基金項目：國家自然科學基金(31400979)；山東省自主創(chuàng)新及成果轉(zhuǎn)化專項(2014ZZCX02105)；山東省重點研發(fā)項目(2015GSF121021)

收稿日期：2016-02-04

DOI:10.3976/j.issn.1002-4026.2016.02.004