華　亮，朱　玲，錢志強(qiáng)，岳　云， 李葉麗，楊丹莉

(遵義醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室暨基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義　563099)

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技術(shù)與方法

改良前處理的原代組織塊貼壁法培養(yǎng)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞

華亮，朱玲，錢志強(qiáng)，岳云， 李葉麗，楊丹莉

(遵義醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室暨基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義563099)

[摘要]目的 建立改良前處理的原代組織塊貼壁法培養(yǎng)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)。方法 將SD大鼠經(jīng)頸椎脫臼處死斷頭后放入盛有75%酒精的燒杯中浸泡消毒。在無菌條件下剖開胸腹腔，取出大鼠的心肺組織，然后用非體式顯微鏡分離方法分離出肺動(dòng)脈血管段，去除肺動(dòng)脈血管外層纖維結(jié)締組織、破壞血管內(nèi)膜層內(nèi)皮細(xì)胞后，用組織塊貼壁法培養(yǎng)PASMCs，并傳代、凍存和復(fù)蘇，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，普通免疫細(xì)胞化學(xué)法和免疫熒光法進(jìn)行細(xì)胞鑒定。結(jié)果 大鼠PASMCs呈典型的“峰-谷”樣生長狀態(tài)，細(xì)胞形態(tài)呈梭形。α-SM actin蛋白在培養(yǎng)的大鼠PASMCs為陽性表達(dá)，傳至第4代的PASMCs成活率可達(dá)98%，生長形態(tài)未見異常改變。PASMCs細(xì)胞從-80 ℃冰箱中取出復(fù)蘇后，生長狀態(tài)良好，形態(tài)、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。結(jié)論 用改良前處理的組織塊貼壁法能夠成功培養(yǎng)PASMCs，較傳統(tǒng)組織塊貼壁法更簡單，培養(yǎng)效率高。

[關(guān)鍵詞]組織塊貼壁法；肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞；原代培養(yǎng)；大鼠

肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth muscle cells, PASMCs)是肺動(dòng)脈血管重要的組成部分之一，PASMCs的結(jié)構(gòu)和功能對肺動(dòng)脈舒張和收縮功能的調(diào)節(jié)，維持低阻高排的肺循環(huán)正常生理功能起重要作用。建立體外大鼠原代PASMCs的培養(yǎng)體系，為肺動(dòng)脈高壓等肺血管疾病發(fā)病機(jī)制、防治手段的研究提供了重要基礎(chǔ)和研究方法[1-2]。原代培養(yǎng)PASMCs的方法包括組織塊貼壁法和酶消化法[3]。與酶消化法相比較，組織塊貼壁法實(shí)驗(yàn)成本更低廉。然而傳統(tǒng)的組織塊貼壁法要求在體視顯微鏡下進(jìn)行、直接剝離血管外的纖維組織獲取肺動(dòng)脈，操作復(fù)雜而且具有一定的難度[4]。本研究用改良前處理的組織塊貼壁法培養(yǎng)出形態(tài)結(jié)構(gòu)良好、細(xì)胞活力高的PASMCs。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級雄性SD大鼠10只，重230～270 g，購自于第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號:SCXK(軍)2012-0011。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑和儀器高糖DMEM、胎牛血清均購自GIBCO公司，青鏈霉素(雙抗)購自Hyclone公司，胰蛋白酶、Hepes、DMSO均購自Solarbio公司，PBS粉末、山羊血清購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司，4%多聚甲醛溶液、Mouse Anti-a-Smooth Muscle Actin購自BOSTER公司，抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒購自基因科技(上海)有限公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗小鼠二抗、DAPI購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

超凈工作臺(YJ-1450)購自蘇州凈化設(shè)備廠，CO2孵箱(FORMA-3131)購自美國Thermo公司，高壓消毒鍋(ES-315)購自TOMY公司，倒置顯微鏡(IX73)購自日本OLYMPUS公司，離心機(jī)(SC-3610)購自美國Beckman Coulter 公司，-80 ℃超低溫冰箱(DW-86L486)購自Haier BIO-MEDICAL公司。

1.3大鼠PASMCs的組織塊貼壁法原代培養(yǎng)

1.3.1分離大鼠肺動(dòng)脈血管頸椎脫臼法處死大鼠后斷頭(每次1只)，將其浸泡于盛有75%乙醇中10～20 min，取出后置于超凈工作臺，剪開胸腔，暴露心肺組織。在玻璃平皿下放一消毒后的冰袋(噴灑酒精后，放入超凈臺，紫外線照射30 min)。更換手術(shù)器械，用鑷子輕提雙肺的下葉，注意不能剪斷食管，取出心肺組織，置于裝有1%雙抗的PBS溶液的玻璃平皿中，漂洗2～3次，除去心臟和肺門周圍的組織，將漂洗過后的左右肺葉放入另一個(gè)盛有1%雙抗的PBS溶液的玻璃平皿中。更換手術(shù)器械，用2把眼科彎鑷，順著肺組織的血管走向?qū)⒎蝿?dòng)脈外纖維結(jié)締組織挑開，被彎鑷挑開的肺組織會吸收PBS而變得膨大松軟。更換手術(shù)器械，用2把彎鑷輕輕分離去除肺動(dòng)脈血管周圍的肺組織，將分離干凈的肺動(dòng)脈血管轉(zhuǎn)移至另外一個(gè)盛有1%雙抗的PBS溶液玻璃平皿中。另用2把彎鑷，將血管外周的筋膜等物質(zhì)去除干凈，用1把眼科剪，剪去一、二級肺動(dòng)脈主干獲得遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈分支，將肺動(dòng)脈從靠近肺門頂端的部分將肺動(dòng)脈剪開，用彎鑷較鈍的彎曲部將剪開后肺動(dòng)脈血管的內(nèi)皮細(xì)胞面從上向下輕輕刮3～5次，以達(dá)到刮落內(nèi)皮細(xì)胞的作用。

1.3.2大鼠PASMCs組織塊貼壁法將剪開的肺動(dòng)脈血管轉(zhuǎn)移至盛有無血清高糖DMEM培養(yǎng)基的玻璃平皿中，更換手術(shù)器械，用1把眼科鑷和1把眼科剪，將肺動(dòng)脈血管剪成若干個(gè)血管條。將血管條轉(zhuǎn)移至另一個(gè)無血清的培養(yǎng)基中，更換手術(shù)器械，用眼科剪將血管條組織剪碎(面積約1 mm2)，用彎頭吸管以3～5塊/cm2密度將組織塊貼于25 mL培養(yǎng)瓶底壁上，取2 mL含20%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基加入培養(yǎng)瓶內(nèi)(注意：培養(yǎng)基不能與組織塊接觸)，再加入20 μL的青鏈霉素溶液。將培養(yǎng)瓶置37℃，5%CO2，濕度80%孵箱(組織塊貼壁面朝上)。5 h后將培養(yǎng)瓶原位緩慢翻轉(zhuǎn)，使組織塊完全均勻浸入培養(yǎng)基中靜置5 d。如發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基由紅色變成金黃色說明營養(yǎng)成分減少，即可更換培養(yǎng)基液。5～7 d后，將培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡下觀察，可見植塊周圍形成“生長暈”，約10 d左右相鄰的“生長暈”匯合成片，待其面積達(dá)培養(yǎng)瓶80%即可傳代。

1.3.3大鼠PASMCs的傳代培養(yǎng)用玻璃吸管輕輕刮組織塊，使其與培養(yǎng)瓶脫離后將含組織塊的培養(yǎng)基棄去(此步驟僅用于首次傳代)，用PBS液清洗，每次加入2 mL PBS溶液，沖洗3次。隨后吸取1 mL 0.25%胰蛋白酶液，將培養(yǎng)瓶置倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞成片收縮、體積變圓時(shí)，立即棄胰酶并加入10% FBS的培養(yǎng)液終止消化，反復(fù)輕輕吹打?qū)⒓?xì)胞從瓶壁吹落后分裝成2瓶繼續(xù)培養(yǎng)。3～4 d后觀察細(xì)胞生長面積達(dá)培養(yǎng)瓶80%時(shí)即表示又可傳代。

1.4PASMCs的鑒定

1.4.1免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定選用第3代培養(yǎng)的細(xì)胞，消化細(xì)胞后以104～105個(gè)/mL密度的細(xì)胞懸液接種到放有蓋玻片的6孔板中，每個(gè)蓋玻片上加入500 μL的細(xì)胞懸液。再用10%FBS的培養(yǎng)基填充蓋玻片周圍的空隙，將6孔板平穩(wěn)放入CO2孵箱中培養(yǎng)24 h。免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定步驟如下：細(xì)胞貼壁后，取出6孔板，吸棄培養(yǎng)基，4%多聚甲醛室溫固定15 min，0.3%Triton-X100室溫透化破膜10 min，用針頭將蓋玻片挑起置于瓶塞上；山羊血清室溫封閉30 min，甩干山羊血清后滴加一抗 α-SMactin 200 μL(工作液濃度1∶100) 4 ℃冰箱過夜，15 h后將爬片從4 ℃取出復(fù)溫20 min，甩干一抗沖洗后滴加二抗原液室溫反應(yīng)35 min。上述操作過程每步用PBS漂洗5 min×3次。沖洗后將6孔板在倒置顯微鏡下滴加DAB(工作液濃度1∶50)染色5～8 min、雙蒸水沖洗后蘇木素輕度復(fù)染、雙蒸水沖洗后鏡下拍照。

1.4.2免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法鑒定與免疫細(xì)胞化學(xué)法不同之處在于與一抗反應(yīng)結(jié)束后，避光環(huán)境下滴加FITC標(biāo)記的羊抗小鼠二抗(1 μL：50 μL PBS)室溫反應(yīng)70 min，經(jīng)PBS漂洗5 min×3次后滴加DAPI避光反應(yīng)10 min復(fù)染核，PBS漂洗5 min×3次，洗去DAPI后拍照。

1.5PASMCs存活率的測定取第4代消化傳代細(xì)胞的細(xì)胞懸液50 μL，加入0.4%臺盼藍(lán)液50 μL，混勻后吸取20 μL于細(xì)胞計(jì)數(shù)板的孔內(nèi)，在細(xì)胞計(jì)數(shù)儀內(nèi)讀取細(xì)胞懸液的濃度和活細(xì)胞比例。

1.6PASMCs的凍存和復(fù)蘇凍存步驟：選擇對數(shù)生長期的第3～4代的細(xì)胞，在凍存前24 h給細(xì)胞換培養(yǎng)液。用胰蛋白酶將細(xì)胞消化下來后制備成細(xì)胞懸液，吸取細(xì)胞懸液于15 mL離心管中，1 000 rmp離心10 min，吸出上清液，加入1 mL(含20%FBS、10%DMSO的DMEM培養(yǎng)液)，吹打均勻后轉(zhuǎn)移至高壓滅菌好的凍存管中。貼上封口膜密封保存，室溫放置10 min，4℃放置30 min，-20 ℃放置2 h，最后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱(一個(gè)月內(nèi)復(fù)蘇)或液氮罐長期保存。

當(dāng)需要用細(xì)胞時(shí)，對細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇。將凍存管從冰箱里取出后，放入盛有37℃水的燒杯中迅速搖晃，經(jīng)酒精消毒后將凍存管放入超凈臺中，然后迅速將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至無菌離心管中。加入3 mL 10%FBS的培養(yǎng)基，1 000 rmp離心10 min，在超凈臺中吸出上清液，然后再加3 mL10%FBS的培養(yǎng)基，吸打混勻后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。將培養(yǎng)瓶置37 ℃，5%CO2，濕度80%孵箱。24 h后觀察細(xì)胞的貼壁情況。

2結(jié)果

2.1獲取肺動(dòng)脈組織塊在動(dòng)物處置室將雄性SD大鼠經(jīng)頸椎脫臼處死斷頭后在無菌操作臺中操作，最終獲取肺動(dòng)脈組織塊，具體操作流程如圖所示(見圖1)。

A：獲取肺組織；B：肺組織因吸附PBS液而膨大；C：祛除纖維結(jié)締組織后的肺動(dòng)脈；D：獲取肺動(dòng)脈； E：剪去一、二級肺動(dòng)脈主干獲得遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈分支； F：刮落肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞。 圖1　獲取肺動(dòng)脈的操作流程圖

2.2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察在倒置顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)的PASMCs生長情況，發(fā)現(xiàn)原代培養(yǎng)第5天可見PASMCs貼壁生長，細(xì)胞大小不等，形態(tài)多樣(梭形、多角形、不規(guī)則型)(見圖2A)。第8天左右細(xì)胞交織成網(wǎng)狀(見圖2B)，10 d左右多數(shù)細(xì)胞呈長梭形，胞漿豐富，有分支狀突起，細(xì)胞平行排列成單層，或部分區(qū)域多層重疊生長，高低起伏，可見細(xì)胞成“峰、谷”樣排列(見圖2C)。傳代后的細(xì)胞生長較快，2～3 d即可長滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶，并保持上述形態(tài)學(xué)特征和生長特點(diǎn)。經(jīng)反復(fù)傳代后，第4～8代均可保持良好的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及功能。

A:第5天；B：第8天；C：第10天。圖2　改良組織塊貼壁法培養(yǎng)的PASMCs不同時(shí)間段的生長狀態(tài)(×100)

2.3肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的鑒定據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，血管中的α-actin為細(xì)胞中6種肌動(dòng)蛋白亞類之一，在血管平滑肌中特異性表達(dá)，具有收縮功能(SMCs具有收縮表型的重要標(biāo)志物)，為肌肉細(xì)絲及細(xì)胞骨架微絲的主要成分[5]。細(xì)胞經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)法染色后，在高倍鏡下可見細(xì)胞核用蘇木素染色后呈淡藍(lán)色，卵圓形居中，胞質(zhì)內(nèi)可見大量棕色，說明α-SMactin蛋白呈陽性表達(dá)(見圖3A)。細(xì)胞經(jīng)免疫熒光化學(xué)法染色后，在高倍鏡下可見細(xì)胞核經(jīng)DAPI染色后呈藍(lán)色，卵圓形，胞質(zhì)內(nèi)可見大量的綠色，說明α-SMactin蛋白呈陽性表達(dá)(見圖3B)。

A: PASMCs免疫細(xì)胞化學(xué)法染色(×400); B: PASMCs免疫熒光化學(xué)法染色(×320)。圖3　肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的鑒定結(jié)果

2.4傳代細(xì)胞成活率選用第4代的PASMCs臺盼藍(lán)染色后，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測定出活細(xì)胞的數(shù)量占98%，說明細(xì)胞成活率高。而且傳至第4代以后的細(xì)胞生長形態(tài)良好、傳代后的細(xì)胞在12 h內(nèi)能大部分貼壁，貼壁時(shí)間短、2 d左右可以長滿整個(gè)培養(yǎng)瓶，生長速度快。

2.5細(xì)胞凍存與復(fù)蘇當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量過多，短時(shí)間內(nèi)無法對諸多的細(xì)胞進(jìn)行處理，要求實(shí)驗(yàn)操作人員對細(xì)胞進(jìn)行暫時(shí)性的凍存，并適時(shí)的進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇以完成實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞從-80 ℃冰箱中取出復(fù)蘇后，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。復(fù)蘇后的細(xì)胞在24 h內(nèi)能大部分貼壁，貼壁時(shí)間短、3 d左右可以長滿整個(gè)培養(yǎng)瓶，生長速度快。

3討論

近年來，隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，人們對血管平滑肌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、黏附和細(xì)胞外基質(zhì)的合成和分泌等方面的認(rèn)識不斷深化。PASMCs是肺動(dòng)脈血管的重要組成之一，其穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和功能在肺動(dòng)脈血管舒張和收縮的調(diào)節(jié)中起重要作用。肺動(dòng)脈高壓是一種因內(nèi)皮功能障礙、炎癥免疫反應(yīng)等因素引起的肺血管阻力進(jìn)行性升高，最終導(dǎo)致右心功能衰竭、死亡的病理生理綜合征[6-8]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，肺血管重構(gòu)與PASMCs的異常增殖密切相關(guān)[9]。因此，建立培養(yǎng)體外大鼠PASMCs培養(yǎng)體系可為肺動(dòng)脈高壓等肺血管疾病提供良好的實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用改良的組織塊貼壁法后能夠獲得形態(tài)、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、活細(xì)胞比例高、傳代后貼壁時(shí)間短，生長速度快，甚至在細(xì)胞經(jīng)凍存后的活性依然高，生長速度快的PASMCs。與傳統(tǒng)的組織塊貼壁法相比，本實(shí)驗(yàn)改良之處主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：①傳統(tǒng)的組織塊貼壁法獲取肺動(dòng)脈血管的過程直接在盛有預(yù)冷PBS液的玻璃平皿中進(jìn)行[10]；改良后的方法將裝有肺血管組織的玻璃平皿置于冰袋上操作，更能持續(xù)維持組織低溫，有利于保持肺血管的活性，有利于組織貼壁后PASMCs的生長。②傳統(tǒng)的組織塊貼壁法需要在體式顯微鏡下操作進(jìn)行，延長了操作時(shí)間、增加了被污染概率；改良方法減少了該步驟，在無體式顯微鏡輔助下同樣獲取了完整的肺動(dòng)脈，減少了實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間。③在肺動(dòng)脈的剝離過程中，傳統(tǒng)方法是直接將血管外的纖維組織剝離，易撕裂遠(yuǎn)端的肺動(dòng)脈血管，而且獲得的肺動(dòng)脈血管組織少，牽拉損傷嚴(yán)重；改良方法在獲取肺動(dòng)脈時(shí)通過用眼科鑷從肺葉邊緣起小心挑開血管周圍的組織，肺組織因被破壞而吸收了大量PBS液體導(dǎo)致蓬松變軟，然后再輕輕剝離血管的周圍組織可獲得完整牽拉損傷小的肺動(dòng)脈血管。

改良前處理的組織塊貼壁法能夠成功培養(yǎng)PASMCs，得到生長活力高、形態(tài)穩(wěn)定的PASMCs，并可以獲得穩(wěn)定的傳代細(xì)胞，較原組織塊貼壁法更簡單，效率更高。

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[收稿2016-02-14;修回2016-03-10]

(編輯：王福軍)

Modified pretreatment tissue explants adherent method for primary rat pulmonary artery smooth muscle cells culture

HuaLiang,ZhuLing,QianZhiqiang,YueYun,LiYeli,YangDanli

(Department of Pharmacology,Key Laboratory for Basic Pharmacology of Ministry of Education, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

[Abstract]Objective To set up a modified pretreatment tissue explants adherent method for primary rat pulmonary artery smooth muscle cells (PASMCs) culture.Methods SD rat was sacrificed by cervical dislocation, and then was put into the beaker containing 75% alcohol for immersion disinfection. The chest was opened and the heart and lung were taken out under aseptic condition. The pulmonary artery segments were acquired with a non-stereo microscope separation method. The outer membrane of pulmonary artery trunk was separated and endothelial cells were damaged. PASMCs were cultured by the modified tissue explants adherent method. The PASMCs were then passaged, cryopreserved and resuscitated. The cellular morphology and typical growth conditions were observed with the inverted phase contrast microscope. Cell specificity was identified by methods of immunocytochemistry and immunofluorescence.Results PASMCs showed a typical "peak - valley" growth state and presented spindle shape. The protein expression of α-SM actin in the isolated cells was positive by the method of immunocytochemistry and immunofluorescence. The survival rate of the 4th generation of PASMCs was up to 98% by the cell counting detection method. The growth of passaged PASMCs was normal. The good growth state, stable morphology and structure of PASMCs were presented when cells were recovered from -80 ℃ freezer.Conclusion PASMC could be successfully cultured using the modified pretreatment tissue explants adherent method, and this method is easier and more efficient than the traditional method.

[Key words]tissue explants adherent method; pulmonary artery smooth muscle cells; primary culture; rat

[中圖法分類號]Q813.1

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]1000-2715(2016)02-0195-05

[通信作者]楊丹莉,女，博士, 教授, 碩士生導(dǎo)師, 研究方向: 心血管藥理與免疫藥理,E-mail:393707603@qq.com。

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO:81360498)。