楊　亞，趙杰宏，姜　驍，母應(yīng)春，蘇　偉*

(1.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省煙草科學(xué)研究院煙草行業(yè)分子遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550081)

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水楊酸對(duì)打頂后煙草根系鉀吸收的調(diào)控作用研究

楊亞1，趙杰宏2，姜驍1，母應(yīng)春1，蘇偉1*

(1.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省煙草科學(xué)研究院煙草行業(yè)分子遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550081)

摘要：為探索打頂后煙草根系鉀素的分配和轉(zhuǎn)移規(guī)律，試驗(yàn)研究了打頂及施用不同濃度水楊酸對(duì)根系鉀吸收及鉀運(yùn)輸相關(guān)基因表達(dá)水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，打頂減少煙草根系對(duì)鉀的吸收，而打頂同時(shí)施加水楊酸會(huì)影響根系吸收鉀，其中5 μmol/L的水楊酸能提高打頂后根系鉀吸收，而施加較高濃度水楊酸則效果相反。另外，各處理前后根中鉀運(yùn)輸基因“NTORK1/HAK1”表達(dá)比值差異和根系鉀吸收能力差異基本一致，可能受水楊酸的調(diào)控，可用作打頂后煙草鉀素的分配和轉(zhuǎn)移的間接評(píng)價(jià)指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：煙草；鉀；打頂；水楊酸

引言

水楊酸(salicylic acid，SA)，即鄰羥基苯甲酸，是植物體內(nèi)廣泛存在的小分子酚類化合物。水楊酸可提高植物對(duì)脅迫的抗性，如能夠誘導(dǎo)煙草抵抗野火病[1]，在弱光[2]、低溫[3]、金屬Cu[4]等脅迫下也發(fā)揮顯著作用。在擬南芥中，水楊酸能抑制鹽脅迫導(dǎo)致的鉀外流[5]。鉀作為植物最重要的大量元素之一，是60多種酶的活化劑，參與植物體內(nèi)滲透壓的維持、同化產(chǎn)物的運(yùn)輸，同時(shí)還促進(jìn)光合作用[6-7]。鉀可提高煙葉燃燒性、減少煙氣中總粒相物和焦油含量[8-9]。鉀在根部的分配和轉(zhuǎn)移是由鉀離子通道和載體介導(dǎo)，擬南芥中幾個(gè)鉀通道基因已被鑒定，其中AKT1與AtKC1一起參與根毛鉀的吸收[10-12]。煙草鉀通道基因NKT1、NtKC1和鉀吸收轉(zhuǎn)運(yùn)體NtHAK1也已被克隆，而NTORK1則是煙草主要的鉀外流通道基因[13-14]。打頂是煙葉生產(chǎn)中一項(xiàng)重要的農(nóng)藝措施，可以減少營(yíng)養(yǎng)消耗，促進(jìn)上部葉生長(zhǎng)，提高煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量。但打頂會(huì)導(dǎo)致煙株鉀流失[15]，因而，減少打頂?shù)仍斐蔁熤赈涬x子的重分配和流失一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。通過(guò)施加能調(diào)節(jié)根系鉀吸收的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，并研究其機(jī)理，將為改善煙株養(yǎng)分利用、提高煙株鉀含量提供依據(jù)。

對(duì)于快遞包裝回收，國(guó)家有關(guān)部門制定了一個(gè)時(shí)間表。2017年，國(guó)家十部門聯(lián)合發(fā)布的《關(guān)于協(xié)同推進(jìn)快遞業(yè)綠色包裝工作的指導(dǎo)意見》明確，到2020年，可降解的綠色包裝材料應(yīng)用比例將提高到50%，基本淘汰重金屬等特殊物質(zhì)超標(biāo)的包裝物料，基本建成專門的快遞包裝物回收體系。主要快遞品牌協(xié)議客戶電子運(yùn)單使用率達(dá)到90%以上，平均每件快遞包裝耗材減少10%以上，推廣使用中轉(zhuǎn)箱、籠車等設(shè)備，編織袋和膠帶使用量進(jìn)一步減少。基本建立快遞業(yè)包裝治理體系。2019年1月1日實(shí)施的《電商法》中第五十二條規(guī)定，快遞物流服務(wù)提供者應(yīng)當(dāng)按照規(guī)定使用環(huán)保包裝材料，實(shí)現(xiàn)包裝材料的減量化和再利用。

1材料與方法

1.1材料、試劑和培養(yǎng)液

煙草品種為 K326(Nicotianatabacumcv. K326)；水楊酸(SA)購(gòu)自Sigma。植物總RNA提取試劑盒購(gòu)自天根；PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix DimerEraserTM均購(gòu)自Takara。

Hoagland基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)液：1.2 mmol/L KNO3；0.8 mmol/L Ca(NO3)2；0.2 mmol/L NH4H2PO4；0.2 mmol/L MgSO4；50 μmol/L KCl；12.5 μmol/L H3BO3；1 μmol/L MnSO4；1 μmol/L ZnSO4；0.5 μmol/L CuSO4；10 μmol/L Fe-EDTA；0.1 μmol/L H2MoO4。

建筑信息模型是一切BIM工作的源泉，數(shù)據(jù)和信息是一切施工管理工作的基礎(chǔ)，有“模型”才有數(shù)據(jù)和信息（見圖2～圖7）。

1.3總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

1.2煙草水培及水楊酸處理

由圖1可見，煙草打頂后，鉀離子的濃度在30 min時(shí)達(dá)到一個(gè)峰值，隨后隨時(shí)間的增加而逐漸下降，但打頂處理后培養(yǎng)液的鉀離子濃度始終高于不打頂處理的濃度。不同濃度SA對(duì)根系鉀有不同的效果。打頂加50 μmol/L SA處理的培養(yǎng)液鉀離子濃度高于打頂處理(除了30 min)，且隨著時(shí)間變化先降低后升高，在3 d左右達(dá)到一個(gè)峰值；對(duì)于打頂加10 μmol/L SA和打頂加5 μmol/L SA處理，培養(yǎng)液中鉀離子濃度隨時(shí)間增加而逐漸降低，但打頂加10 μmol/L SA處理的鉀離子濃度高于打頂處理的濃度(除30 min外)，而打頂加5 μmol/L SA處理的鉀離子濃度在30 min以后一直處于打頂和不打頂處理之間。這表明，打頂會(huì)降低煙草根系鉀吸收，低濃度SA(5 μmol/L )處理能夠促進(jìn)打頂后根系對(duì)鉀的吸收，而較高濃度的SA(50 μmol/L )效果相反，甚至導(dǎo)致鉀流失。

Hoagland低鉀營(yíng)養(yǎng)液：在基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)液中，分別用0.6 mmol/L Ca(NO3)2和50 μmol/L CaCl2替換1.2 mmol/L KNO3和50 μmol/L KCl。鉀濃度用KCl調(diào)節(jié)。

2.3NTORK1/HAK1表達(dá)與根系鉀吸收的相關(guān)分析

（2）評(píng)價(jià)內(nèi)容多維化。職業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的項(xiàng)目比重表包括理論知識(shí)和技能兩個(gè)方面。比重表反映了各項(xiàng)工作內(nèi)容在培訓(xùn)考核中所占的比例。國(guó)際商法課程考核應(yīng)基于職業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的項(xiàng)目權(quán)重，對(duì)學(xué)生的理論知識(shí)、技能操作、基本素質(zhì)和外語(yǔ)水平進(jìn)行全面考核。如，根據(jù)《報(bào)關(guān)員國(guó)家職業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（試行）》，理論知識(shí)和技能操作各占50%。在100分的理論知識(shí)中，職業(yè)道德和基礎(chǔ)知識(shí)占15%，報(bào)關(guān)英語(yǔ)占5%，其他專業(yè)知識(shí)占80%。由于職業(yè)標(biāo)準(zhǔn)是考慮職業(yè)需要，而非考慮高等院校的不同特點(diǎn)而制定，鑒于高職教育的特殊性，在實(shí)際課程考核評(píng)價(jià)中，技能操作所占的比重還可以大大提高。

對(duì)鉀運(yùn)輸基因NTORK1(AB196792)、HAK1(DQ841950)和NtKC1(AB196791)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析，定量PCR引物見表1。以煙草β2-ACTIN(AB158612)為內(nèi)參基因。以cDNA為模板，按照SYBR Premix DimerEraserTM(Toyobo，Japan)說(shuō)明書操作，在ABI Stepone Plus(Applied Bio-systems，美國(guó))上進(jìn)行反應(yīng)。PCR體系為：10 μL SYBR Premix DimerEraserTM，0.4 μL ROX Reference Dye，2 μL cDNA(<100 ng)，10 μmol/L上下游引物各0.6 μL，ddH2O補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 60 s；40個(gè)循環(huán)(95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s)。反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化曲線和融解曲線。設(shè)樣本和內(nèi)參各3個(gè)重復(fù)，采用ΔΔCt相對(duì)定量法分析數(shù)據(jù)，即目的基因相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt。

其中，ΔΔCt=(實(shí)驗(yàn)組ΔCt)-(對(duì)照組ΔCt)，實(shí)驗(yàn)組ΔCt=(實(shí)驗(yàn)組目的基因Ct)-(實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因Ct)，對(duì)照組ΔCt=(對(duì)照組目的基因Ct)-(對(duì)照組內(nèi)參基因Ct)，2-ΔΔCt表示的是實(shí)驗(yàn)組目的基因的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組的變化倍數(shù)。

表1　實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

2結(jié)果與分析

2.1水楊酸對(duì)打頂后煙草根外鉀離子的影響

分別對(duì)30 min、3 h和3 d時(shí)不打頂、打頂加5 μmol/L SA和打頂三種處理煙草的根和葉進(jìn)行取樣，并提取RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。由圖2可知，PCR產(chǎn)物電泳為單帶且位置大小正確，HAK1、NtKC1和NTORK1三個(gè)基因的熔解曲線都為單峰曲線，實(shí)驗(yàn)條件符合定量PCR需要(圖2A和2B)。

煙草種子播種于盛有煙草專用育苗基質(zhì)和蛭石(5∶2)混合的漂浮盤中，生長(zhǎng)至5片真葉時(shí)，選取生長(zhǎng)均勻一致的煙苗在自來(lái)水中輕緩洗凈根部，然后移入10升裝有1/4 Hoagland基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)液的培養(yǎng)盆中連續(xù)通氣培養(yǎng)，每3 d更換1次營(yíng)養(yǎng)液。待煙苗緩苗后選取煙葉正常生長(zhǎng)且均勻一致的煙苗移至內(nèi)徑為7.5 cm，高為7 cm的塑料杯中，每杯1株，用Hoagland低鉀營(yíng)養(yǎng)液通氣水培，供鉀水平為0.1 mmol/L。煙苗長(zhǎng)至六葉一心時(shí)，在低鉀水培條件下，設(shè)置如下5個(gè)處理：不打頂，打頂，打頂加5 μmol/L SA，打頂加10 μmol/L SA，打頂加50 μmol/L SA。其中SA均加入低鉀營(yíng)養(yǎng)液中，打頂為去掉頂部一葉一心。并在0 min，10 min，20 min，30 min，1 h，3 h，7 h，1 d，3 d，5 d時(shí)間段取出培養(yǎng)液，用火焰光度法檢測(cè)培養(yǎng)液中的鉀含量。試驗(yàn)重復(fù)3次。

圖1　不同處理下培養(yǎng)液鉀離子濃度的變化

2.2打頂對(duì)鉀運(yùn)輸基因表達(dá)的影響

烏江風(fēng)情廊道是烏江流域旅游資源聚集區(qū)，具有資源稟賦品級(jí)高、質(zhì)量?jī)?yōu)、分布廣、密度大等特點(diǎn)，具有良好的利用開發(fā)條件，有利于文化旅游產(chǎn)業(yè)集群化發(fā)展。

1.4鉀通道基因表達(dá)水平分析

以不打頂作為對(duì)照，比較HAK1、NTORK1和NtKC1的相對(duì)表達(dá)水平(圖3A、B和C)。由圖3可知，HAK1在葉中表達(dá)比較高，且打頂加SA在3 h表達(dá)最高，但HAK1在根中的變化平穩(wěn)；NTORK1在3 h表達(dá)量相對(duì)比較高；NtKC1在根和葉的表達(dá)量分別在3 h和3 d相對(duì)較高。但作為根系主要的吸鉀基因(HAK1)和排鉀基因(NTORK1)，其表達(dá)隨時(shí)間變化趨勢(shì)如何關(guān)聯(lián)根系鉀吸收變化，仍需進(jìn)一步研究。

圖2　各鉀運(yùn)輸基因定量條件

(A)

(B)

(C)

對(duì)各處理煙株的根和葉分別進(jìn)行取樣，在液氮中速凍后，采用天根總RNA提取試劑盒方法提取煙草總RNA，然后以O(shè)ligo(dT)為引物，按照寶生物cDNA合成試劑盒的操作說(shuō)明合成cDNA第1鏈。

3) 0—2狀態(tài)轉(zhuǎn)換。能造成該轉(zhuǎn)換的情況有一種：2個(gè)通道中任意1個(gè)通道發(fā)生非共因失效下的FDU，其概率為

為了進(jìn)一步了解打頂和SA處理后根系鉀變化趨勢(shì)與“NTORK1/HAK1”變化趨勢(shì)的關(guān)系，分析了不同處理下根和葉中“NTORK1/HAK1”表達(dá)水平比值隨時(shí)間的變化(圖4)。根中打頂和打頂加5 μmol/L SA兩種處理導(dǎo)致“NTORK1/HAK1”表達(dá)水平比值上升，與相應(yīng)處理中根系鉀吸收低于不打頂處理的結(jié)果一致，而煙葉中“NTORK1/HAK1”比值的變化趨勢(shì)與根系相反。這說(shuō)明，根系 “NTORK1/HAK1”的比值變化可以在一定程度上說(shuō)明根系鉀吸收的差異，但是低濃度SA在促進(jìn)打頂后煙草根系對(duì)鉀的吸收過(guò)程中，是調(diào)節(jié)了NTORK1還是HAK1并未清楚，還需進(jìn)一步研究。

異步協(xié)作模式類似圖1維基百科的“引用—改進(jìn)”模式：設(shè)計(jì)師公開發(fā)布方案供其他人引用，同時(shí)可以引用任何公開發(fā)布的方案進(jìn)行修改和提交新方案?？紤]到產(chǎn)品設(shè)計(jì)的實(shí)際情況，該模式允許用戶引用任何一款設(shè)計(jì)方案，而不一定是最新一輪方案。

(A)

(B)

3結(jié)論與討論

煙草打頂后植株體內(nèi)物質(zhì)的變化近年來(lái)一直是研究熱點(diǎn)。代曉燕等[16]報(bào)道打頂能夠降低煙葉內(nèi)IAA、ABA、GA3和ZR的含量，刺激根中IAA、ABA、GA3和ZR含量的增加。鄒焱等[17]證明打頂對(duì)煙株中GA3、ABA和IAA含量均有較大的影響，能增加煙葉和根中GA3和ABA含量，而明顯降低IAA含量。Fu等[18]表明打頂增加了煙草根部生長(zhǎng)素的濃度。這表明打頂會(huì)引起煙株內(nèi)源激素的變化，打破內(nèi)源激素的平衡。鄭憲濱等[15]研究表明打頂后煙草鉀會(huì)重新分配和轉(zhuǎn)移，鉀會(huì)外排。減少打頂造成鉀素的分配和轉(zhuǎn)移是我們一直關(guān)注的重點(diǎn)。洪麗芳等[19]采用86Rb標(biāo)記示蹤原子法研究了烤煙打頂傷口添加NAA后煙草中鉀元素的再循環(huán)再分配情況，結(jié)果表明打頂傷口涂抹NAA后有利于鉀在葉片的積累，NAA參與鉀運(yùn)輸?shù)恼{(diào)控過(guò)程。陳迪文[20]研究表明打頂會(huì)導(dǎo)致煙葉中鉀含量下降，噴施調(diào)節(jié)劑后有利于鉀在煙葉中的累積，使煙葉的鉀含量得到提升。Jayakannan等[5]發(fā)現(xiàn)在擬南芥中，SA能抑制鉀通道GORK在鹽脅迫下導(dǎo)致的鉀外流。因此通過(guò)施加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，并研究根外鉀對(duì)改善煙葉質(zhì)量有很大的理論和應(yīng)用價(jià)值。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，打頂降低根系鉀吸收，施加5 μmol/L SA能提高打頂后煙草根系對(duì)鉀的吸收，而較高濃度的SA(10 μmol/L和50 μmol/L)效果相反。

激素對(duì)鉀運(yùn)輸?shù)恼{(diào)控作用一直受人們關(guān)注。Gaymard等[21]報(bào)道了SKOR的表達(dá)受脫落酸(ABA)的抑制。Becker等[22]研究表明脫落酸(ABA)誘導(dǎo)保衛(wèi)細(xì)胞質(zhì)膜去極化和GORK表達(dá)，GORK介導(dǎo)的鉀離子流出也受誘導(dǎo)。Coskun等[23]指出在低鉀濃度0.1 mmol/L下，鉀是通過(guò)鉀通道介導(dǎo)外流。Sano等[14]研究表明5.4 μmol/L NAA可使細(xì)胞分裂，且誘導(dǎo)NTORK1的表達(dá)。Armengaud等[24]提出鉀缺乏時(shí)茉莉酸(JA)生物合成酶，脂氧合酶等酶的轉(zhuǎn)錄水平顯著增加。Philippar等[25]表明生長(zhǎng)素通過(guò)增加鉀離子通道密度誘導(dǎo)了玉米ZMK1基因的表達(dá)。這些研究結(jié)果都表明生長(zhǎng)素參與了鉀離子缺乏響應(yīng)以及鉀離子攝取。在本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)對(duì)鉀運(yùn)輸基因NtKC1、HAK1和NTORK1實(shí)時(shí)定量分析，發(fā)現(xiàn)根系中“NTORK1/HAK1”比值與根對(duì)鉀吸收能力的差異基本一致，這可推測(cè)SA可能是通過(guò)“NTORK1 和HAK1”的表達(dá)比來(lái)調(diào)節(jié)根系鉀吸收，但是其他鉀運(yùn)輸通道參與作用的方式和水平，以及SA在調(diào)節(jié)煙草根系鉀吸收的過(guò)程中是調(diào)節(jié)了NTORK1還是HAK1并未清楚，還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本文研究了水楊酸對(duì)打頂后煙草根系鉀吸收的調(diào)控作用，其結(jié)果表明，煙草打頂可降低煙草根系鉀吸收，而打頂同時(shí)施加水楊酸可以改變根系吸收鉀的能力。當(dāng)施加SA濃度為5 μmol/L時(shí)，能夠提高根系對(duì)鉀的吸收，而較高濃度的SA(10 μmol/L和50 μmol/L)效果相反。在打頂加5 μmol/L SA和打頂兩個(gè)處理中，HAK1和NTORK1基因的表達(dá)水平變化趨勢(shì)基本一致，且在處理前后根和葉中鉀運(yùn)輸基因“NTORK1/HAK1”比值的變化趨勢(shì)和根系鉀吸收的趨勢(shì)基本一致，尤其是根系中“NTORK1/HAK1”的比值。這說(shuō)明，打頂導(dǎo)致根系鉀吸收減少，這個(gè)過(guò)程受SA的調(diào)控，并且可以由根系中“NTORK1/HAK1”的比值變化初步表征。

參 考 文 獻(xiàn)：

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The effect of salicylic acid regulation after topping on potassium absorption by tobacco roots

YANGYa1,ZHAOJie-hong2,JIANGXiao1,MUYing-chun1,SUWei1*

(1.CollegeofLifeScience,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China; 2.KeyLaboratoryofMolecularGeneticsofCNTC,GuizhouAcademyofTobaccoScience,Guiyang,Guizhou550081,China)

Abstract：In order to understand the potassiumdistribution and transfer in tobacco roots after topping, the effect of topping alone and toppingtogether withdifferent concentrations of salicylic acid regulation on expression of the genes related to potassium absorption and transfer by tobacco roots was studied. Topping alone of tobacco decreased the potassium absorption in root, while topping together with applying salicylic acid could affect the trend of potassium absorption in roots.Application of 5 μmol/L of salicylic acid increased potassium absorption.However, higher concentrations of salicylic acid resulted in the opposite effects, i.e. reducing the potassium absorption. In addition, there was similarity between the ratio of the genes "NTORK1/HAK1" and the difference of ability of potassium absorption in tobacco roots, indicating that the expression of NTORK and HAK1 may be regulated by salicylic acid,which can be used as an indirect index for potassiumdistribution and transfer in root after topping.

Keywords：Tobacco; Potassium; Topping; Salicylic acid

文章編號(hào)：1008-0457(2016)01-0045-06國(guó)際DOI編碼：15958/j.cnki.sdnyswxb.2016.01.010

中圖分類號(hào)：S572

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

通訊作者：蘇偉(1974-)，男，博士，副教授，主要研究方向：應(yīng)用生物技術(shù)研究；E-mail：suwei1886@163.com。

基金項(xiàng)目：中國(guó)煙草總公司科技重大專項(xiàng)項(xiàng)目(110201401007(JY-07))；貴州省農(nóng)業(yè)攻關(guān)科技計(jì)劃(黔科合NY[2013]3020號(hào))；貴州省科技廳農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目(黔科合NY[2013]3052號(hào))。

收稿日期：2016-01-06；修回日期：2016-02-08