朱流紅，安啟菲，吳軼凡，龍友華，趙贊偉，尹顯慧*

(1.貴州大學(xué) 作物保護研究所，貴州 貴陽 550025；2.畢節(jié)市煙草公司大方縣分公司，貴州 大方 551600)

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煙草黑脛病菌對7種殺菌劑的敏感性

朱流紅1，安啟菲2，吳軼凡2，龍友華1，趙贊偉1，尹顯慧1*

(1.貴州大學(xué) 作物保護研究所，貴州 貴陽 550025；2.畢節(jié)市煙草公司大方縣分公司，貴州 大方 551600)

摘要：采用7種殺菌劑對煙草黑脛病菌室內(nèi)毒力，并通過對比EC50的方法得出煙草黑脛病菌的抗性水平。結(jié)果表明：在7種殺菌劑中，1%的申嗪霉素SC對煙草黑脛病菌的毒力最強，其EC50值為0.0684 μg/mL；其次為40%氟硅唑EC，EC50值為0.1276 μg/mL。70%丙森鋅WP對煙草黑脛病菌的毒力最差，其EC50值為85.4334 μg/mL。根據(jù)結(jié)果得出煙草黑脛病菌對1%的申嗪霉素SC和40%氟硅唑EC表現(xiàn)敏感且抗性水平范圍均小于1 μg/mL;對70%丙森鋅WP已達(dá)到高抗水平且抗性水平范圍大于100 μg/mL。

關(guān)鍵詞：煙草黑脛??；殺菌劑；毒力測定；敏感性

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA):稱取去皮馬鈴薯200 g，加無菌水1000 mL煮沸半小時；濾去殘渣，向濾液中加入葡萄糖20 g，瓊脂18 g，待葡萄糖和瓊脂溶解后加水定容至1000 mL，分裝在三角瓶中。將三角瓶在0.103 Mpa、121℃下高壓滅菌20 min。

1.1.2供試菌株

在貴州省惠水縣煙草基地采集煙草黑脛病染病煙株，室內(nèi)分離純化。

1.1.3試驗藥劑

供試藥劑、生產(chǎn)廠家及有效成分處理濃度見表1。

稱取長柄扁桃粕（苦杏仁苷質(zhì)量含量5.67%，野黑櫻苷未檢出）10份，每3份作為一組，三組分別加入2.5、5.5、10.0 mg的苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)品，再分別加入0.1、0.2、0.5 mg的野黑櫻苷標(biāo)準(zhǔn)品，1份留做空白，按照1.2.3.2方法處理，液相測定。計算長柄扁桃粕中平均加標(biāo)回收率，結(jié)果見表1。

1.2試驗方法

1.2.1病原菌的分離純化方法

在貴州省惠水縣煙草基地采集煙草黑脛病染病煙株，按照常規(guī)的組織分離方法進行分離[12],在新鮮病株的病健交接處切取一定大小的病組織，用70%的酒精消毒10 min，再用無菌水反復(fù)浸洗，用無菌剪刀將病組織塊剪成小塊，置于PDA平板上，于25℃左右恒溫箱中培養(yǎng)4 d后，待分離物長出明顯的白色菌絲，挑取邊緣的白色菌絲，進行分離純化[13]，將純化2-3次后的病原菌轉(zhuǎn)于PDA斜面培養(yǎng)基中于4℃冰箱中保存。

1.2.2病原菌致病力測定方法

用分離的純菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)6 d，用直徑為0.5 cm的無菌打孔器打取菌餅，把菌餅粘于新鮮健康的刺傷的寄主煙草植株上(用75%酒精對其植株表面消毒)，外面遮蓋一層用無菌水侵泡過的脫脂棉保濕，以無菌水脫脂棉保濕作對照，然后將接種的盆栽置于25℃左右的溫室內(nèi)培養(yǎng)，將分離的病原菌接種到30株健康植株上，每隔1 d觀察1次。發(fā)現(xiàn)24株植株發(fā)病，記載發(fā)病情況和觀察病斑菌絲體，并對接種成功的病斑進行組織分離，確認(rèn)致病菌株。

1.2.3黑脛病菌對藥劑的敏感性測定方法

采用菌絲生長速率法測定[14]。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，將供試藥劑稀釋成不同系列濃度的溶液(見表1)。在無菌操作條件下，每種藥劑先配制好比供試濃度高10倍的母液，然后以1∶9的比例與培養(yǎng)基混合均勻，即得系列濃度梯度的含藥培養(yǎng)基，以無菌水作空白對照。每皿為此種處理的一次重復(fù)，每個處理重復(fù)3次。將培養(yǎng)6 d的煙草黑脛病菌株用內(nèi)徑為0.5 cm的無菌打孔器沿菌落邊緣打取菌餅，用接種針將菌餅轉(zhuǎn)接到各含藥平板中央，28℃培養(yǎng)待對照組菌落長滿時，用十字交叉法測菌落直徑，運用農(nóng)藥室內(nèi)生物測定數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件[15]算出各種殺菌劑對煙草黑脛病菌的抑制中濃度EC50、95%置信區(qū)間及相關(guān)系數(shù)R。

1.2.4煙草黑脛病菌對供試殺菌劑抗性水平的比較

病原菌對供試殺菌劑(活體生物菌劑除外)的抗性劃分，參照張建軍等[16]的方法并做了一定調(diào)整，具體如下：敏感(S)，EC50<1 μg/mL；低抗(LR)，1 μg/mL100 μg/mL。

表1　各供試藥劑及濃度梯度

注：2億活孢子/g木霉菌WP 和0.2億/g地衣芽孢桿菌的濃度單位是10×108億/g，其余殺菌劑的濃度單位μg/mL。

2結(jié)果與分析

2.1煙草黑脛病的癥狀

該病在煙草生長各個時期均有發(fā)生，柯赫氏法則發(fā)現(xiàn)病株葉片自下而上依次變黃，逐漸全株葉片凋萎，病部表面長出一層稀疏的白毛，此為病原菌的菌絲體。剖開病莖，髓部呈黑褐色，干縮成碟片狀，碟片之間有稀疏棉絮狀的菌絲體。

2.2煙草黑脛病菌分離純化和病原物確定

試驗共分離出9株菌株，均能使煙草健康植株發(fā)病。植株癥狀表現(xiàn)在葉片自下而上依次變黃，逐漸全株凋萎，病部表面長出一層稀疏的白色菌絲體，剖開髓部呈黑褐色干縮碟片狀。用顯微鏡觀察發(fā)病部分菌絲體形狀，氣生菌絲較細(xì)，無色透明，無隔膜，孢子囊頂生或側(cè)生，梨形或橢圓形，頂端有乳頭狀突起。

2.3殺菌劑對煙草黑脛病菌的室內(nèi)毒力測定結(jié)果

殺菌劑對煙草黑脛病菌的室內(nèi)毒力測定結(jié)果見表2。從表中可以看出，供試的7種殺菌劑對煙草黑脛病菌均表現(xiàn)出一定的抑制作用，其中1%的申嗪霉素SC對病菌的抑制作用最強，EC50值為0.0684 μg/mL；其次40%氟硅唑?qū)煵莺诿劜【泻芎玫囊种谱饔茫珽C50值為0.1276 μg/mL；50%咪鮮胺錳鹽WP的抑制效果一般，EC50值為14.4381 μg/mL；35%苯甲·菌酯SC和70%丙森鋅WP對煙草黑脛病菌的抑制效果較差，EC50值分別為201.5449 μg/mL和851.8861 μg/mL；2億活孢子/g木霉菌WP 和0.2億/g地衣芽孢桿菌活體真菌類微生物殺菌劑，其EC50為活孢子濃度。

2.4煙草黑脛病菌對供試殺菌劑抗性水平的比較

病原菌對供試殺菌劑的抗性水平見表3。從表中可以看出，病原菌對1%申嗪霉素SC、40%氟硅唑EC表現(xiàn)敏感， 抗性水平范圍小于1 μg/mL； 對50%咪鮮胺錳鹽WP、35%苯甲·菌酯SC、70%丙森鋅WP均表現(xiàn)一定抗性，對50%咪鮮胺錳鹽WP表現(xiàn)中抗水平，抗性水平范圍在10～100 μg/mL之間；對35%苯甲·菌酯SC和70%丙森鋅WP已達(dá)到高抗水平，抗性水平范圍大于100 μg/mL。

表3　各種殺菌劑對煙草黑脛病菌的抗性水平

3討論

煙草黑脛病是煙草生產(chǎn)過程中的重要病害，化學(xué)防治仍然是當(dāng)今乃至今后一段時期內(nèi)比較有效的防治手段[17]。本實驗采用菌絲生長速率法測定7種殺菌劑對煙草黑脛病菌菌絲生長的抑制作用，從中篩選出了1%申嗪霉素SC、40%氟硅唑EC、50%咪鮮胺錳鹽WP和2億活孢子/g木霉菌WP四種對煙草黑脛病菌有較好抑制效果的藥劑，其中1%申嗪霉素SC和40%氟硅唑EC的抑菌效果最佳，其EC50值分別為0.0684 μg/mL和0.1276 μg/mL。50%咪鮮胺錳鹽WP和2億活孢子/g木霉菌WP次之，EC50值分別為14.4381 μg/mL和85.4334 μg/mL。

表2　不同殺菌劑對煙草黑脛病菌毒力測定結(jié)果

1%申嗪霉素SC是由熒光假單胞桿菌分泌的一種抗菌素，主要有效成分是吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid)，其主要是利用吩嗪-1-羧酸還原能力，在真菌細(xì)胞內(nèi)積累活性氧，抑制線粒體中呼吸傳遞鏈的氧化磷酸化，從而抑制菌絲的正常生長，引起植物病原真菌菌絲體的斷裂、腫脹、變形和裂解[18]。近年來甲霜靈在貴州使用已造成煙草黑脛病菌抗藥性的產(chǎn)生，然而1%申嗪霉素SC在貴州剛剛投入使用，且在本實驗中發(fā)現(xiàn)對煙草黑脛病菌的抑菌效果較好。可以將1%申嗪霉素SC和甲霜靈交換使用來減緩抗藥性的進一步發(fā)展。

氟硅唑(Flusilazole)是美國杜邦公司開發(fā)的含硅內(nèi)吸性三唑類殺菌劑，為甾醇脫甲基化抑制劑，能破壞和阻止病菌麥角甾醇的合成，導(dǎo)致細(xì)胞膜不能形成，使病菌死亡[19]。對子囊菌綱和半知菌類真菌有效，目前用于防治葡萄黑痘病、果樹及瓜果類黑星病、白粉病等[20]。被用于防治煙草黑脛病菌還比較少見，因此煙草黑脛病菌對其表現(xiàn)敏感。由于其半衰期短、易降解、內(nèi)吸性較強、對作物安全等特點，在農(nóng)業(yè)中也被廣泛使用。

木霉菌主要用于防治各類植物的土傳病害, 以及部分葉部和穗部病害，不僅能防病，還具有促進植物生長、提高營養(yǎng)利用效率，增強植物抗逆性和修復(fù)農(nóng)化污染環(huán)境等功能[21]。雖然在本實驗中2億活孢子/g木霉菌WP對煙草黑脛病菌抑菌效果一般，但可以在防病的同時也對植物生長提供幫助，增強植株的抵抗能力。煙草黑脛病菌對50%咪鮮胺錳鹽WP已表現(xiàn)出中抗水平，應(yīng)引起重視，在生產(chǎn)中要注意交替使用。

35%苯甲·菌酯SC和70%丙森鋅WP表現(xiàn)出高抗水平，應(yīng)停止使用或限制使用該藥劑以及與其有交互抗性的藥劑，并應(yīng)換用新的殺菌劑或與其沒有交互抗性的藥劑品種，以延緩煙草黑脛病菌抗藥性的進一步發(fā)展。0.2億/g地衣芽孢桿菌WP抑菌效果較差，其EC50值562.3432 μg/mL，不建議在田間使用。

研究發(fā)現(xiàn)，殺菌劑的混用可以同時降低抗藥性菌株和敏感菌株的生長速率，從而達(dá)到延緩病原菌抗藥性群體的形成，而某一種殺菌劑的單獨使用則會增加抗藥性發(fā)生的風(fēng)險[22]。因此，在生產(chǎn)過程中應(yīng)減少單劑的使用并對田間進行抗藥性監(jiān)測及治理研究。且為了延緩煙草黑脛病菌對農(nóng)藥抗藥性的產(chǎn)生，建議將1%申嗪霉素SC、40%氟硅唑EC、50%咪鮮胺錳鹽WP和2億活孢子/g木霉菌WP四種農(nóng)藥與其他作用機制不同的殺菌劑交替使用或混合使用。

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Determination on Sensitivity ofPhytophthoraNicotianaetoSeven Fungicides

ZHULiu-hong1,ANQi-fei2,WUYi-fan2,LONGYou-hua1,ZHAOZan-wei1,YINXian-hui1*

(1.InstituteofCropProtection,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China; 2.DafangBranchofBijieTobaccoCompany,Dafang,Guizhou551600,China)

Abstract:The toxicity of seven fungicides against Phytophthora nicotianaewere determined by colony diameter method in laboratory, and the resistance level was evaluated by the method of contrast EC50of Phytophthora nicotianae.The results showed that 1% phenazino -1- carboxylic acid SC gave the best toxicity against P. nicotianae, whose EC50value was 0.068 μg/mL. The second one was 40% flusilazole EC, whose EC50value was 0.1276 μg/mL. The worst effect was obtained from 70% propineb WP,whose EC50value was 85.4334 μg/mL. Therefore, 1% phenazino -1- carboxylic acid SC and 40% flusilazole EC were effective for P. nicotianae prevention, and the resistance level were less than 1 μg/mL. Also, 70% propineb WP demonstrated a high resistance level, and the resistance level was greater than100 μg/mL.

Key words:Phytophthora nicotianae, Fungicides, Toxicity determination, Sensitivity

文章編號：1008-0457(2016)01-0018-05國際DOI編碼：15958/j.cnki.sdnyswxb.2016.01.005

中圖分類號：S482.2

文獻標(biāo)識碼：A

*通訊作者：尹顯慧(1978-)，女，博士，副教授，主要研究方向：有害生物綠色治理及農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全；E-mail: 16678192@qq.com。

基金項目：中國煙草總公司貴州省公司科技項目“大方縣烤煙病蟲害生物防治技術(shù)推廣應(yīng)用”(201425)；中國煙草總公司貴州省公司科技項目“前茬除草劑殘留對烤煙生長影響及削減技術(shù)研究”(201508)。

收稿日期：2015-12-04；修回日期：2016-02-04