黃清媚，康小龍，黃 清，肖文娟，李晶博，林蔣海，劉澤寰

(暨南大學生命科學技術(shù)學院，廣東 廣州 510632)

餐飲垃圾制備乙醇的同步糖化發(fā)酵研究

黃清媚，康小龍，黃 清，肖文娟，李晶博，林蔣海，劉澤寰

(暨南大學生命科學技術(shù)學院，廣東 廣州 510632)

為建立一種針對餐飲垃圾的同步糖化發(fā)酵技術(shù)，進一步提高乙醇的產(chǎn)率，以期早日實現(xiàn)工業(yè)化，通過將單酶以兩兩組合或三個混合的方式篩選最優(yōu)酶組合，結(jié)果顯示終酶活力120 U/g的糖化酶與300 U/g的異淀粉酶之間的協(xié)同作用最好，葡萄糖產(chǎn)量達130.29 g/L。利用釀酒酵母CICC 1346、終酶活力為120 U/g的糖化酶和300 U/g的異淀粉酶對餐飲垃圾進行了同步糖化發(fā)酵(SSF)和分步糖化發(fā)酵(SHF)，結(jié)果顯示SSF和SHF的乙醇產(chǎn)量分別為49.48 g/L和45.89 g/L，糖醇轉(zhuǎn)化率分別為91.7%和77.1%。SSF與SHF相比存在操作簡單、發(fā)酵時間短和乙醇產(chǎn)率高的優(yōu)勢，已具備了工業(yè)化應用的價值。

餐飲垃圾；異淀粉酶；SSF；SHF；乙醇

餐飲垃圾是指來自酒店、餐廳、食堂等含有高水分含量、高有機物含量和高鹽的特殊有機垃圾[1]。我國目前每年產(chǎn)生的餐飲垃圾數(shù)量驚人，據(jù)不完全統(tǒng)計，已超過6 000萬t/a[2]。而餐飲垃圾本身對環(huán)境和食物鏈存在顯性危害，因此餐飲垃圾的處理至關(guān)重要。利用餐飲垃圾生產(chǎn)乙醇是餐飲垃圾處理的新的研究方向，近年來雖然取得了一定的進展，但在發(fā)酵工藝模式、發(fā)酵周期、乙醇產(chǎn)率等方面還有待改進。此外，由于2006年起我國政府已限制用糧食來生產(chǎn)酒精[3]，所以建立成熟、高效的利用非糧食原料——餐飲垃圾生產(chǎn)乙醇的技術(shù)就顯得十分必要了。

由于菌種釀酒酵母本身是不具備淀粉降解能力的，而是需要將淀粉降解為葡萄糖后(此步驟稱為糖化)，才能被酵母發(fā)酵成為乙醇，因此糖化步驟和方式是影響乙醇生產(chǎn)的決定性因素。餐飲垃圾分為纖維素類和淀粉類，兩類均可以通過酶解發(fā)酵制備燃料乙醇[4]。纖維素類餐飲垃圾的酶解研究相對成熟，如于紅艷等[5]采用纖維素酶和糖化酶酶解餐飲垃圾；曹媛媛等[6]采用淀粉酶、糖化酶、蛋白酶和纖維素酶酶解餐飲垃圾；劉偉偉等[7]采用液化酶、糖化酶、纖維素酶和脂肪酶酶解餐飲垃圾；黃智等[8]采用纖維素酶、漆酶和α-淀粉酶酶解餐飲垃圾。目前淀粉類餐飲垃圾主要是采用α-淀粉酶[9]或液化酶[4]與糖化酶共同酶解餐飲垃圾，未有報道異淀粉酶與糖化酶共同酶解餐飲垃圾。

目前工業(yè)上生產(chǎn)乙醇主要采用分步糖化發(fā)酵(Separate Hydrolysis and Fermentation,SHF)和同步糖化發(fā)酵法(Simultaneous Saccharification and Fermentation, SSF)，SHF的特點是先糖化后發(fā)酵，而SSF的特點是邊糖化邊發(fā)酵[10]。相對來說SSF具有操作簡單、效率高、自動化程度高等優(yōu)勢，因此本文著重探討建立一種較為先進的利用餐飲垃圾制備乙醇的同步糖化發(fā)酵技術(shù)。同時，由于餐飲垃圾中的營養(yǎng)成分復雜、淀粉來源復雜，不像傳統(tǒng)糧食發(fā)酵那樣背景清晰，所以本文進行了一系列的探索工作，以期進一步提高糖化效率和乙醇產(chǎn)率，為早日打通利用餐飲垃圾生產(chǎn)乙醇的工業(yè)化之路打好基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 餐飲垃圾的預處理

餐飲垃圾取樣于廣州市某高校食堂。餐飲垃圾經(jīng)過除雜之后，直接由粉碎機粉碎成小塊。經(jīng)121 ℃滅菌20 min后于-20 ℃保存?zhèn)溆?。其主要成分和基本特性如?所示。

1.2 菌株以及其培養(yǎng)條件

所用菌株為釀酒酵母CICC 1346，購買于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)。該菌種是一株乙醇工業(yè)發(fā)酵用酵母，乙醇產(chǎn)量高，有良好的乙醇和高糖耐受能力，可在YPD(w=1%酵母提取物，w=2%蛋白胨，w=2%葡萄糖)中培養(yǎng)。菌株和YPD以1∶50的比例于30 ℃，200 r/min活化24 h，再轉(zhuǎn)接培養(yǎng)12 h，用YP將菌株的A600均調(diào)至0.5～0.6之間,可作為發(fā)酵的酒母使用。

表1 餐飲垃圾的特征Table 1 Characteristics of food waste

1.3 酶

用于催化餐飲垃圾發(fā)生水解反應的酶包括α-淀粉酶、糖化酶和異淀粉酶。α-淀粉酶(芽孢桿菌)和糖化酶(黑曲霉變異菌株)購買于上海阿拉丁試劑有限公司，異淀粉酶(產(chǎn)氣氣桿菌)購買于武漢諾輝醫(yī)藥化工有限公司。3種酶的最佳反應溫度分別為：50～70，55～60，50 ～55 ℃。3種酶的最優(yōu)pH分別為：5.5～7.5，3.5～4.5，5.6～7.0。3種酶的酶活活性分別為：3 700、100 000、20 000 U/g。

1.4 餐飲垃圾的酶水解

1.4.1 不同酶活力的3種單酶對餐飲垃圾水解的影響 所有酶解實驗均于50 mL圓底發(fā)酵瓶中操作。每瓶稱取8 g餐飲垃圾，121 ℃滅菌20 min。利用不同終酶活力的α-淀粉酶(8，10，12 U/g)、糖化酶(100，120，140 U/g)和異淀粉酶(200，300，400 U/g)分別水解餐飲垃圾。為了預防染菌，加入60 μg/μL的制霉菌素和80 μg/μL的四環(huán)素。選用pH 4.8檸檬酸緩沖液調(diào)平每瓶體積。酶解實驗于pH 4.8，50 ℃，200 r/min中反應72 h。酶活指數(shù)的計算公式：酶活指數(shù)=還原糖的產(chǎn)量/底物淀粉的總量[9]。

1.4.2 混合酶對餐飲垃圾水解的影響 根據(jù)最優(yōu)糖化率和經(jīng)濟效益來考慮，選出最佳酶活力的α-淀粉酶、糖化酶和異淀粉酶。3種單酶以兩兩組合或3個組合的方式混合利用，分別用于餐飲垃圾的酶解。為了預防染菌，也加入60 μg/μL的制霉菌素和80 μg/μL的四環(huán)素。酶解實驗于pH 4.8，50 ℃，200 r/min中反應72 h。

1.5 餐飲垃圾的SHF和SSF

將最佳酶組合用于餐飲垃圾的進一步分步糖化發(fā)酵和同步糖化發(fā)酵實驗。8 g餐飲垃圾121 ℃滅菌20 min備用。分步糖化發(fā)酵中，先加入最優(yōu)酶組合，于pH 4.8，50 ℃，200 r/min中糖化24 h，再加入w=10%的A600=0.5～0.6的酒母，于30 ℃，200 r/min中發(fā)酵餐飲48 h。同步糖化發(fā)酵中，同時加入最優(yōu)酶組合和酒母，于30 ℃，200 r/min中糖化發(fā)酵餐飲垃圾36 h。

乙醇轉(zhuǎn)化率的計算公式：

1.6 分析方法

實驗均做兩個平行，顯示數(shù)據(jù)為平均值± 標準方差(SD)。根據(jù)標準方法測定分析餐飲的pH，干物質(zhì)和粗蛋白。依據(jù)標準干燥法在105 ℃干燥至恒質(zhì)量測定餐飲含水量[11]。用Somogyi-Nelson法測定測定總糖含量[12]，用Soxhlet法測定脂肪含量[13]。在酶水解和發(fā)酵產(chǎn)酒精的過程中，收集餐飲垃圾混合物上清檢測葡萄糖和乙醇的含量。葡萄糖和乙醇含量由液相色譜儀來檢測分析。統(tǒng)計分析使用PASW 18軟件使用的統(tǒng)計數(shù)據(jù)單向方差分析和鄧肯多個范圍測試。結(jié)果95%置信interval被認為具有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)[14]。

2 結(jié)果和討論

2.1 不同酶活力的3種單酶對餐飲垃圾水解的影響

餐飲垃圾中碳水化合物由各種多糖和單糖組成，比如淀粉、纖維素、葡萄糖等等，來自大米的淀粉占很大的比例，所以對淀粉酶的選擇極為重要。本文將不同酶活力的3種單酶分別酶解餐飲垃圾，圖1顯示10 U/g的淀粉酶酶解餐飲垃圾的酶活指數(shù)最高。 圖2顯示300 U/g異淀粉酶酶解餐飲垃圾的酶活指數(shù)最高。圖3顯示120 U/g糖化酶酶解餐飲垃圾的酶活指數(shù)最高。綜合3種酶分別酶解餐飲垃圾的結(jié)果，從經(jīng)濟效益和酶活效率角度考慮，選擇10 U/g α-淀粉酶、300 U/g異淀粉酶和120 U/g糖化酶做后續(xù)的組合酶酶解實驗。

圖1 3種不同酶活力α-淀粉酶于72 h內(nèi)酶解餐飲垃圾的葡萄糖和還原糖產(chǎn)量(空心代表還原糖質(zhì)量濃度，實心代表葡萄糖質(zhì)量濃度)Fig.1 Glucose (filled diagram) and reducing sugar (open diagram) production of three concentrations of α-amylase on the enzymatic hydrolysis of food waste after 72 h

圖2 3種不同酶活力異淀粉酶于72 h內(nèi)酶解餐飲垃圾的葡萄糖和還原糖產(chǎn)量 (空心代表還原糖質(zhì)量濃度，實心代表葡萄糖質(zhì)量濃度)Fig.2 Glucose (filled diagram) and reducing sugar (open diagram) production of three concentrations of isoamylase on the enzymatic hydrolysis of food waste after 72 h

圖3 3種不同酶活力糖化酶于72 h內(nèi)酶解餐飲垃圾的葡萄糖產(chǎn)量Fig.3 Glucose production of three concentrations of glucoamylase on the enzymatic hydrolysis of food waste after 72 h

2.2 混合酶對餐飲垃圾酶解的影響

根據(jù)3種酶的作用機制，將3種單酶以兩兩組合或3個組合的方式混合作用，能提高酶切的效率和葡萄糖產(chǎn)量。實驗中共構(gòu)建了4種酶組合方式酶解餐飲垃圾(見表2)。對比分析圖4得知：10 U/g α-淀粉酶在酶組合中不起作用。α-淀粉酶在酶組合中不起作用的原因有兩點：① 餐飲垃圾的預處理問題為主要問題[15-16]。所用餐飲垃圾經(jīng)過機械粉碎和兩次高溫滅菌，淀粉可能經(jīng)過機械以及高溫的作用，直鏈淀粉大部分斷裂，α-淀粉酶的作用不明顯。② 多方面的抑制作用。餐飲垃圾成分復雜，也包括多種化學抑制因子，如糠醛、有機酸等[17-18]，由于α-淀粉酶的酶活力相對比較低，受抑制作用相對較明顯。此外，實驗結(jié)果顯示，120 U/g糖化酶酶解產(chǎn)生的葡萄糖最高產(chǎn)量為115.69 g/L，B的葡萄糖最高產(chǎn)量為130.29 g/L，D的葡萄糖最高產(chǎn)量為126.82 g/L，證明異淀粉酶和糖化酶存在正協(xié)同作用。對比組合A和D，異淀粉酶的加入將葡萄糖產(chǎn)量提升了10%。支鏈淀粉在淀粉結(jié)構(gòu)中起到很強的固定作用，支鏈淀粉的斷裂更有利于淀粉的水解。綜合顯示B為最優(yōu)酶組合。

表2 3種酶的組合方式Table 2 Combined modes of three enzymes

圖4 各種酶組合在72 h內(nèi)酶解餐飲垃圾的葡萄糖產(chǎn)量Fig.4 Glucose production of various mixtures of enzymes on the enzymatic hydrolysis of food waste after 72 h

2.3 餐飲垃圾的SHF和SSF對比研究

利用釀酒酵母CICC 1346作為菌種，采用上述最優(yōu)酶組合進行進一步發(fā)酵研究，結(jié)果如圖5所示。SHF最高的乙醇產(chǎn)量為 45.89 g/L，糖醇轉(zhuǎn)化率達到77.1%；SSF最高乙醇產(chǎn)量為49.48 g/L，糖醇轉(zhuǎn)化率達到91.7%。對比可知，SSF在發(fā)酵效率和乙醇產(chǎn)量上比SHF有明顯優(yōu)勢。

與同類研究對比可以發(fā)現(xiàn)，顏守保等[9]用終酶活力10 U/g α-淀粉酶、120 U/g 糖化酶和釀酒酵母H058菌株對餐飲垃圾進行分步糖化發(fā)酵，糖醇轉(zhuǎn)化率達到91.5%，與本文基本相當，但在其它方面存在許多不足之處。其一，其實驗采用在餐飲垃圾中以1∶1比例添加水的辦法來提高糖化效率，雖然添加水能提高酶和底物的接觸機會，但無形中大大降低了產(chǎn)物含量，對后續(xù)的乙醇蒸餾脫水極為不利。其二，其實驗采用分步糖化發(fā)酵，糖化后還要離心取上清做后續(xù)的乙醇發(fā)酵，操作復雜、物料損失大，也不利于工業(yè)應用。另外，其發(fā)酵時間過長，需要60 h。本研究采用了同步糖化發(fā)酵，因此在操作、發(fā)酵周期、能耗等方面均具有明顯的優(yōu)勢。Jae Hyung Kim等[19]用碳水化合物降解酶(含有阿拉伯糖苷酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、半纖維素酶和木聚糖酶)和釀酒酵母直接對餐飲垃圾進行SHF和SSF發(fā)酵，結(jié)果顯示SHF和SSF的乙醇產(chǎn)率分別為68.85和37.4 g/L，糖醇轉(zhuǎn)化率分別為100%和74%，與本文的結(jié)果正好相反。原因可能是因為韓國的餐飲垃圾中蔬菜類含量占了有機物的50%，含有大量的纖維素、半纖維素等較淀粉更難以降解的多糖分子，因此在SHF中可不受時間限制，最終被碳水化合物降解酶充分降解而獲得很高的糖化率；而在SSF中，由于糖化和發(fā)酵同步進行，纖維素、半纖維素等降解得比淀粉慢，導致糖化速度跟不上發(fā)酵速度，從而限制了整體的發(fā)酵效率[20]?？梢姴惋嬂某煞謪^(qū)別對發(fā)酵效率有很大的影響，要獲得高效的SSF，就一定要充分考慮餐飲垃圾的地域性差異。

圖5 CICC 1346組合300 U/g異淀粉酶+120 U/g糖化酶以SHF和SSF的方式糖化發(fā)酵餐飲垃圾的葡萄糖消耗量和乙醇產(chǎn)量(實心代表葡萄糖消耗量，空心代表乙醇產(chǎn)量)Fig.5 Glucose consumption of glucose (filled diagram) and ethanol production (open diagram) in SHF and SSF by the combination of CICC1346 and 300 U/g isoamylase + 120 U/g glucoamylase

3 結(jié) 論

由上述實驗結(jié)果可知，利用餐飲垃圾進行乙醇發(fā)酵完全不同于傳統(tǒng)的淀粉乙醇發(fā)酵，在傳統(tǒng)發(fā)酵中，α-淀粉酶是必不可少的，而異淀粉酶是不必須的。造成這種差異的最主要因素可能是因為餐飲垃圾中的淀粉與傳統(tǒng)工業(yè)發(fā)酵用的淀粉不同，首先餐飲垃圾中的淀粉由于經(jīng)過了烹飪、滅菌等多道步驟，淀粉已大都降解為糊精，α-淀粉酶的重要性隨之減弱；其次，廣州等南方地區(qū)的主食多為稻米，支鏈淀粉含量高，因此加入支鏈淀粉酶后，降解作用明顯，由此也提示我們利用餐飲垃圾發(fā)酵乙醇，還要針對地方的飲食特色進行調(diào)整，才能獲得最佳的發(fā)酵效果。本文最終獲得了針對廣州地區(qū)餐飲垃圾生產(chǎn)乙醇的SSF方案，發(fā)酵周期僅為24 h，酒精產(chǎn)量為49.48 g/L，糖醇轉(zhuǎn)化率達到91.7%，已具有工業(yè)化應用價值。

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Simultaneous saccharification and fermentation from food waste to ethanol

HUANG Qingmei, KANG Xiaolong, HUANG Qing, XIAO Wenjuan, LI Jingbo, LIN Jianghai, LIU Zehuan

(College of Life Science and Technology, Jinan University, Guangzhou 510632,China)

The purpose of study is to establish a method to improve the ethanol output by saccharification and fermentation of food waste in an order to realize the industrialization in the future. By the way of combining two or three kinds of enzymes to obtain an optimization, it was shown that positive synergism effect was observed between glucoamylase (120 U/g) and isoamylase (300 U/g), and the glucose concentration in the hydrolysate reached 130.29 g/L. Simultaneous saccharification and fermentation (SSF) and separate hydrolysis and fermentation (SHF) of food waste have been conducted usingSaccharomycescerevisiaeCICC 1346 and 120 U/g of glucoamylase and 300 U/g of isoamylase. The yields of ethanol in SSF and SHF were 49.48 and 45.89 g/L, and the conversion rates from glucose to ethanol were 91.7% and 77.1%, respectively. Compared to the SHF process, the SSF one was easier to operate and showed shorter fermentation period but higher ethanol production rate, which makes it more suitable for industrial application.

food waste; isoamylase; SSF; SHF; ethanol

10.13471/j.cnki.acta.snus.2016.05.018

2015-03-18

黃清媚(1989年生)，女；研究方向：生物化學與分子生物學；通訊作者：劉澤寰;E-mail:zhliu@jnu.edu.cn

Q815

A

0529-6579(2016)05-0103-05