陳浩宇　王茜　陳潔

200433　上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院消化內(nèi)科

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·論著·

IL-18及趨化因子CX3CL1在慢性胰腺炎大鼠胰腺纖維化中的表達(dá)及其意義

陳浩宇王茜陳潔

200433上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院消化內(nèi)科

【摘要】目的觀察IL-18及趨化因子CX3CL1在慢性胰腺炎(CP)大鼠胰腺組織中的表達(dá)及其意義。方法雄性Wistar大鼠按分層隨機(jī)法分為對照組和CP組。采取尾靜脈單次注射8 mg/kg體重二丁基二氯化錫(DBTC)造模，對照組注射等容積生理鹽水。4周后處死大鼠，取胰腺組織行病理檢查并評分，采用免疫組化染色法檢測胰腺組織IL-18及CX3CL1蛋白表達(dá)。結(jié)果造模4周后CP組大鼠死亡2只，存活8只，經(jīng)病理學(xué)檢查證實6只大鼠CP造模成功，成功率為60%。CP組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)異常、腺泡萎縮、纖維化、水腫、炎癥細(xì)胞浸潤評分分別為(2.5±0.4)、(1.9±0.8)、(2.2±0.6)、(0.6±0.4)、(1.8±0.6)分；對照組分別為0、0、0、(0.3±0.4)、0分。CP組大鼠胰腺各項評分均顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)。CP組胰腺組織IL-18表達(dá)量為35 670±11 878，較對照組的187±134顯著升高；CX3CL1表達(dá)量為27 416±7 563，亦較對照組的112±598顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)。結(jié)論CP時胰腺組織高表達(dá)IL-18及CX3CL1，兩者可能參與CP纖維化的病理過程。

【關(guān)鍵詞】胰腺炎，慢性；纖維化；白細(xì)胞介素18；趨化因子CX3CL1

慢性胰腺炎(CP)纖維化的過程是機(jī)體分泌多種生物因子激活胰腺星狀細(xì)胞(pancreatic stellate cells, PSC)，進(jìn)而生成大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)沉積在胰腺間質(zhì)中，最終導(dǎo)致無法逆轉(zhuǎn)的病理性纖維化的過程。IL-18和趨化因子CX3CL1作為重要的炎癥因子，參與肝臟、腎臟等重要臟器的病理纖維化過程。胰腺纖維化和肝臟纖維化雖然病因不盡相同，但都以激活PSC為重要病理環(huán)節(jié)，然而目前關(guān)于胰腺纖維化組織IL-18和CX3CL1的表達(dá)鮮有研究報道。本研究檢測CP大鼠胰腺組織中IL-18與CX3CL1的表達(dá)，探討其與CP纖維化的關(guān)系。

材料與方法

一、動物模型制備及分組

雄性Wistar大鼠20只，體重160 g左右，購自第二軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心，清潔環(huán)境飼養(yǎng)2周，體重增至210 g左右。按分層隨機(jī)法將大鼠分為對照組、CP組，每組10只。二丁基二氯化錫(DBTC)購自Sigma公司，先用無水乙醇溶解DBTC，再與甘油以2∶3比例混合，采用經(jīng)大鼠尾靜脈注射DBTC 8 mg/kg體重方法制備大鼠CP模型[1]；對照組注射等容積生理鹽水。注射后禁食、水24 h，然后開放飲食，飼養(yǎng)4周。造模后1、2、3、4周測體重。

二、胰腺組織病理檢查

造模4周后斷頸處死大鼠，取0.3 cm×1 cm的胰腺組織條置于10%甲醛溶液中固定，常規(guī)行組織病理學(xué)檢查。由2位病理學(xué)醫(yī)師讀片，并參考van Westerloo等[2]標(biāo)準(zhǔn)從胰腺結(jié)構(gòu)異常、腺泡萎縮、纖維化、水腫、炎細(xì)胞浸潤5個方面進(jìn)行病理評分。

三、IL-18、CX3CL1蛋白表達(dá)檢測

采用免疫組織化學(xué)染色法檢測IL-18、CX3CL1蛋白表達(dá)，以PBS代替一抗作為陰性對照。兔抗鼠IL-18、CX3CL1多抗均購自Abnova公司，工作濃度均為1∶400；通用型IgG購自DAKO公司，最后DAB顯色、蘇木素襯染、鹽酸乙醇分化、烘片、封片。每張切片分別觀察3個高倍視野(×400倍)。胞核或胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性染色，依據(jù)不同細(xì)胞類型分別進(jìn)行評分。無染色為0分；淺黃色為1分；淺褐色為2分；深褐色為3分。同時隨機(jī)選取10個高倍鏡視野，通過圖像分析軟件(Image-proplus-6，美國)測量視野中淺褐色、深褐色細(xì)胞的總吸光度的平均值(AOD)。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié)果

一、CP大鼠生存率、成功率

造模4周后CP組大鼠死亡2只，存活8只，經(jīng)病理學(xué)檢查證實6只大鼠CP造模成功，成功率為60%。對照組存活率為100%。

二、大鼠體重變化

對照組大鼠1、2、3、4周的體重分別為(218.0±6.1)、(227.3±5.0)、(243.0±8.5)、(265.1±6.0)g；CP組大鼠分別為(190.0±9.0)、(198.1±6.3)、(209.1±8.7)、(218.1±9.9)g。CP組大鼠體重較同時點對照組大鼠顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)。

三、胰腺組織病理變化

CP組大鼠胰腺呈暗黃色，萎縮纖薄，有硬結(jié)形成，未見出血壞死灶，肝臟表面可見彌漫性結(jié)節(jié)，脾大，內(nèi)臟黃染；鏡下見胰腺小葉間及小葉內(nèi)大量纖維組織增生，腺泡壞死、萎縮并呈空泡樣變，大量炎性細(xì)胞浸潤。對照組大鼠胰腺呈白色，質(zhì)軟，肝臟呈暗紅色，質(zhì)軟；鏡下未見異常(圖1)。

圖1　CP組(1A))、對照組(/1B)大鼠胰腺病理變化(HE　×400)

CP組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)異常、腺泡萎縮、纖維化、水腫、炎癥細(xì)胞浸潤評分分別為(2.5±0.4)、(1.9±0.8)、(2.2±0.6)、(0.6±0.4)、(1.8±0.6)分；對照組胰腺病理評分分別為0、0、0、(0.3±0.4)、0分。CP組大鼠胰腺各項評分顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為16.605、6.028、11.619、9.710、7.945，P值均<0.01)。

四、胰腺組織IL-18和CX3CL1蛋白表達(dá)

CP組、對照組大鼠胰腺組織IL-18蛋白表達(dá)的AOD值分別為35 670±11 878、187.3±133.6；CX3CL1的AOD值分別為27 416±7 563、112±597.7。CP組均顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為2.987、3.466，P值均<0.05)。

CP組大鼠胰腺的腺泡細(xì)胞、胰管上皮細(xì)胞、血管上皮細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、胰島細(xì)胞IL-18及CX3CL1蛋白表達(dá)量均顯著高于對照組胰腺組織，兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(表1，圖2、3)。

表1　對照組和CP組胰腺組織各種類型細(xì)胞的IL-18、CX3CL1蛋白表達(dá)(分，

圖2　對照組胰腺組織IL-18(2A，2B)、CX3CL1(2C，2D)蛋白表達(dá)(免疫組化染色　×400)

圖3　CP組胰腺組織IL-18(3A，3B)、CX3CL1(3C，3D)蛋白表達(dá)(免疫組化染色　×400)

討論

IL-18是1995年Okamura等[3]在脂多糖誘導(dǎo)的小鼠中毒性休克肝中提取的，結(jié)構(gòu)及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路類似于IL-1家族，功能上更類似于IL-2家族，具有更強(qiáng)誘導(dǎo)干擾素IFN-γ生成的能力。IL-18主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌，也在其他細(xì)胞、組織廣泛表達(dá)。在生理情況下部分組織，如小腸上皮、肝臟、脾臟、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞等也可結(jié)構(gòu)性表達(dá)IL-18。IL-18最主要的一個生物學(xué)功能是可以誘導(dǎo)Th1細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ[4]。以往研究表明，IL-18與IL-18受體結(jié)合后直接導(dǎo)致IL-1受體相關(guān)激酶(IRAK)磷酸化，進(jìn)而與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF-6)形成復(fù)合物，激活NF-κB進(jìn)入核內(nèi)，與IFN基因啟動子中特定的序列結(jié)合，激活I(lǐng)FN啟動子，進(jìn)而促進(jìn)IFN-γ生成，后者又可促進(jìn)CX3CL1的高表達(dá)[5]。

CX3CL1是化學(xué)趨化因子CX3C亞家族中獨(dú)特成員，存在膜結(jié)合型和分泌型兩種類型，兼有趨化因子和黏附因子功能[6-7]。既往研究認(rèn)為，介導(dǎo)白細(xì)胞遷移的經(jīng)典途徑是整合素依賴性的，即所有趨化因子必須與白細(xì)胞表面特定受體通過G-蛋白依賴機(jī)制促黏附因子整合素活化才能進(jìn)一步引起白細(xì)胞的黏附和遷移[8]。CX3CL1的趨化因子區(qū)域表達(dá)在細(xì)胞膜外黏蛋白樣結(jié)構(gòu)頂部，因它本身就是一種黏附因子，不依賴整合素即可發(fā)揮黏附作用。CX3CL1與CX3CR1結(jié)合可以增強(qiáng)細(xì)胞黏附，促進(jìn)白細(xì)胞透過血管壁向炎癥部位遷移。在炎性部位的CX3CL1能誘導(dǎo)活化NK細(xì)胞，導(dǎo)致臨近的內(nèi)皮細(xì)胞裂解，并促進(jìn)被捕獲的血中CX3CR1陽性細(xì)胞向組織內(nèi)轉(zhuǎn)移，發(fā)揮其黏附和遷移作用[9]。 膜結(jié)合型CX3CL1在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的表達(dá)可以被TNF-β、IL-21、IFN-γ等炎性因子上調(diào)，且IFN-γ、TNF-β能協(xié)同誘導(dǎo)趨化因子Fractalkine(FKN)的高表達(dá)[6-7]。

田軼倫等[10]探討不同濃度IL-18對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞FKN表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)25 μg/L是IL-18調(diào)節(jié)CX3CL1表達(dá)的有效起始濃度，并呈濃度依賴性上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞CX3CL1的表達(dá)，隨著IL-18濃度的升高，內(nèi)皮細(xì)胞對單核細(xì)胞趨化作用亦相應(yīng)增強(qiáng)，而使用CX3CL1中和抗體后單核細(xì)胞遷移的數(shù)量明顯下降，提示IL-18上調(diào)CX3CL1表達(dá)后能夠通過其介導(dǎo)的趨化作用參與炎癥反應(yīng)。王麗敏等[11]在研究阿霉素腎病大鼠時發(fā)現(xiàn)，IL-18結(jié)合蛋白能特異性結(jié)合IL-18，通過降低IFN-γ進(jìn)而抑制IL-18活性及腎臟纖維化組織中腎血管內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞CX3CL1的表達(dá)水平。Aoyama等[12]研究發(fā)現(xiàn)，CX3CL1通過抑制肝臟Kupffer細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活化進(jìn)而抑制肝臟纖維化，且CX3CL1特異性受體是丙型肝炎纖維化的一個高度易感因素[13]。雖然CP和慢性肝炎病因有別，但兩者纖維化發(fā)生和發(fā)展過程有著眾多相同之處。

本研究結(jié)果顯示，CP組胰腺組織IL-18和CX3CL1表達(dá)量均顯著高于對照組，CP大鼠胰腺中的腺泡細(xì)胞、胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、胰島細(xì)胞內(nèi)均有IL-18、CX3CL1的表達(dá)，因此可以推測，IL-18和CX3CL1參與了CP纖維化的病理過程。

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(本文編輯：屠振興)

IL-18 and CX3CL1 expression and function in the fibrosis of chronic pancreatitis rat

ChenHaoyu,ShenXiangguo,LiZhaoshen,XuCan.DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai, 200433China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression of IL-18 and CX3CL1 in the tissue of chronic pancreatitis (CP) rat and explore its clinical value. MethodsMale Wistar rats were randomly divided into control group and CP group. CP was induced by dibutyltindich loride (8 mg/kg) injecsion into the tail vein and control group was given equal volume saline solution. The rats were sacrificed 4 weeks later. Pancreatic tissue was harvested for histological examination and immunohistochemical method was used to detected the expression of IL-18 and CX3CL. ResultsAt 4 weeks, 2 in CP group died and 8 survived. 6 rats were histological confirmed as CP and the success rate of mice model was 60%. The score for abnormal structure, acinar atrophy, fibrosis, edema, and inflammatory cells infiltration in rats of CP group was(2.5±0.4),(1.9±0.8),(2.2±0.6),(0.6±0.4),(1.8±0.6)in CP group, but 0, 0, 0,(0.3±0.4), 0 in control group. All the scores were greatly increased compared with controls. IL-18 level in pancreatic tissue was 35 670±11 878 in CP group, which was significantly enhanced compared with (187.3±133.6) in control group (P<0.05). CX3CL1 level was (27 416±7 563) in CP group, which was significantly increased compared with (112±598) in control group (P<0.05). ConclusionsIL-18 and CX3CL1 were over-expressed in pancreatic tissue of CP rats, which may participate in the pathogenesis of pancreatic fibrosis.

【Key words】Pancreatitis, chronic;Fibrosis;Interleukin-18;Chemokine CX3CL1

(收稿日期：2016-02-01)

Corresponding author:Chen Jie, Email: jiechen0115@sohu.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金(81300352)

通信作者：陳潔，Email: jiechen0115@sohu.com

DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.02.009

Fund program：National Natural Sceince Foundation of China(81300352)