賈 琳, 王西賢, 張海霞, 覃小紅,2

(1. 河南工程學(xué)院 河南省服用紡織品工程技術(shù)研究中心， 河南 鄭州 450007； 2. 東華大學(xué) 紡織學(xué)院， 上海 201620)

聚乳酸/膠原蛋白取向納米纖維支架的性能

賈 琳1, 王西賢1, 張海霞1, 覃小紅1,2

(1. 河南工程學(xué)院 河南省服用紡織品工程技術(shù)研究中心， 河南 鄭州 450007； 2. 東華大學(xué) 紡織學(xué)院， 上海 201620)

為研究取向納米纖維的性能及取向納米纖維對(duì)細(xì)胞生長的引導(dǎo)作用，利用可降解的聚乳酸和膠原蛋白為原料，通過靜電紡絲方法制備了隨機(jī)和取向排列的聚乳酸(PLLA)、聚乳酸/膠原蛋白(PLLA/Coll)納米纖維支架材料。利用掃描電鏡、紅外光譜儀等研究了納米纖維的形態(tài)結(jié)構(gòu)、化學(xué)性能和力學(xué)性能等，并在其表面培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，研究細(xì)胞在不同的支架表面的生長形態(tài)。結(jié)果表明：取向納米纖維具有較細(xì)的纖維直徑，各向異性的結(jié)構(gòu)性能，平行于纖維排列方向的潤濕性能和優(yōu)于垂直于纖維排列方向的斷裂強(qiáng)度。復(fù)合PLLA/Coll支架表面含有細(xì)胞識(shí)別基團(tuán)，能增強(qiáng)細(xì)胞的黏附和增殖，培養(yǎng)在取向PLLA/Coll納米纖維支架上的MSCs呈現(xiàn)取向的紡錐形態(tài)，與體內(nèi)MSCs的形態(tài)更類似。

取向納米纖維； 膠原蛋白； 支架材料； 力學(xué)性能； 細(xì)胞取向

靜電紡絲是制備納米纖維最有效、最簡便的方法之一。靜電紡納米纖維因其較大的比表面積和較高的孔隙率，被越來越多的研究者應(yīng)用到不同領(lǐng)域，包括過濾材料、組織工程、藥物緩釋系統(tǒng)等。然而，傳統(tǒng)的靜電紡納米纖維呈現(xiàn)雜亂無序的排列狀態(tài)，力學(xué)強(qiáng)度較差，一定程度上限制了納米纖維的應(yīng)用。而取向排列的納米纖維不僅具有較高的力學(xué)強(qiáng)度，其各向異性的微觀結(jié)構(gòu)與人體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)更類似，可以引導(dǎo)細(xì)胞的取向生長和定向遷移，是更好的組織工程支架材料。Xu等[1]曾經(jīng)利用旋轉(zhuǎn)的收集裝置制備了取向排列的聚丙交酯-己內(nèi)酯(PLCL)納米纖維，并在其表面培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞，結(jié)果表明平滑肌細(xì)胞具有延伸的形態(tài)結(jié)構(gòu)，與體內(nèi)的細(xì)胞形態(tài)更類似。Gupta等[2]在取向排列的聚己內(nèi)酯(PCL)/明膠納米纖維表面培養(yǎng)神經(jīng)雪旺細(xì)胞，結(jié)果表明取向的納米纖維可以引導(dǎo)細(xì)胞的取向生長。

由于合成的生物高分子材料價(jià)格便宜，力學(xué)強(qiáng)度高，生物毒性小，近年來，利用靜電紡絲方法，許多生物高分子納米纖維支架材料被應(yīng)用到組織工程中。聚乳酸(PLLA)具有較好的力學(xué)性能及生物相容性和生物降解性，是應(yīng)用最多的組織工程支架材料[3-4]，但是，PLLA本身缺少一些細(xì)胞識(shí)別的功能基團(tuán)，如氨基和羧基，單獨(dú)作為支架材料時(shí)不利于細(xì)胞的增殖和生長；而膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，是人體含量最多的蛋白，具有無免疫原性，低抗原性，較高的親水性和細(xì)胞相容性[5-6]。因此，本文將膠原蛋白加入到PLLA溶液中，通過靜電紡絲方法制備隨機(jī)和取向排列的聚乳酸/膠原蛋白(PLLA/Coll)納米纖維，分析比較納米纖維的微觀形貌，親水性，化學(xué)性能和力學(xué)性能，并在其表面培養(yǎng)細(xì)胞，研究取向納米纖維引導(dǎo)細(xì)胞取向生長的作用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要材料與儀器

聚乳酸(相對(duì)分子質(zhì)量為30 000)，I型膠原蛋白，六氟異丙醇(HFIP)，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)。

CO2恒溫培養(yǎng)箱，F(xiàn)EI- QUANTA 200 F型掃描電子顯微鏡(SEM)，滲透孔隙率儀，水接觸角測試儀，傅里葉紅外光譜分析儀，Instron5345型拉伸試驗(yàn)機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 納米纖維支架的制備

稱取一定質(zhì)量的PLLA并置于5mL的藍(lán)口瓶中，然后加入一定比例的HFIP溶劑，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的PLLA溶液，在室溫條件下放在磁力攪拌器上攪拌24 h后待用，攪拌速度為500 r/min。按質(zhì)量比為3∶1、1∶1的比例稱取一定量的PLLA和膠原蛋白，加入HFIE溶劑，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的PLLA/Coll溶液，混合攪拌24 h后待用。

用3 mL的注射器抽取聚合物溶液并放置在注射泵上控制溶液的流速，紡絲液流速為1.0 mL/h；將注射器針頭接正極高壓并調(diào)節(jié)紡絲電壓為15 kV，接收距離為12 cm。利用接地的鋁箔接收隨機(jī)排列的納米纖維(將制備的隨機(jī)排列的純PLLA、質(zhì)量比為3∶1和1∶1的混合PLLA/Coll膜分別編號(hào)為1#～3#)，利用旋轉(zhuǎn)的滾軸收集取向納米纖維(將制備的取向排列的純PLLA、質(zhì)量比為3∶1和1∶1的混合PLLA/Coll膜分別編號(hào)為4#～ 6#)，旋轉(zhuǎn)速度是2 000 r/min。將納米纖維噴射到直徑為15 cm的蓋玻片上作為組織工程支架材料來培養(yǎng)細(xì)胞。

1.2.2 納米纖維支架微觀形貌觀察

將納米纖維進(jìn)行噴金處理，利用掃描電鏡觀察隨機(jī)排列和取向排列的納米纖維的形態(tài)特征，隨后利用ImageJ軟件在納米纖維的SEM照片中隨機(jī)選取50根納米纖維測試?yán)w維直徑并求取平均值。

1.2.3 納米纖維支架孔隙率測試

將從鋁箔上剝離的納米纖維膜裁剪成30 mm×30 mm的樣品，在低氣壓下，利用毛細(xì)管滲透孔隙率儀測量隨機(jī)排列和取向排列納米纖維的平均孔隙直徑。

1.2.4 納米纖維支架親水性測試

利用水接觸角測試儀測試隨機(jī)排列和取向排列的納米纖維的親水性。將納米纖維膜放置在測試板上，將去離子水滴在納米纖維支架表面，每個(gè)樣品測試5個(gè)不同位置的水接觸角取其平均值。對(duì)于取向納米纖維，沿平行于和垂直于纖維排列方向分別測試支架材料的水接觸角。

1.2.5 納米纖維支架紅外光譜分析

將納米纖維膜從鋁箔上剝離下來直接在紅外光譜分析儀上分析，紅外光譜的波數(shù)范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為2 cm-1。

1.2.6 納米纖維支架力學(xué)性能測試

利用樣品框架將納米纖維支架裁剪成尺寸為10 mm×20 mm的樣品，使用拉伸試驗(yàn)機(jī)對(duì)樣品進(jìn)行機(jī)械拉伸性能測試，拉伸力為10 N，拉伸速度為10 mm/min，最后根據(jù)應(yīng)力-應(yīng)變曲線計(jì)算樣品的拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長率。對(duì)于取向納米纖維，沿平行(PL表示)于和垂直(PP表示)于纖維排列方向分別測試支架材料的拉伸性能。

1.2.7 細(xì)胞形貌表征

將覆蓋有隨機(jī)排列和取向排列的PLLA、PLLA/Coll納米纖維的蓋玻片置于24孔板底部，利用紫外線對(duì)樣品照射2 h進(jìn)行消毒。在不同納米纖維表面培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，密度是每孔8 000個(gè)細(xì)胞。然后將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境37 ℃，5%CO2)，每隔2 d換1次培養(yǎng)液，10 d后取出，用PBS緩沖液(pH=7.4)清洗殘余的培養(yǎng)液，并用3%的戊二醛對(duì)細(xì)胞固定3 h，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%、70%、90%、100%的乙醇溶液分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行脫水處理，每種溶液脫水10 min。最后，將樣品放置在通風(fēng)櫥中，使水分充分揮發(fā)，放置在掃描電子顯微鏡下觀察細(xì)胞的結(jié)構(gòu)形態(tài)。

2 結(jié)果分析

2.1 納米纖維支架的微觀形貌

隨機(jī)排列和取向排列的PLLA、PLLA/Coll納米纖維掃描電子顯微鏡照片如圖1所示。由圖中可以觀察到光滑無串珠且均勻分布的納米纖維，隨機(jī)排列的納米纖維顯示了雜亂無序的排列狀態(tài)，而取向排列的納米纖維顯示了取向的排列狀態(tài)。隨機(jī)排列的1#、2#、3#納米纖維的直徑分別為(430±90)nm，(270±120)nm和(210±160)nm，而取向排列的4#、5#、6#納米纖維的直徑分別為(415±105)nm,(257±115)nm和(198±145)nm?？梢钥闯?，無論是純PLLA還是復(fù)合的PLLA/Coll納米纖維，取向納米纖維的直徑略小于隨機(jī)排列的納米纖維，這主要是由于高速旋轉(zhuǎn)的滾軸在滾筒表面產(chǎn)生的拉伸力使納米纖維得到進(jìn)一步拉伸，所以取向納米纖維直徑較小。Kai等利用高速旋轉(zhuǎn)的圓盤制備了取向排列的PCL和PCL/明膠納米纖維，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對(duì)于普通的納米纖維，取向排列的納米纖維直徑較小，本文的結(jié)果與文獻(xiàn)[7]相似。

無論納米纖維的排列方式如何，相對(duì)于純PLLA納米纖維，膠原蛋白的加入有效地減小了復(fù)合PLLA/Coll納米纖維的直徑。這主要是由于膠原蛋白的加入增加了PLLA/Coll溶液的導(dǎo)電性，膠原蛋白是兩性電解質(zhì)，在有機(jī)溶液內(nèi)能解離產(chǎn)生正電荷或負(fù)電荷，增加溶液的電導(dǎo)率，所以PLLA/Coll復(fù)合納米纖維的直徑較小[8]。對(duì)比取向PLLA和PLLA/Coll納米纖維的取向排列程度，可以發(fā)現(xiàn)PLLA納米纖維的取向排列程度高于PLLA/Coll納米纖維，Schnell等[9]制備了取向的PCL和PCL/Coll納米纖維，得到了類似的結(jié)果，并分析原因是膠原蛋白的加入降低了溶液的黏度，使納米纖維取向度降低。

2.2 納米纖維支架的孔隙率

納米纖維的孔隙率和孔隙直徑對(duì)納米纖維的應(yīng)用有很大的影響，特別是在組織工程、過濾材料和藥物釋放等方面。有研究表明，纖維膜厚度和纖維直徑對(duì)納米纖維膜的孔隙直徑有較大的影響[10]，當(dāng)纖維膜厚度一定時(shí)，孔隙直徑與纖維直徑成正比例關(guān)系。本文納米纖維膜的厚度約為35 μm，隨機(jī)排列和取向排列的納米纖維的孔隙直徑見表1所示。隨著膠原蛋白的加入，纖維直徑減小，孔隙直徑也隨之減小。另一方面，相對(duì)于隨機(jī)排列的納米纖維，取向排列的納米纖維具有較小的纖維直徑，但其孔隙直徑卻較大，這主要是因?yàn)槿∠蚣{米纖維呈現(xiàn)單一方面的排列狀態(tài)，孔隙直徑呈階梯狀分布，孔隙直徑分布不均勻，孔隙率較差，因此平均孔隙直徑較大。Meng等[11]制備了隨機(jī)排列和取向排列的聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)/明膠納米纖維，取向排列的納米纖維具有較小的孔徑和較大的孔隙率。

2.3 納米纖維支架的親水性能

納米纖維支架材料的親水性影響其表面能，并進(jìn)一步影響血清蛋白的黏附，對(duì)細(xì)胞在其表面的黏附和增殖有很大的影響，利用水接觸角來描述支架材料的親水性能，水接觸角越大，親水性越差，反之亦然。由表1可見納米纖維支架的水接觸角，純PLLA納米纖維的水接觸角為133.4°，親水性非常差，不利于細(xì)胞的黏附生長；而復(fù)合PLLA/Coll納米纖維具有非常好的親水性，其水接觸角為34.2°和42.3°，且親水性隨著膠原蛋白含量的增加而提高，有利于MSCs在其表面的黏附和增殖。另一方面，取向的PLLA和PLLA/Coll納米纖維表現(xiàn)了各向異性的潤濕性能，垂直于纖維排列方向的水接觸角大于平行于纖維排列方向的水接觸角，這主要是由于當(dāng)液滴沿垂直方向流動(dòng)時(shí)，由于纖維微觀溝槽所形成的能量位壘，阻止液滴在該方向的延伸流動(dòng)，因此水接觸角較高，潤濕性略差[12]。反之，在當(dāng)水滴沿平行方向流動(dòng)時(shí)，因?yàn)椴淮嬖诶w維微觀溝槽形成的位壘阻力，液滴流動(dòng)較快，水接觸角較小，潤濕性較好。總之，膠原蛋白的加入有效地提高了納米纖維的親水性，有利于細(xì)胞的黏附生長；另外，取向納米纖維直徑材料表現(xiàn)了各向異性的潤濕性能，將引導(dǎo)細(xì)胞的取向排列和生長。

表1 納米纖維的直徑和親水性能Tab.1 Diameter and hydrophility of nanofibers

2.4 納米纖維支架的紅外光譜分析

2.5 納米纖維的力學(xué)性能

除了微觀形態(tài)和化學(xué)性能，納米纖維支架材料的拉伸性能也是其在組織工程應(yīng)用的一個(gè)關(guān)鍵因素。圖3示出隨機(jī)排列和取向排列納米纖維支架材料的拉伸曲線。

對(duì)于隨機(jī)排列的納米纖維支架，當(dāng)受到持續(xù)的拉伸作用時(shí)，由于雜亂交錯(cuò)的排列狀態(tài)，纖維之間會(huì)沿拉伸方向滑動(dòng)，其斷裂強(qiáng)度呈先線性增加再非線性增加的趨勢。比較圖中1#、2#、3#號(hào)試樣的拉伸曲線，發(fā)現(xiàn)復(fù)合的PLLA/Coll納米纖維支架具有較高的斷裂強(qiáng)度，但其斷裂伸長率小于純PLLA納米纖維。比較圖3(b)、(c)中4#、5#、6#號(hào)試樣的拉伸曲線可知，雖然4#試樣取向PLLA具有較大的斷裂伸長率，但5#試樣取向PLLA/Coll(3∶1)具有最大的拉伸強(qiáng)度。由此可知，PLLA納米纖維支架具有較高的斷裂拉伸率，但其斷裂強(qiáng)度較小，拉伸模量較大，不能承受較高的生理壓力，不適宜單獨(dú)作為組織工程支架材料；而膠原蛋白的加入會(huì)降低PLLA/Coll納米纖維膜的拉伸模量，提高其斷裂強(qiáng)度，而且膠原蛋白內(nèi)部含有細(xì)胞識(shí)別的基團(tuán)，因此更適宜做組織工程支架材料。由圖3還可知，取向的納米纖維支架具有各向異性的拉伸性能，沿纖維平行方向的拉伸強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于隨機(jī)排列的納米纖維膜的拉伸強(qiáng)度和纖維垂直方向的拉伸強(qiáng)度，且由于取向納米纖維中纖維單一方向的排列狀態(tài)，隨機(jī)排列的納米纖維膜的拉伸強(qiáng)度處于纖維垂直方向的拉伸強(qiáng)度與纖維平行方向的拉伸強(qiáng)度之間。由于納米纖維沿單一方向排列，當(dāng)取向納米纖維膜受到平行于纖維方向的作用力時(shí)，纖維之間沿該方向的拉伸滑動(dòng)減小，所以其斷裂伸長率最小。

2.6 體外生物相容性

納米纖維的取向排列狀態(tài)對(duì)其表面的細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞黏附等有很大的影響。圖4示出不同納米纖維支架表面MSCs的SEM照片。由圖可明顯看出，無論納米纖維形態(tài)如何，復(fù)合PLLA/Coll支架表面的細(xì)胞數(shù)目均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于純PLLA支架，這主要是由于PLLA/Coll支架表面存在細(xì)胞識(shí)別基團(tuán)氨基和酰胺基，增加了細(xì)胞在其表面的黏附生長。隨機(jī)排列的PLLA和PLLA/Coll納米纖維表面的MSCs呈現(xiàn)隨機(jī)的排列狀態(tài)，且細(xì)胞呈寬扁的多邊形狀態(tài)；而培養(yǎng)在取向納米纖維表面的MSCs呈現(xiàn)取向的排列狀態(tài)，沿纖維方向取向生長，且細(xì)胞呈細(xì)長的、被拉伸的紡錐形態(tài)(見圖中白色箭頭)，與體內(nèi)MSCs的形態(tài)更類似，說明取向納米纖維通過表面微觀形態(tài)的接觸引導(dǎo)作用、各向異性的潤濕性能引導(dǎo)細(xì)胞的取向生長和定向排列。另一方面，比較取向的PLLA和PLLA/Coll納米纖維表面的細(xì)胞形態(tài)可以發(fā)現(xiàn)，盡管取向PLLA納米纖維的取向排列程度更好，但是取向PLLA/Coll表面的MSCs的取向排列程度卻高于取向PLLA表面的MSCs，表明膠原蛋白的存在不僅可以有效地增加MSCs在其表面的黏附增殖，還可以增加MSCs的取向排列程度，該結(jié)果表明不僅支架材料的物理結(jié)構(gòu)形態(tài)可以改變細(xì)胞的生長行為，支架材料的化學(xué)組成也會(huì)影響細(xì)胞的黏附和生長等行為。

3 結(jié) 論

本文利用靜電紡絲方法成功制備了隨機(jī)和取向排列的PLLA、PLLA/Coll納米纖維，由于旋轉(zhuǎn)滾筒產(chǎn)生的拉伸力，取向納米纖維的直徑略低于隨機(jī)排列的納米纖維，膠原蛋白的加入有效地降低了復(fù)合PLLA/Coll納米纖維支架的纖維直徑和孔隙直徑，提高其親水性，提高了其拉伸強(qiáng)度。取向納米纖維具有各向異性的潤濕性能和機(jī)械拉伸強(qiáng)度，其平行于纖維排列方向的潤濕性能和斷裂強(qiáng)度都大于垂直于纖維排列方向。膠原蛋白的加入有效地提高了MSCs的黏附生長，由于微觀形態(tài)和化學(xué)組成2個(gè)方面的接觸引導(dǎo)作用，培養(yǎng)在取向PLLA/Coll納米纖維支架的MSCs沿纖維方向取向生長，且顯示細(xì)長的、被拉伸的紡錐形態(tài)，與體內(nèi)MSCs的形態(tài)更類似。

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Performance of aligned polylactic acid/collagen nanofibrous scaffolds

JIA Lin1, WANG Xixian1, ZHANG Haixia1, QIN Xiaohong1,2

(1. Henan Clothing Textiles Engineering Research Center, Henan University of Engineering, Zhengzhou, Henan 450007, China; 2. College of Textiles, Donghua University, Shanghai 201620, China)

Biodegradable polylactic acid (PLLA) and collagen were chosen as raw materials. PLLA and polylactic acid/collagen (PLLA/Coll) nanofibrous scaffolds with different morphologies (randomness and alignment) were prepared by electrospinning to study the properties and the guiding function of aligned nanofiber for the cell growing. Firstly, the morphologies, chemical and mechanical characterizations of different nanofibrous scaffolds were carried out. Then mesenchymal stem cells (MSCs) were cultured and the attachment and proliferation of cells on different scaffolds were evaluated. The results show that aligned nanofibers possess thinner fiber diameter,anisotropic morphology and performance, and the wettability and mechanical properties in parallel direction are better than those in perpendicular direction. Composite PLLA/Coll scaffolds have cell-recognition moieties, which can improve the attachment and proliferation of cells. Hence, MSCs cultured on aligned PLLA/Coll scaffolds express aligned spindle phenotype, more similar to the phenotype of native MSCs.

aligned nanofiber; collagen; scaffold material; mechanical performance; cell orientation

10.13475/j.fzxb.20160102506

2016-01-20

2016-06-19

河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃(13IRTSTHN024，15IRTSTHN011)；河南省高校重點(diǎn)科研項(xiàng)目(15A540001)；河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(152102210301)；河南工程學(xué)院博士基金項(xiàng)目(D2014025)

賈琳(1986—)，女，講師，博士。主要研究方向?yàn)殪o電紡納米纖維的制備及應(yīng)用。E-mail：lynnjia0328@163.com。

TS 102.6

A