張秋墨 金丹

【摘要】目的：構(gòu)建能夠?qū)π∈蠓闻茛蛐蜕掀ぜ?xì)胞進(jìn)行分離、原代培養(yǎng)與鑒定的方法，從而對(duì)建立穩(wěn)定高效的細(xì)胞膜性起到積極的促進(jìn)作用。方法：（1）使用低濃度胰酶聯(lián)合Ⅰ型膠原酶消化法，對(duì)小鼠的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞進(jìn)行分離；（2）經(jīng)差速離心差速貼壁和免疫黏附法對(duì)Ⅱ型上皮細(xì)胞進(jìn)行純化及原代培養(yǎng)。并倒置顯微鏡對(duì)細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)狀況進(jìn)行觀察，測(cè)定肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的產(chǎn)量、活力以及純度。對(duì)肺泡表面活性蛋白A和C的表達(dá)進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定，使用透射電鏡對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的特異性細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。結(jié)果：每只小鼠所獲得的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞數(shù)量為 ，純度為 ，細(xì)胞活力為 。且原代肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞在對(duì)倒置顯微鏡下為立方形或圓形，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在許多差別非常明顯的細(xì)小顆粒，生長(zhǎng)方式為島狀；在免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定方面，肺泡表面的活性蛋白A為棕黃色，C為綠色，二者都定位表達(dá)于細(xì)胞漿；透射電鏡可見(jiàn)特征性板層小體及細(xì)胞游離面大量微絨毛。結(jié)論：胰酶聯(lián)合膠原酶消化，差速離心差速貼壁和免疫黏附純化法能夠獲得產(chǎn)量和純度都具有優(yōu)勢(shì)的AECⅡ，符合一般的體外實(shí)驗(yàn)的要求。

【關(guān)鍵詞】原代分離；小鼠；肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞；方法；模型

1材料和方法

1.1材料

設(shè)計(jì)：?jiǎn)我粯颖居^察。

地點(diǎn)：XX大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室。

材料：健康清潔的小鼠6只，雌雄均為3只，體重19～23g。在實(shí)驗(yàn)中對(duì)動(dòng)物的處置符合國(guó)家《關(guān)于善待動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》中的相關(guān)規(guī)定。

試劑及儀器主要包括DEME培養(yǎng)基、 青霉素、 鏈霉素、Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶等等以及兔抗鼠SP-A-抗、SP-C-抗、多聚賴(lài)氨酸、SABC試劑盒、DAB試劑盒、高速臺(tái)式離心機(jī)、 培養(yǎng)箱以及倒置顯微鏡和透射電鏡等等。

1.2方法

小鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞分離：將小鼠脫頸處死，盡快取下肺組織并洗干凈；將其剪成小塊；放入10mL的離心管，以2mL/只小鼠的標(biāo)準(zhǔn)加入1g/L胰蛋白酶。將吸管吹打均勻后在37℃的溫度孵育5min，將消化好的細(xì)胞懸液移除，并加入與之等量的含10%胎牛血清的DEME中止消化；使用同法用1g/L胰蛋白酶對(duì)肺組織進(jìn)行5mim的消化，將消化好的細(xì)胞懸液移除并中止消化；在剩余肺組織中，按上述標(biāo)準(zhǔn)加入Ⅰ型膠原酶，孵育15min，移除細(xì)胞懸液，加入同上的胎牛血清，中止消化；吸管混勻后用過(guò)濾、離心、去上清，用DEME重懸沉淀。

小鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞純化與培養(yǎng)：將肺細(xì)胞懸液接種入包被小鼠1gG的培養(yǎng)皿中，并孵育，吸出含未黏附細(xì)胞的液體接種于另一包被小鼠的1gG培養(yǎng)皿中，同法繼續(xù)孵育2次，并使用胎牛血清重懸沉淀，并接種于培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板中，24h后換液，此時(shí)貼壁的即為Ⅱ型上皮細(xì)胞。

小鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的鑒定：將其置于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，并使用多聚賴(lài)氨酸浸泡，吸出多聚賴(lài)氨酸后徹底吹干。對(duì)純化后的肺細(xì)胞懸液濃度進(jìn)行調(diào)整并接種于蓋玻片，并加入SP-A-抗及SP-C-抗，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)操作，然后置于倒置顯微鏡下觀察。

2結(jié)果

在AECⅡ的產(chǎn)量、純度及活力方面，每只小鼠的平均值分別為 、 、 。

倒置顯微鏡下，免疫黏附純化后的AECⅡ在接種后的12～18h開(kāi)始伸展貼壁，形狀為圓形活力放心，且有小顆粒，胞核明顯。24h后逐漸融合。48h之內(nèi)為多邊形，72h后顆粒減少。六七天后無(wú)法辨認(rèn)Ⅱ型細(xì)胞形態(tài)。而免疫黏附細(xì)胞48h后大量纖維細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈不規(guī)則三角形或梭形。

透射電鏡下，小鼠AECⅡ呈圓形或立方形，胞質(zhì)內(nèi)有小泡，細(xì)胞游離面見(jiàn)大量微絨毛。其中圖1為倒置顯微鏡下原代培養(yǎng)的小鼠AECⅡ。

3討論

就目前的技術(shù)來(lái)說(shuō)，從肺組織中將AECⅡ分離出來(lái)最常用的方法是酶消化法。常用的消化酶有胰蛋白酶、彈性蛋白酶和膠原酶等。本次研究中使用的是胰蛋白酶聯(lián)合Ⅰ型膠原酶的方式，而且降低了胰蛋白酶的消化濃度和時(shí)間。使用這種方式的目的，一是為了降低胰蛋白酶對(duì)肺泡上皮細(xì)胞的損傷，二是為了保證AECⅡ獲取的數(shù)量。膠原酶能夠?qū)?xì)胞基質(zhì)起到消化作用，但對(duì)上皮細(xì)胞的影響不大。在細(xì)胞分離的過(guò)程當(dāng)中，因?yàn)槊笗?huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定的損害，細(xì)胞釋放出DNA，并與細(xì)胞外基質(zhì)形成DNA蛋白復(fù)合物，從而將細(xì)胞聚集起來(lái)。因此，為了使細(xì)胞無(wú)法聚集成團(tuán)，經(jīng)常使用脫氧核糖核酸酶進(jìn)行控制。在本次研究中，整個(gè)分離過(guò)程也都存在脫氧核糖核酸。而且，提高細(xì)胞活性的條件還包括保持低溫、縮短細(xì)胞分離的時(shí)間。

肺組織中的細(xì)胞較多，經(jīng)過(guò)酶消化后得到的細(xì)胞懸液中包括AECⅡ、纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等等。這樣的AECⅡ是不符合實(shí)驗(yàn)研究的需要的，必須對(duì)其進(jìn)行純化。AECⅡ純化方法種類(lèi)較多，例如免疫黏附選擇、密度梯度離心法、單克隆抗體技術(shù)、貼壁選擇以及流式細(xì)胞儀篩選等等。每種方式均有自身的優(yōu)缺點(diǎn)，但部分方法的操作過(guò)程較為復(fù)雜，而且結(jié)果并不是很理想，細(xì)胞的數(shù)量較少，也容易受損。而使用差速離心差速貼壁和免疫黏附法對(duì)其進(jìn)行純化，所得到的產(chǎn)量、純度、活力等均較高。本次研究中分別達(dá)到了 、 、 。

AECⅡ的鑒定主要是通過(guò)自身的形態(tài)及特異性來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)標(biāo)志物的表達(dá)。AECⅡ特異表達(dá)的物質(zhì)較多，例如SP-A、SP-B、SP-C等等。完全分化的AECⅡ最具代表性的表型是表達(dá)表面活性蛋白。在AECⅡ中，SP-A的含量最多，特異性及敏感性較高，檢出比較容易，因此是對(duì)免疫細(xì)胞進(jìn)行化學(xué)鑒定的一種新方式。而SP-C是僅在AECⅡ上表達(dá)的唯一活性蛋白，因此也可使用它來(lái)進(jìn)行AECⅡ的鑒定。在本次研究中，同時(shí)使用了SP-A和SP-C進(jìn)行鑒定，相互之間取長(zhǎng)補(bǔ)短，使得鑒定結(jié)果的可靠性增加，而且在20h就能完成，使得鑒定時(shí)間縮短。

結(jié)束語(yǔ)：

綜上所述，胰酶聯(lián)合膠原酶消化，差速離心差速貼壁和免疫黏附純化法能夠獲得產(chǎn)量和純度都具有優(yōu)勢(shì)的AECⅡ，符合一般的體外實(shí)驗(yàn)的要求。

【參考文獻(xiàn)】

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