張莉娟　張無敵　尹芳　趙興玲　王昌梅　柳靜　楊紅　劉士清

摘要：以紫花苜蓿（Medicago sativa）為原料，分別加入30%、40%、50%的接種物，在常溫下（20～22℃）、總固體（TS）含量為6%（以30%接種量計算）的條件下進行厭氧發(fā)酵，考察接種量對紫花苜蓿發(fā)酵的日產(chǎn)氣量、pH、產(chǎn)氣速率的影響。結(jié)果表明，接種量為40%時的產(chǎn)氣效果良好，總產(chǎn)氣量為3 625 mL，比接種量為30%的試驗組高8.05%，略低于接種量為50%的試驗組。試驗初期，pH出現(xiàn)一定下降，但很快又恢復(fù)至合適水平，整個階段pH比較穩(wěn)定。綜合考慮，對于紫花苜蓿發(fā)酵，40%的接種量較優(yōu)。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿（Medicago sativa）；常溫厭氧發(fā)酵；接種物；接種量；產(chǎn)氣潛力

紫花苜蓿（Medicago sativa）簡稱苜蓿，是豆科苜蓿屬多年生草本植物，是世界上分布最廣的豆科牧草，也是中國種植面積最大的人工牧草，達到210萬hm²，在世界苜蓿生產(chǎn)大國中占第5位。紫花苜蓿作為品質(zhì)優(yōu)、產(chǎn)量高、適口性好的牧草飼料為全球畜牧業(yè)做出重大貢獻，并且長期種植苜蓿有改良土壤的作用，因此紫花苜蓿在中國生態(tài)建設(shè)中也有重要作用。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，人們對紫花苜蓿的傳統(tǒng)利用從優(yōu)質(zhì)牧草擴展到其他方面，其中以苜蓿作為生物反應(yīng)器來生產(chǎn)疫苗、工業(yè)酶制劑和工業(yè)可降解塑料以及一些重要的藥用蛋白等研究已經(jīng)取得了很大進展。

前期探究了紫花苜蓿中溫條件下厭氧發(fā)酵的產(chǎn)氣潛力，為進一步實現(xiàn)紫花苜蓿資源化利用，提高其能源轉(zhuǎn)化效率，本研究欲摸索在實驗室水平上接種物濃度對紫花苜蓿反應(yīng)啟動、產(chǎn)氣量及產(chǎn)氣速率的影響。通過選擇適宜的接種物濃度，以期達到啟動平穩(wěn)、產(chǎn)氣速率快、產(chǎn)氣量多的效果，從而縮短反應(yīng)周期，節(jié)省成本，增加經(jīng)濟效益，為紫花苜蓿能源轉(zhuǎn)化效率提高提供理論依據(jù)。

1.材料與方法

1.1材料

發(fā)酵原料為紫花苜蓿，采自云南師范大學(xué)校園，經(jīng)測定總固體（TS）含量為92.29%，揮發(fā)性固體（VS）含量為90.64%。接種物為實驗室發(fā)酵后的底泥，經(jīng)測定TS含量為10.75%，VS含量為55.57%。

1.2試驗裝置

采用實驗室自制的500 mL的批量式發(fā)酵裝置，裝置示意圖如圖1所示。

1.3方法

1.3.1原料預(yù)處理 將紫花苜蓿清理后切碎成長度小于2 cm的小段，以便其與接種物充分混合均勻。

1.3.2試驗設(shè)計 設(shè)置A、B、C 3個不同接種量試驗組，其接種量分別為30%、40%、50%，每組分別設(shè)3個平行，發(fā)酵液TS按6%配制（以30%接種量計算）。為保證試驗的一致性，進行單瓶配料。具體配比見表1。為了提高試驗的精確度，設(shè)置3個空白組作為對照，在試驗結(jié)束后計算其總產(chǎn)氣量，并用各組的總產(chǎn)氣量減去相應(yīng)值作為最終產(chǎn)氣量。采用常溫厭氧發(fā)酵，每天定時記錄溫度變化、產(chǎn)氣量、pH及火焰顏色。

1.3.3測試項目及方法 ①產(chǎn)氣量。采用排水集氣法測定，每天定時記錄各組的產(chǎn)氣量，以各組3個平行的平均產(chǎn)氣量作為各組的表征產(chǎn)氣量。同時采用火焰顏色比色卡法，根據(jù)火焰顏色來判斷氣體中的甲烷含量。②TS、VS含量。采用常規(guī)分析法測定原料接種物以及發(fā)酵前后料液的TS、VS。TS：在（105±5）℃的電熱恒溫干燥箱（202型）中烘干至恒重，利用TS計算公式求出TS；VS：在（550±20）℃箱形電阻爐（SX2-2.5-12型）中灼燒至恒重，利用VS計算公式求出VS。③pH。采用pH 6.4～8.0的精密pH試紙測定。

2.結(jié)果與分析

發(fā)酵溫度在20-22℃變化，統(tǒng)計了A、B、C 3個組日產(chǎn)氣量，對產(chǎn)氣速率進行計算，分別對發(fā)酵液前后的TS、VS、pH進行測定，最后分析接種物用量在紫花苜蓿發(fā)酵中的影響。

2.1接種量對紫花苜蓿發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響

空白對照組厭氧發(fā)酵的產(chǎn)氣量極少，表明接種物中可被微生物利用的有機物很少，僅能起到一個提供生產(chǎn)者的作用，其自身產(chǎn)氣量對試驗的影響可忽略。發(fā)酵過程中A、B、C 3個組的日產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣速率變化如圖2所示。由圖2可以看出，接種物濃度的不同對厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣的影響很大。在試驗開始后，接種量最大的C組啟動速度最快，B組次之，A、B、C 3個組在整個試驗階段均出現(xiàn)了2個產(chǎn)氣高峰。其中，C組在發(fā)酵10 d時出現(xiàn)第1個產(chǎn)氣高峰，為360 mL，甲烷含量約為60%：B組和A組分別在15 d和20 d時出現(xiàn)了第1個產(chǎn)氣高峰，分別為320、300 mL，B組甲烷含量約為65%，A組約為55%。C組在19 d時出現(xiàn)第2個產(chǎn)氣高峰，為200mL；B組和A組的第2個產(chǎn)氣高峰分別在28 d和34 d，峰值分別為140、180 mL。

在厭氧發(fā)酵初期，反應(yīng)器中尚未形成嚴(yán)格的厭氧環(huán)境，抑制了其產(chǎn)甲烷菌的活性。隨著反應(yīng)器內(nèi)氧氣的減少，產(chǎn)酸階段受到抑制，為產(chǎn)甲烷菌的生長繁殖創(chuàng)造良好的環(huán)境，產(chǎn)甲烷菌開始將產(chǎn)酸階段產(chǎn)生的有機酸轉(zhuǎn)化為CH4，產(chǎn)氣速率不斷加快。從整個發(fā)酵過程來看，在反應(yīng)前半段，B組、C組產(chǎn)氣一直很好，很快達到產(chǎn)氣高峰，明顯高于A組；但在發(fā)酵23 d以后c組產(chǎn)氣量低于140 mL，產(chǎn)氣量明顯下降。可能是由于接種物濃度高，其中含有的產(chǎn)甲烷菌較多，有機物被產(chǎn)甲烷菌快速利用，產(chǎn)氣減少。張錫輝在Contois模型中提到，物料濃度一定時，若接種物濃度越大，接種物中微生物的生長速度將下降。經(jīng)過一段時間的繁殖，產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量進一步增加，產(chǎn)甲烷菌之間相互競爭造成相互抑制，導(dǎo)致產(chǎn)氣量下降，因此，c組的產(chǎn)氣量略高于B組。

整個過程中A、B、C 3個組的累積產(chǎn)氣量分別為3 355、3 625、3 685 mL，B組和C組的產(chǎn)氣量相差不大，但明顯大于A組，分別比A組多8.05%和9.84%。c組在27 d時產(chǎn)氣速率達80%以上，B組、A組分別在28 d和31 d時產(chǎn)氣速率才達到80%以上。在實際運用中，優(yōu)先考慮B組、C組，這樣縮短水力滯留時間，節(jié)省成本。

2.2接種量對料液pH的影響

接種物濃度對反應(yīng)物料液oH的影響如表2所示。在料液發(fā)酵前，料液pH分別為7.0、7.0、7.2，均在厭氧發(fā)酵的最適范圍內(nèi)。厭氧發(fā)酵5 d時，A組的pH降到5.5，B、C組分別降至6.0、6.5，中間有5 d出現(xiàn)酸化現(xiàn)象。發(fā)酵8 d后，通過自身調(diào)節(jié)，pH不斷升高，并恢復(fù)至合適的pH范圍。8～20 d pH基本沒有發(fā)生變化，20 d時A、B、C組pH分別為6.7、7.0、7.0.20-30 d基本沒有變化，發(fā)酵后料液pH都是7.0，總體來講除了酸化期，pH的變化很小，在正常范圍內(nèi)波動。

2.3接種量對TS、VS及原料產(chǎn)氣率的影響

不同濃度接種物的各試驗組，其原料產(chǎn)氣率、TS產(chǎn)氣率及VS產(chǎn)氣率如表3所示。由表3可以看出，C組的原料產(chǎn)氣率、TS產(chǎn)氣率及VS產(chǎn)氣率均高于A、B組，B、C組（B組為327 mL/g，C組為333mL/g）的TS產(chǎn)氣率明顯高于A組（302 mL/g），B、C兩個組之間差距較小。從火焰顏色來看，發(fā)酵過程中B組甲烷含量最高，并且發(fā)酵穩(wěn)定。

3.結(jié)論

目前研究接種物主要集中在接種物的種類來源和濃度對厭氧發(fā)酵的影響。Suwannoppadd等采用發(fā)酵牛糞、消化污泥、草炭作為接種物對青草進行降解，并且比較快速高溫發(fā)酵啟動時的區(qū)別，結(jié)果表明消化污泥要比發(fā)酵牛糞、草炭效率高。潘云霞等研究不同接種物濃度對牛糞發(fā)酵反應(yīng)啟動、產(chǎn)氣量及產(chǎn)氣速率的影響，接種物濃度6%、物料與接種物濃度為1：1情況下，結(jié)果表現(xiàn)最好。秸稈厭氧發(fā)酵需要對接種物種類、接種比進行研究，以此提高原料產(chǎn)氣率、甲烷含量，縮短發(fā)酵周期。

本研究結(jié)果表明，接種物是影響發(fā)酵的因素之一，而接種量同樣會影響發(fā)酵整體情況。適當(dāng)?shù)脑龃蠼臃N量能夠提高厭氧發(fā)酵的啟動速度，增強發(fā)酵體系的抗酸化緩沖能力：但當(dāng)接種量過大時，由于產(chǎn)甲烷菌的相互競爭造成了相互抑制，原料產(chǎn)氣率會達到一定極限，并且所產(chǎn)氣體甲烷含量出現(xiàn)一定程度的降低。綜合各方面考慮，在紫花苜蓿厭氧發(fā)酵中，接種量以40%最佳，其TS產(chǎn)氣率為327 mL/g，VS產(chǎn)氣率為361 mL/g。