王彥平　王懷中　姜運(yùn)良

摘要：通過文獻(xiàn)搜索，收集整理了影響豬生長和肉質(zhì)性狀的顯著單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism， SNP）位點，基于飛行時間質(zhì)譜技術(shù)對大約克（n=400）和長白（n=399）樣本進(jìn)行SNP快速分型，并分析了這些位點在大約克和長白群體內(nèi)的基因型、等位基因頻率、哈代-溫伯格平衡狀態(tài)等遺傳學(xué)特征。結(jié)果表明：利用飛行時間質(zhì)譜技術(shù)可對17個影響豬肉質(zhì)和生長性狀的顯著SNP位點進(jìn)行同時快速基因分型，平均個體檢出率為96.35%；17個被檢SNP位點中9個為多態(tài)位點，其它8個為只有一種基因型的單態(tài)位點；多態(tài)SNP位點中有6個處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)，其它3個嚴(yán)重偏離哈代-溫伯格平衡。本研究收集了對豬生長和肉質(zhì)性狀具有顯著效應(yīng)的SNP位點，探討了利用飛行質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行多位點SNP快速分型的可行性，為今后建立豬生長和肉質(zhì)性狀標(biāo)記輔助選擇、加快豬的遺傳研究進(jìn)展奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：豬；飛行時間質(zhì)譜技術(shù)；單核苷酸多態(tài)性（SNP）；等位基因頻率；標(biāo)記輔助選擇

中圖分類號：S828.2文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2016）08-0128-06

AbstractIn the study， we collected the single nucleotide polymorphism （SNP） loci related with growth and meat quality of pigs by searching published papers and public databases. Based on the time-of-flight mass spectrometry （TOF-MS） technique， we genotyped the samples of Yorkshire （n=400） and Landrace （n=399）， and analyzed the genotype frequency， allele frequency， and Hardy-Weinberg Equilibrium testing of these SNPs. The results showed that using TOF-MS， we successfully genotyped 17 SNPs at the same time， and the average call rate of these SNPs was 96.35%. Nine of the 17 SNPs were polymorphic loci， and the other 8 were monomorphic loci， which had only one genotype in both Yorkshire and Landrace. Additionally， for the 9 polymorphic SNPs， 6 SNPs were in the Hardy-Weinberg Equilibrium and the other 3 deviated from it significantly. This study collected the significant SNPs related with growth and meat quality， and verified the effectiveness of genotyping multiple SNPs simultaneously and rapidly using TOF-MS， which provided foundations for the marker assisted selection （MAS） and the improvement of genetic progress of pigs.

KeywordsPig； Time-of-flight mass spectrometry （TOF-MS）； Single nucleotide polymorphism （SNP）； Allele frequency； Marker assisted selection （MAS）

近年來，隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展，遺傳標(biāo)記逐漸用于畜禽的標(biāo)記輔助選擇（marker assisted selection，MAS）育種中，以提高遺傳選育的準(zhǔn)確性。但是，對于數(shù)量性狀，應(yīng)用單個或者少數(shù)基因的MAS只能夠解釋很小比例的遺傳變異，因此限制了標(biāo)記輔助選擇在畜禽育種中的應(yīng)用。近年來發(fā)展起來的基于高密度SNP芯片的基因組選擇技術(shù)克服了傳統(tǒng)MAS的缺陷，但是其成本相對較高，對奶牛育種來說是可以承受的，對豬、雞和羊等畜禽來說太高，在一定程度上影響了基因組選擇在豬、雞和羊等畜禽中的應(yīng)用。

Zhang等[1]通過模擬研究表明，使用高密度芯片總標(biāo)記數(shù)5%的標(biāo)記即可獲得高密度芯片95%的準(zhǔn)確性，而且使用性狀篩選標(biāo)記效果要好于均勻分布的標(biāo)記。隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展，廣大科研工作者對影響豬繁殖、肉質(zhì)和抗病等常規(guī)選育受到限制的性狀基因進(jìn)行了廣泛的研究。通過候選基因、數(shù)量性狀基因座（QTL）定位和全基因組關(guān)聯(lián)分析等策略已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了數(shù)十個影響豬繁殖、肉質(zhì)和抗病等性狀的主效基因、QTL和DNA標(biāo)記。本研究通過文獻(xiàn)搜索，收集整理了對豬生長和肉質(zhì)性狀具有顯著效應(yīng)的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism， SNP）位點，探討利用飛行質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行多位點SNP快速分型的可行性，為今后建立豬生長和肉質(zhì)性狀標(biāo)記輔助選擇、加快豬的遺傳研究進(jìn)展奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗動物和樣本采集

研究所測樣品均來自山東省菏澤宏興原種豬繁育有限公司，包括大約克（Yorkshire， n=400）和長白（Landrace， n=399）共799頭仔豬。仔豬達(dá)35日齡時，每窩隨機(jī)選取3～5頭生長發(fā)育良好的健康仔豬，取耳組織，加入70%乙醇，-20℃保存?zhèn)溆?。?氯仿法提取基因組DNA。利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop進(jìn)行DNA質(zhì)量和濃度分析， -20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2具有顯著效應(yīng)的豬生長和肉質(zhì)性狀SNP搜集

通過PubMed（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）、中國知網(wǎng)（http：//www.cnki.net/）和dpSNP（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/index.html）等公共生物信息數(shù)據(jù)資源進(jìn)行文獻(xiàn)搜索和SNP信息收集，并通過不同來源信息的重復(fù)驗證和篩選，獲得對豬生長和肉質(zhì)性狀具有顯著效應(yīng)的SNP標(biāo)記。

1.3SNP分型檢測

基于Sequenom公司的MassArray iPLEX飛行時間質(zhì)譜基因分型平臺進(jìn)行SNP分型檢測。Sequenom MassArray SNP檢測具體原理是先根據(jù)位點信息設(shè)計特異性PCR引物和延伸引物（具體引物信息如表2所示），將包含SNP位點區(qū)域的DNA模板通過PCR技術(shù)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物以SAP酶去除多余dNTPs，然后對待檢位點同時進(jìn)行單堿基延伸，位點特異性延伸引物在突變位點處延伸一個堿基并終止，因此其可根據(jù)突變類型的差異而連接上不同的ddNTPs，形成分子量差異。延伸產(chǎn)物經(jīng)過樹脂純化后，點樣至靶片上，使用質(zhì)譜儀對不同延伸產(chǎn)物的分子量進(jìn)行檢測，通過專用的分析軟件MassArray Typer 4.0 進(jìn)行處理，就可得到各突變位點的具體基因型。

1.4數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計分析

利用Excel 整理原始數(shù)據(jù)。利用皮爾遜卡方統(tǒng)計量對各SNP位點進(jìn)行哈代-溫伯格平衡檢驗，并利用Excel中的CHIDIST函數(shù)計算卡方值相應(yīng)的P值。

皮爾遜卡方統(tǒng)計量定義為χ2=∑（O-E）2E，該式是對某一給定位點所有基因型的求和。式中O（Observed）代表每個基因型的觀測數(shù)目，E（Expected）代表每個基因型在哈代-溫伯格平衡定律成立的假定下的期望數(shù)目。

2結(jié)果與分析

2.1樣本基因組DNA提取及檢測

使用經(jīng)典的酚-氯仿法提取豬耳組織樣本中的基因組DNA。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠圖顯示DNA條帶單一、清晰、無雜質(zhì)，沒有彌散、拖尾現(xiàn)象，說明DNA完整度好。通過Nanodrop紫外分光光度計法檢測DNA的純度和濃度，調(diào)整DNA終濃度在100 ng/μL左右，-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.2影響豬生長和肉質(zhì)性狀的顯著SNP搜集

通過對公共生物信息數(shù)據(jù)資源進(jìn)行文獻(xiàn)搜索，本研究共收集整理了24個SNP位點，其中14個SNP來自10個候選基因，包括氟烷基因（Hal，1個SNP）、酸肉基因（RN，2個SNP）、脂肪細(xì)胞決定和分化因子1基因（ADD1，1個SNP）、乙酰輔酶A羧化酶α基因（ACACA，1個SNP）、肌肉生長抑制素基因（MSTN，3個SNP）、胰島素樣生長因子2基因（IGF2，1個SNP）、黑素皮質(zhì)素受體4基因（MC4R，1個SNP）、Leptin受體基因（LEPR，1個 SNP）、肌細(xì)胞生成素Myogenin 基因（MyoG，1個 SNP）、脂肪肥胖相關(guān)基因（FTO，2個SNP）；10個SNP來自3篇肉質(zhì)相關(guān)的全基因組關(guān)聯(lián)分析文章。24個SNP位點的具體信息詳見表1所示。

根據(jù)位點信息設(shè)計特異性PCR引物和延伸引物時，有4個SNP位點與其它位點的引物發(fā)生沖突，包括RN的1個 SNP、MSTN的1個 SNP、IGF2的1個 SNP和 G5位點，沒有包含在檢測范圍內(nèi)。20個SNP位點在基因分型中所使用的引物信息詳見表2所示。

2.3大約克和長白群體SNP分型結(jié)果

對本研究中大約克（n=400）和長白（n=399）共799個樣本基因組DNA基于Sequenom公司的MassArray iPLEX飛行時間質(zhì)譜基因分型平臺進(jìn)行SNP基因分型，20個檢測位點中有3個分型失?。℅3、LEPR和MSTN3），其余17個SNP位點均能夠很好地檢測出常見的三種基因型。17個SNP位點的平均個體檢出率為96.35%，其中最高檢出率為99.01%，最低檢出率為 89.51%，各SNP位點具體檢測結(jié)果詳見表3所示。

17個成功檢測的SNP位點中有8個（Hal、ADD1、FTO1、G9、G10、MSTN1、MyoG、RN2）為單態(tài)位點，即這些SNP位點在被檢的大約克和長白樣品中只有一種基因型，其余9個SNP位點（ACACA、MC4R、FTO2、G1、G2、G4、G6、G7、G8）在兩個品種內(nèi)均存在多態(tài)。利用皮爾遜卡方統(tǒng)計量對9個具有多態(tài)的SNP位點進(jìn)行哈代-溫伯格平衡檢驗，結(jié)果表明6個SNP位點處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)，其它3個SNP位點（G1、G2和G4）嚴(yán)重偏離哈代-溫伯格平衡。

3討論與結(jié)論

單核苷酸多態(tài)性（SNP）是基因組上廣泛分布并能穩(wěn)定遺傳的DNA序列多態(tài)性。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，產(chǎn)生了一系列能夠?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模高通量的基因分型方法，如高通量測序技術(shù)、芯片技術(shù)和飛行時間質(zhì)譜技術(shù)等。飛行時間質(zhì)譜技術(shù)在SNP分型中表現(xiàn)出的高通量、準(zhǔn)確性高、靈敏度高三大特點，及其較高的性價比，已成為眾多科研人員進(jìn)行SNP基因分型研究的首選[15，16]。本研究利用飛行時間質(zhì)譜技術(shù)檢測了大約克和長白群體799個樣本的17個SNP位點，其檢出率平均達(dá)96.35%，說明飛行時間質(zhì)譜技術(shù)可實現(xiàn)位點和樣本的高通量和自動化SNP分型。但應(yīng)該指出的是，飛行時間質(zhì)譜法是利用多重PCR反應(yīng)的原理實現(xiàn)對多個SNP位點的同時檢測，過多的引物在一個反應(yīng)體系中容易形成引物二聚體，增加引物設(shè)計的難度。飛行時間質(zhì)譜技術(shù)的這種局限性，有時會導(dǎo)致某些選定的SNP位點不能包括在同一個反應(yīng)體系中。例如本研究中，預(yù)篩選時選擇了24個SNP位點，但在設(shè)計特異性PCR引物和延伸引物時，4個位點（包括RN的1個SNP、MSTN的1個SNP、IGF2的1個SNP和G5位點）與其它位點的引物發(fā)生沖突，不能包含在檢測范圍內(nèi)。

在通過文獻(xiàn)和公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行顯著效應(yīng)SNP信息收集過程中，有些候選基因，如心臟脂肪酸結(jié)合蛋白基因[17]、鈣蛋白酶抑制蛋白基因[18]和二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶基因[19]等，利用的是基于PCR-RFLP方法進(jìn)行的SNP基因分型，文獻(xiàn)中沒有具體的序列信息，不好確定SNP在基因組中的具體位置。我們曾經(jīng)嘗試用文獻(xiàn)中提供的引物進(jìn)行PCR測序，但結(jié)果不理想。另外，有些基因報道較多，但是不同研究者報道的基因效應(yīng)不一致，故有幾個常見豬生長和肉質(zhì)相關(guān)基因排除在本研究之外。本研究中還有部分SNP來自于全基因組關(guān)聯(lián)分析文章。全基因組關(guān)聯(lián)分析是近幾年發(fā)展起來的鑒定影響目標(biāo)性狀顯著SNP的一種方法。但是目前，肉質(zhì)性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析文章不多，而且有些文章[20，21]只給出了某個SNP位點的P值，沒有指明SNP兩個等位基因的效應(yīng)，這樣的文章對我們在SNP收集中參考意義也不大。

本研究中，17個成功檢測的SNP位點中有8個為單態(tài)位點，這8個SNP位點均具有較大的效應(yīng)。大約克和長白均是高度選育的商業(yè)化豬種，在長期的選擇過程中，使這些發(fā)現(xiàn)較早且效應(yīng)較大的SNP位點逐漸純合。最顯著的例子是氟烷基因（Hal）[2]，氟烷基因能夠促進(jìn)豬的肌肉生長，但是容易引起豬應(yīng)激綜合征。自從20世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)氟烷基因編碼蛋白的一個氨基酸突變（由精氨酸變成半膚氨酸）是導(dǎo)致豬應(yīng)激綜合征的原因以來，各育種公司利用MAS方法從群體中逐漸剔除了Hal的有害等位基因。另外9個多態(tài)SNP位點中，有3個SNP位點（G1、G2和G4）嚴(yán)重偏離哈代-溫伯格平衡，說明這3個位點已經(jīng)受到了高度選擇。對于其它6個處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)的多態(tài)SNP位點，我們認(rèn)為可能有兩種原因，一是這些SNP是影響豬生長和肉質(zhì)形狀的顯著SNP，但是效應(yīng)較??；二是這些SNP具有多效性，使其在選育中受到的選育程度較輕。

總之，本研究利用飛行時間質(zhì)譜技術(shù)成功檢測了影響豬生長和肉質(zhì)性狀的17個SNP位點，建立了一套高通量、快速、準(zhǔn)確的SNP檢測平臺，為今后建立豬生長和肉質(zhì)性狀遺傳標(biāo)記的開發(fā)和利用、加快豬的遺傳研究進(jìn)展奠定基礎(chǔ)。

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