梁娟，祁承林，胡謀波，鄭雪嘉，呂軍影(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

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紅花水煎液對系統(tǒng)性硬皮病小鼠皮膚及肺組織纖維化的影響及機制

梁娟，祁承林，胡謀波，鄭雪嘉，呂軍影(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

摘要：目的探討紅花水煎液對系統(tǒng)性硬皮病(SSc)小鼠皮膚及肺組織纖維化的影響及其作用機制。方法32只BALB/C小鼠隨機分為空白組、模型組、強的松組、紅花組，每組8只?？瞻捉M背部注射生理鹽水，其余三組均背部注射博來霉素制備SSc模型；造模同時空白組和模型組給予生理鹽水0.2 mL/d灌胃，強的松組給予強的松溶液0.2 mL/d(含強的松0.09 mg)灌胃，紅花組給予紅花水煎液0.2 mL/d(含紅花30 mg)灌胃，均連續(xù)給予28天。取各組背部注射區(qū)皮膚和肺組織行HE和Masson染色，檢測真皮厚度；采用樣本水解法檢測皮膚和肺組織羥脯氨酸(HYP)含量；采用免疫組化法檢測皮膚和肺組織IL-17、IL-6表達；ELISA法檢測血清IL-17、IL-6水平。結(jié)果空白組真皮厚度為(295.90±53.44)μm，模型組為(689.01±157.20)μm，強的松組為(562.58±113.74)μm，紅花組為(433.80±83.62)μm，組間比較P均<0.05。與空白組比較，其余三組皮膚和肺組織HYP含量均升高；與模型組比較，強的松組、紅花組皮膚和肺組織HYP含量均降低，紅花組降低更顯著；組間比較P均<0.05。與空白組比較，其余三組皮膚和肺組織IL-17、IL-6表達及血清IL-17、IL-6水平均升高；與模型組比較，強的松組、紅花組皮膚和肺組織IL-17、IL-6表達及血清IL-17、IL-6水平均降低，紅花組降低更顯著；組間比較P均<0.05。結(jié)論紅花水煎液可改善SSc小鼠皮膚及肺組織纖維化；抑制IL-17、IL-6表達，減輕免疫炎癥反應(yīng)可能是其作用機制之一。

關(guān)鍵詞：系統(tǒng)性硬皮病；紅花；白細胞介素17；白細胞介素6；BALB/C小鼠

系統(tǒng)性硬化病(SSc)又稱硬皮病，是以皮膚和(或)內(nèi)臟結(jié)締組織局限性或彌漫性纖維化為主要特征的一種自身免疫性疾病，由于其病因和發(fā)病機制尚不完全清楚，目前尚無特效療法。臨床主要應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等治療SSc，但藥物不良反應(yīng)較多且療效均不理想[1]。研究表明，活血化瘀類中藥紅花具有擴張血管、改善血液循環(huán)、調(diào)節(jié)機體免疫功能、抑制成纖維細胞增殖等作用，并可在一定程度上減輕藥物不良反應(yīng)，扶正固本，增強臨床療效[2～5]。2014年11月～2015年11月，本研究觀察了紅花水煎液對SSc小鼠皮膚及肺組織纖維化的影響，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其作用機制。

1材料與方法

1.1材料動物：32只6～8周近交系BALB/C小鼠，SPF級，雌性，體質(zhì)量18～22 g，購于廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，動物許可證編號：SCXK桂2014-0002；在室溫20～25 ℃、相對濕度50%～70%的清潔環(huán)境中分籠飼養(yǎng)，采用12 h晝/夜循環(huán)照明。主要藥物及試劑：注射用鹽酸博來霉素(規(guī)格：15 mg/瓶，批號：140372，日本化藥株式會社)溶于高壓滅菌的0.01 mol/L PBS(pH 7.2)中，制成濃度為200 μg/mL緩沖液，過濾除菌后分裝于EP管中，4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｖ兴幖t花(批號：140901，產(chǎn)地：新疆)采用常規(guī)方法加水煎煮并濃縮成濃度為1 g/mL的紅花水煎液，4 ℃保存?zhèn)溆?。強的松?規(guī)格：5 mg/片，批號：141123，廣東華南藥業(yè)集團有限公司)溶于蒸餾水中制成濃度為0.45 mg/mL的混懸液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2動物分組及處理隨機將32只小鼠分為空白組、模型組、強的松組、紅花組，每組8只。按照文獻[6,7]方法將所有小鼠剃去背部中央?yún)^(qū)相同部位被毛，面積約2.0 cm×2.0 cm，以4.5號無菌注射針頭在小鼠背部中央被毛區(qū)皮下注射，空白組注射0.01 mol/L PBS(pH 7.2)，其余各組均注射濃度為200 μg/mL的注射用鹽酸博來霉素緩沖液，0.1 mL/次，1次/d，連續(xù)注射28天。造模開始即行藥物干預(yù)，根據(jù)小鼠與人折算系數(shù)表，計算小鼠(體質(zhì)量20 g)使用強的松劑量為0.09 mg/d，紅花劑量為30 mg/d。強的松組給予強的松溶液0.2 mL/d(含強的松0.09 mg)灌胃，紅花組給予紅花水煎液0.2 mL/d(含紅花30 mg)灌胃，空白組和模型組給予等容量生理鹽水灌胃，均連續(xù)給藥28天。各組均自由飲水、飲食。用藥結(jié)束后禁食1天，不禁水。第2天將所有小鼠按2 mL/kg腹腔注射10%水合氯醛麻醉，取眼動脈血收集于未抗凝管內(nèi)，37 ℃靜置30 min，離心取上清，-80 ℃保存。處死小鼠，取背部注射區(qū)皮膚及肺組織，一部分放入10%多聚甲醛溶液固定，脫水，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片；一部分4 ℃保存。

1.3相關(guān)指標(biāo)觀察①一般情況：干預(yù)過程中觀察各組小鼠活動度、反應(yīng)度、皮膚、毛發(fā)等一般情況。②組織病理學(xué)變化：取各組皮膚及肺組織切片，進行HE染色和Masson染色，操作步驟參照試劑盒說明書，光學(xué)顯微鏡下觀察皮膚及肺組織病理學(xué)改變。采用病理圖像分析儀系統(tǒng)軟件測定真皮厚度，每張切片隨機取5處測真皮厚度，取平均值。③皮膚及肺組織羥脯氨酸(HYP)含量：取各組皮膚及肺組織，采用樣本水解法檢測HYP，具體操作參照試劑盒說明書。以雙光束紫外線分光光度計在550 nm波長處測吸光度值(OD值)，并換算為HYP含量(mg/g)。④皮膚和肺組織IL-17、IL-6表達：取各組皮膚及肺組織切片，采用免疫組化SABC法檢測IL-17、IL-6，步驟參照試劑盒說明書。IL-17工作液濃度為1∶200、IL-6為1∶200。以PBS代替一抗作為陰性對照。鏡下觀察結(jié)果，采用Olmpus圖像采集系統(tǒng)和Image-pro plus6.0圖像分析軟件進行定量分析，每張切片隨機選取5個視野，以細胞質(zhì)、細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，測定每個視野下染色的平均光密度值(IOD值)。IOD=總OD值/陽性面積。⑤血清IL-17、IL-6水平：取各組血清樣本，采用ELISA法檢測血清IL-17、IL-6。嚴格按照說明書操作，以酶標(biāo)儀在450 nm波長處讀取OD值，計算濃度。

2結(jié)果

2.1一般情況干預(yù)過程中各組均無死亡?？瞻捉M一般狀態(tài)良好，反應(yīng)靈敏，未見消瘦；背部注射區(qū)皮膚有輕度增厚，無硬化現(xiàn)象，表面細膩光滑，毛發(fā)光澤、質(zhì)地柔軟、生長迅速。模型組精神差，活動量少，明顯消瘦；背部注射區(qū)皮膚顯著增厚變硬，彈性差，與皮下組織粘連，毛發(fā)未見生長。強的松組、紅花組皮膚毛發(fā)可見不同程度生長，活動度好于模型組，紅花組上述改變優(yōu)于強的松組。

2.2皮膚及肺組織病理學(xué)變化HE染色和Masson染色顯示，空白組皮膚和肺組織結(jié)構(gòu)完整，無明顯炎癥細胞浸潤。模型組皮膚表皮棘層肥厚，真皮層明顯增厚，膠原纖維明顯增粗、膨大、數(shù)量增多、排列緊密、均質(zhì)化；真皮下層血管增粗，管壁明顯增厚，管腔變小，甚至閉塞，周圍可見炎癥細胞浸潤；皮膚附屬器萎縮，減少；肺部結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔增厚，小血管壁增厚，肺泡內(nèi)出血，肺間質(zhì)、肺泡和支氣管壁可見纖維性增厚，以淋巴細胞為主的炎癥細胞浸潤。紅花組和強的松組真皮厚度較模型組減輕，膠原纖維稀疏，真皮小血管壁變??；肺泡壁厚度減小，炎癥細胞滲出減少；其中紅花組效果更好。空白組真皮厚度為(295.90±53.44)μm，模型組為(689.01±157.20)μm，強的松組為(562.58±113.74)μm，紅花組為(433.80±83.62)μm，組間比較P均<0.05。見插頁Ⅱ圖1、2。

2.3皮膚和肺組織HYP含量與空白組比較，其余三組皮膚和肺組織HYP含量均升高；與模型組比較，強的松組、紅花組皮膚和肺組織HYP含量均降低，紅花組降低更顯著；組間比較P均<0.05。見表1。

表1　各組皮膚和肺組織HYP含量比較±s)

注：組間比較，P均<0.05。

2.4皮膚和肺組織IL-17、IL-6表達與空白組比較，其余三組皮膚和肺組織IL-17、IL-6表達均升高；與模型組比較，強的松組、紅花組皮膚和肺組織IL-17、IL-6表達均降低，紅花組降低更顯著；組間比較P均<0.05。見表2。

表2　各組皮膚和肺組織IL-17、IL-6表達

注：組間比較，P均<0.05。

2.5血清IL-17、IL-6水平與空白組比較，其余三組血清IL-17、IL-6水平均升高；與模型組比較，強的松組、紅花組血清IL-17、IL-6水平均降低，紅花組降低更顯著；組間比較P均<0.05。見表3。

表3　血清IL-17、IL-6水平比較

注：組間比較，P均<0.05。

3討論

SSc是一種累及多系統(tǒng)的慢性自身免疫性疾病，其發(fā)病機制主要涉及三個方面：成纖維細胞活化和纖維化、血管病變、免疫系統(tǒng)異?；罨褪д{(diào)[8]。皮膚和組織器官廣泛纖維化、硬化為SSc的主要特征，肺是最常受累的內(nèi)臟器官。成纖維細胞是參與組織纖維化、硬化的主要細胞，并且是膠原合成的主要場所。免疫系統(tǒng)異常活化和失調(diào)在SSc的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[9]。

在纖維化組織中T淋巴細胞增多，促進炎癥反應(yīng)，刺激成纖維細胞增殖、膠原增加，引起纖維化[10]。研究發(fā)現(xiàn)，在SSc病變早期至皮膚纖維化之前的病變過程中即出現(xiàn)大量T細胞、巨噬細胞及肥大細胞浸潤。說明T淋巴細胞活化在SSc發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[11]。Th17細胞是以表達IL-17為特征的CD4+T細胞亞型，IL-17是其最主要的效應(yīng)因子，具有強大的致炎作用，可通過誘導(dǎo)活化T細胞、產(chǎn)生多種炎性介質(zhì)，誘導(dǎo)炎癥發(fā)生。IL-6是最近幾年發(fā)現(xiàn)的一種促炎和促纖維化的細胞因子，是T細胞誘導(dǎo)炎癥的早期始動因素，與TGF-β聯(lián)合誘導(dǎo)初始T細胞分化成為Th17細胞，參與自身免疫性疾病的發(fā)病；此外，在成纖維細胞中Th17細胞分泌的IL-17又可促進IL-6產(chǎn)生；IL-6、IL-17共同參與刺激成纖維細胞增生，導(dǎo)致組織纖維化[12,13]。

博來霉素是堿性糖肽類抗癌抗生素，是產(chǎn)生活性氧的藥物之一，免疫因素可能是其誘導(dǎo)組織纖維化的機制之一。本研究對BALB/C小鼠皮下注射鹽酸博來霉素緩沖液，并采用反映組織內(nèi)膠原含量的Masson染色，同時用水解法測定HYP含量以分析膠原含量，結(jié)果顯示小鼠皮膚和肺組織炎癥細胞浸潤、HYP含量增加、真皮厚度增加，提示SSc模型制備成功；皮膚和肺組織IL-17、IL-6表達、血清IL-17、IL-6水平均升高，提示IL-6、IL-17通過誘導(dǎo)分化和活化T淋巴細胞，直接參與皮膚及肺組織的免疫性炎癥，促進SSc發(fā)生。

目前對SSc的治療尚無特效藥物，糖皮質(zhì)激素具有免疫抑制作用，是臨床上治療SSc性價比最高的藥物之一。SSc的一般治療方案為強的松30 mg/d，連用數(shù)周，逐漸給予維持量5～10 mg/d[14]。但糖皮質(zhì)激素對SSc的療效并不十分顯著，不宜長期使用，且對于肢端型硬皮病、有肺纖維化和腎損害者禁用。中藥紅花，又名金紅花、草紅花、刺紅花和懷紅花，為菊科植物紅花的干燥筒狀花冠。中醫(yī)認為紅花味辛、微苦，性溫，歸心和肝經(jīng)，具有活血通經(jīng)、散瘀止痛的功效。紅花的化學(xué)成分主要包括黃酮類、生物堿類、聚炔類、亞精胺類、木脂素類、倍半萜類、有機酸類、烷基二醇類、多糖類等。黃酮類化合物紅花黃色素為紅花的主要有效成分[15]?，F(xiàn)代藥理研究表明，紅花的化學(xué)成分具有廣泛的藥理活性，能改善心腦血氧供應(yīng)、減輕缺血性損傷，抗凝血、抗心肌缺血、抑制血小板聚集。此外，紅花還具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗纖維化、免疫調(diào)節(jié)等作用，臨床多用于心血管系統(tǒng)疾病、婦科疾病、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等疾病的治療[16]。

本研究給予SSc小鼠以紅花水煎液干預(yù)，并選擇強的松作為對照藥物，結(jié)果顯示紅花組、強的松組 皮膚及肺組織炎癥細胞浸潤程度均較模型組減輕，真皮厚度、HYP含量均降低，紅花組上述指標(biāo)改善情況均優(yōu)于強的松組；提示紅花水煎液可改善SSc小鼠肺及皮膚纖維化，且效果優(yōu)于強的松。紅花組、強的松組肺及皮膚組織IL-17、IL-6表達及血清IL-17、IL-6水平均較模型組下降，紅花組下降更顯著；說明兩種藥物均能通過降低IL-17、IL-6，減輕免疫炎癥，進而抑制組織纖維化形成，且紅花水煎液效果更好。

綜上所述，紅花水煎液可改善SSc小鼠肺及皮膚組織纖維化，抑制IL-17、IL-6表達，減輕免疫炎癥反應(yīng)可能是其作用機制之一。

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Effects of safflower decoction on skin and lung fibrosis of mice with systemic scleroderma and its mechanism

LIANGJuan,QIChenglin,HUMoubo,ZHENGXuejia,LYUJunying

(TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Abstract:ObjectiveTo study the effects of safflower decoction on the skin and lung fibrosis of mice with systemic scleroderma (SSc) and its mechanism. MethodsThirty-two BALB/C mice were randomly divided into the blank group, model group, prednisone group and safflower group, 8 mice in each group. The blank group was injected with normal saline, and the other three groups were treated with bleomycin (BLM) at the back to establish the SSc models. At the same time, the blank group and model group were given normal saline (0.2 mL/d), the prednisone group was given prednisone (0.2 mL/d), safflower group was given safflower decoction (0.2 mL/d), and all groups were treated for 28 days. After 28 days, all mice were decapitated and the blood, back skin of the BLM injection part and lungs were collected. The pathological changes were observed by HE and Masson staining. After that, all the tissue slices were taken to measure the dermal thickness, and we detected the hydroxyproline (HYP) content in the skin and lung tissues by sample hydrolysis method. The expression of IL-17 and IL-6 in the skin and lung tissues was detected by immunohistochemisty. The levels of IL-17 and IL-6 in serum was determined by ELISA. ResultsThe dermal thickness was (295.90±53.44) μm in the blank group, (689.01±157.20) μm in the model group, (562.58±113.74) μm in the prednisone group, and (433.80±83.62) μm in the safflower group (all P<0.05). Compared with the blank group, the contents of HYP in the skin and lung tissues of the other three groups were increased; compared with the model group, the contents of HYP in the skin and lung tissues were decreased in the prednisone group and safflower group, and the decrease in the safflower group was more significant, and significant difference was found between groups (all P<0.05). Compared with the blank group, the expression of IL-17 and IL-6 in the skin and lung tissues and the levels of IL-17 and IL-6 in the serum of the other three groups were increased; compared with the model group, the expression of IL-17 and IL-6 in the skin and lung tissues and the levels of IL-17 and IL-6 in the serum were decreased in the prednisone group and safflower group, and the decrease in the safflower group was more significant (all P<0.05). ConclusionsSafflower decoction can improve lung and skin fibrosis in SSc mice. Inhibiting the expression of IL-17 and IL-6, and alleviating immune inflammatory reaction may be one of its mechanisms.

Key words:systemic scleroderma; safflower; interleukin-17; interleukin-6; BALB/C mice

(收稿日期：2015-12-14)

中圖分類號：R593.25

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)12-0016-04

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.12.005

通信作者簡介：呂軍影(1966-)，女，主任醫(yī)師，主要研究方向為中西醫(yī)結(jié)合治療免疫風(fēng)濕系統(tǒng)疾病。E-mail： lujunying007@163.com

第一作者簡介：梁娟(1988-)，女，碩士研究生，主要研究方向為中西醫(yī)結(jié)合治療免疫風(fēng)濕系統(tǒng)疾病。E-mail： liangjuanvip2016@163.com

基金項目：廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科技專項(GZPT1239)。