李雨萌 李瑞煜 牛明 李春雨 柏兆方 馮五文 章從恩 譚鵬 黃之鐠 馬偉光 王伽伯 肖小河

[摘要]根據(jù)不同規(guī)格何首烏的煎煮成分對(duì)肝細(xì)胞毒性的差異，探討何首烏飲片規(guī)格對(duì)其安全性的影響。該研究通過建立何首烏8種主要化學(xué)成分的含量測(cè)定方法，測(cè)定不同規(guī)格何首烏水煎液樣品中各化學(xué)成分的含量，并以其對(duì)正常人L02肝細(xì)胞的抑制率作為肝毒性的評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用多元相關(guān)分析，試圖找出與毒性相關(guān)的化合物。結(jié)果顯示不同規(guī)格何首烏飲片成分溶出差異較大，何首烏打粉飲片的肝細(xì)胞毒性顯著強(qiáng)于何首烏塊狀飲片；通過多元相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)了3個(gè)與何首烏肝毒性密切相關(guān)的成分。結(jié)果揭示了飲片規(guī)格與何首烏肝細(xì)胞毒性的關(guān)系，其中粉狀規(guī)格飲片毒性相對(duì)較大，有一定的肝損傷風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)予以高度重視。

[關(guān)鍵詞]何首烏；飲片規(guī)格；肝毒性；多元相關(guān)分析；順式二苯乙烯苷；大黃素

何首烏為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb的干燥塊根，始載于《開寶本草》，是一味著名的傳統(tǒng)補(bǔ)益類中藥。近年來，隨著公眾健康意識(shí)的增強(qiáng)，何首烏亦被廣泛用于補(bǔ)肝腎、烏發(fā)的中藥制劑、保健食品、洗護(hù)發(fā)用品，以及大眾日常餐飲、食療保健等，但是涉及何首烏肝損傷的文獻(xiàn)報(bào)道也逐漸增多[1]。我國(guó)以及韓國(guó)、日本、新加坡、英國(guó)等文獻(xiàn)報(bào)道有關(guān)何首烏肝損傷病例180余例[210]。國(guó)家不良反應(yīng)中心收到的有關(guān)何首烏及其制劑的不良反應(yīng)報(bào)告（以肝損傷為主）近萬份。2006年英國(guó)、澳大利亞和加拿大藥監(jiān)部門先后發(fā)布了何首烏肝損傷警告信息，2006，2013，2014年我國(guó)藥監(jiān)部門也多次發(fā)布了含首烏制劑肝損傷警示和監(jiān)管通告?？梢姾问诪醺味拘缘膯栴}已引起國(guó)內(nèi)外高度關(guān)注。針對(duì)何首烏不良反應(yīng)問題，諸多學(xué)者采用常規(guī)毒理學(xué)方法進(jìn)行研究[1119]，雖然因動(dòng)物的種屬不同、藥材的來源不同、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案的不同而有所差異，但是結(jié)果表明何首烏在臨床劑量下應(yīng)用是無毒的，因此對(duì)于何首烏肝毒性問題一直存在爭(zhēng)議。通過基于整合證據(jù)鏈對(duì)何首烏肝毒性進(jìn)行客觀辨識(shí)[2021]，發(fā)現(xiàn)何首烏致肝損傷的影響因素主要可以概括為兩方面：一是藥材本身原因，如炮制不規(guī)范、存在配伍禁忌、藥材質(zhì)量問題等[22]；二是人的原因，如存在特異質(zhì)人群（易感人群）[23]，沒有按照中醫(yī)辨證用藥，患者自行超大劑量長(zhǎng)期服用等。進(jìn)一步對(duì)302醫(yī)院的病人隨訪調(diào)查發(fā)現(xiàn)，何首烏致肝損傷患者中，有很大比例是采用水煎代茶飲、泡酒、打粉水沖服等不合理用藥方式。已有研究表明，飲片經(jīng)打粉后，相對(duì)于塊狀飲片其化學(xué)成分更易煎出[2425]。那么就何首烏而言，打粉后其毒性成分是否更易煎出，從而增加了何首烏臨床用藥風(fēng)險(xiǎn)尚不明確。另外，目前何首烏致肝損傷物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確，存在一定的爭(zhēng)議，有研究提出導(dǎo)致肝損傷的物質(zhì)可能為大黃素等蒽醌類物質(zhì)[2628]，還有研究認(rèn)為肝損傷的物質(zhì)為二苯乙烯苷類物質(zhì)[2930]，但是均屬于推測(cè)，尚缺乏可靠的理論依據(jù)。故本實(shí)驗(yàn)從臨床用藥的角度出發(fā)，測(cè)定不同規(guī)格何首烏水煎液中主要成分的溶出量，通過何首烏肝細(xì)胞毒性檢測(cè)方法，評(píng)價(jià)不同規(guī)格何首烏水煎液對(duì)肝細(xì)胞毒性的影響，同時(shí)通過相關(guān)分析初步探索何首烏可能的肝毒性成分，以期為臨床規(guī)范用藥提供一定的理論參考。

1材料

Agilent 1200 高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；G1315D DAD紫外檢測(cè)器（安捷倫科技有限公司）；Agilent ChemStation色譜工作站（安捷倫科技有限公司），AB265S 1/10萬分析天平（瑞士MettlerToled公司），Synergy H1多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司），TC10TM自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器（美國(guó)BioRad公司，506BR2780），LGJ18型冷凍干燥機(jī)（北京西四環(huán)科學(xué)儀器廠），高壓蒸氣滅菌器（重慶雅馬拓科技有限公司，SN510C），臺(tái)式低速離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司），二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（NAPCO公司），潔凈工作臺(tái)（北京冠鵬凈化設(shè)備責(zé)任有限公司），超聲波清洗機(jī)（南京新辰科技有限公司），回流提取裝置。

沒食子酸（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)120856），兒茶素（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110877），順式二苯乙烯苷（成都克洛瑪生物科技有限公司，批號(hào)150526），反式二苯乙烯苷（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)141101），大黃素8OβD葡萄糖苷（成都克洛瑪生物科技有限公司，批號(hào)141209），大黃素甲醚8OβD葡萄糖苷（成都克洛瑪生物科技有限公司，批號(hào)131012），大黃素（成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號(hào)14031702），DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)1621440），胎牛血清（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)505985），胰蛋白酶（邁晨科技有限公司，批號(hào)E23AT050），青霉素，鏈霉素，Cell Counting Kit8（日本同仁化學(xué)研究所，批號(hào)GH688），色譜級(jí)甲醇（美國(guó)Honeywell公司，批號(hào)20141202），磷酸，超純水，其余試劑均為分析純。

何首烏（批號(hào)13101701）購(gòu)于北京綠野藥業(yè)有限公司，經(jīng)解放軍第302醫(yī)院肖小河研究員鑒定為蓼科植物何首烏P multiflorum的干燥塊根。

2方法

21含量測(cè)定

211樣品的制備取何首烏飲片，按邊長(zhǎng)不同篩選出小塊樣品（08～1 cm）和大塊樣品（16～18 cm）。粗粉和極細(xì)粉的制備是參照2010年版《中國(guó)藥典》凡例中粉末分等標(biāo)準(zhǔn)[31]。精密稱取4種規(guī)格何首烏飲片各60 g，平行操作4份，分別加10倍量蒸餾水，浸泡30 min后，加熱回流提取1 h，趁熱抽濾，冷凍干燥，制得干浸膏，計(jì)算得率，備用。

212對(duì)照品溶液的制備精密稱取二苯乙烯苷等8種對(duì)照品適量，置于同一量瓶中，用甲醇定容至刻度，超聲5 min，得到?jīng)]食子酸1543 mg·L-1，兒茶素2160 mg·L-1，順式二苯乙烯苷1543 mg·L-1，二苯乙烯苷1543 mg·L-1，大黃素8OβD葡萄糖苷926 mg·L-1，大黃素甲醚8OβD葡萄糖苷690 mg·L-1，大黃素476 mg·L-1，大黃素甲醚682 mg·L-1的混合對(duì)照品溶液。

213供試品溶液的制備精密稱取上述4種規(guī)格樣品，分別加10倍量蒸餾水，浸泡30 min，稱重，每個(gè)樣品在煎煮0，15，30，45，60 min時(shí)，補(bǔ)足失重，精密量取200 μL提取液，離心取上清液100 μL，加入量瓶中，定容至刻度線，搖勻，022μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，配制成10 g·L-1（以生藥量計(jì)）的供試品溶液。

214色譜條件流動(dòng)相甲醇（A）01%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，95%～75% B；10～20 min，75%～50% B；20～30 min，50%～30% B；30～35 min，30%～20% B；35～40min，20%～10% B；40～45 min，10% B），流速10 g·L-1，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，進(jìn)樣量10 μL。

215方法學(xué)考察線性關(guān)系的考察：將混合對(duì)照品溶液按214色譜條件進(jìn)樣1，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20 μL，記錄峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密度試驗(yàn)： 取212項(xiàng)的混合對(duì)照品溶液，按214項(xiàng)的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，并計(jì)算RSD。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取213項(xiàng)下供試品溶液，按214項(xiàng)的色譜條件，分別于供試品制備后的0，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批何首烏小塊樣品，按213項(xiàng)的方法平行制備6份煎煮相同時(shí)間點(diǎn)下的供試品溶液，分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算沒食子酸、兒茶素、順式二苯乙烯苷、反式二苯乙烯苷、大黃素8OβD葡萄糖苷、大黃素甲醚8OβD葡萄糖苷、大黃素的RSD。

22不同規(guī)格何首烏飲片煎煮溶出的成分分析

221不同規(guī)格何首烏指紋圖譜的研究將16個(gè)（4種規(guī)格，平行操作4份）何首烏樣品的指紋圖譜導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”軟件（2004A版），通過色譜峰多點(diǎn)校正的方法，對(duì)S1～S16號(hào)何首烏樣品的色譜峰進(jìn)行匹配并自動(dòng)生成對(duì)照指紋圖譜R，以生成的對(duì)照指紋圖譜為對(duì)照，計(jì)算樣品的相似度。

222主成分分析和聚類分析通過建立的指紋圖譜提取對(duì)應(yīng)色譜峰峰面積，采用SIMCAP+110版軟件對(duì)4種規(guī)格16個(gè)何首烏飲片樣品進(jìn)行主成分（principal component analysis，PCA）分析，考察不同規(guī)格何首烏飲片主成分煎煮溶出的總體差異，參數(shù)設(shè)置采用軟件默認(rèn)。通過在隨機(jī)化X變量模型下對(duì)數(shù)據(jù)的解釋程度值（R2X）和在隨機(jī)化Y變量模型下對(duì)模型的預(yù)測(cè)能力參數(shù)值（Q2）評(píng)價(jià)模型質(zhì)量[32]。16個(gè)何首烏樣本采用MetaboAnalyst在線軟件，按照變量間的歐氏距離進(jìn)行在線的分層聚類分析。

23不同規(guī)格何首烏飲片的肝細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

人正常肝細(xì)胞L02細(xì)胞系，在含有10%的胎牛血清、100 U·mL-1的鏈霉素、100 U·mL-1的青霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃，5%CO2條件下進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)操作均在細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期進(jìn)行。

取不同規(guī)格的何首烏樣品煎煮60 min時(shí)的干浸膏，用培養(yǎng)基配制成16 g·L-1（以生藥計(jì)）的何首烏藥液，用022 μm除菌濾膜過濾。將L02細(xì)胞以7 000個(gè)/孔的濃度均勻接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，培養(yǎng)24 h后，吸出培養(yǎng)基，加入配好的何首烏藥液100 μL，每個(gè)樣品重復(fù)6孔，反應(yīng)24 h，棄去藥液，避光條件下加入CCK8，培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h后檢測(cè)450 nm處的吸光度，計(jì)算細(xì)胞抑制率。抑制率=（1-A樣品/A空白）×100%[33]。

24相關(guān)分析

采用SPSS 200軟件，將4種規(guī)格的何首烏，每種規(guī)格4個(gè)樣品，合計(jì)16個(gè)樣品煎煮60 min時(shí)7個(gè)已知成分的含量和其對(duì)應(yīng)的肝細(xì)胞抑制率進(jìn)行逐步回歸分析，通過比較各色譜峰與毒性相關(guān)系數(shù)的大小與正負(fù)分析各成分與肝細(xì)胞毒性的相互關(guān)系[34]，初步闡明何首烏中化學(xué)成分與肝毒性的相關(guān)性。

3結(jié)果

31含量測(cè)定方法學(xué)考察結(jié)果

根據(jù)214項(xiàng)下條件，8種主成分的色譜分離度均大于15，典型色譜圖見圖1。方法學(xué)考察結(jié)果，見表1。本實(shí)驗(yàn)所采用方法能夠有效的將8種對(duì)照品分離，分離效果好，方法操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，由于水提物中蒽醌類成分較低，大黃素甲醚低于檢測(cè)限，可用于何首烏飲片7種成分的含量測(cè)定。

32規(guī)格對(duì)何首烏飲片煎煮溶出的化學(xué)成分影響

按照21項(xiàng)下含量測(cè)定方法，測(cè)定每種規(guī)格何首烏飲片主要成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，得到溶出量隨煎煮時(shí)間的變化規(guī)律，見圖2。何首烏飲片規(guī)格能影響主要成分的煎煮溶出效率，其中粉末狀的飲片煎煮溶出狀態(tài)不同于塊狀飲片，粗粉溶出效率優(yōu)于極細(xì)粉，2種塊狀飲片的溶出效率以小塊兒為優(yōu)。在浸泡30 min時(shí)，極細(xì)粉的主要成分溶出量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于粗粉和塊狀飲片。在煎煮0～15 min階段，粗粉中的主要成分迅速溶出，溶出速率遠(yuǎn)高于極細(xì)粉和塊狀飲片，隨著顆粒尺寸的減小，主要化學(xué)成分的煎出量明顯加快增強(qiáng)，但極細(xì)粉的溶出速率最低。在煎煮15～60 min時(shí)，粉末狀飲片主要成分的溶出速率低于塊狀飲片，其煎煮曲線呈緩慢上升趨勢(shì)。

33HPLC指紋圖譜分析

根據(jù)16個(gè)何首烏樣品指紋圖譜的檢測(cè)結(jié)果，利用相似度軟件，建立了16個(gè)何首烏樣品的指紋圖譜，見圖3，其中R為生成的對(duì)照指紋圖譜，共有色

譜峰17個(gè)，經(jīng)與對(duì)照品對(duì)照，峰1為沒食子酸，峰4為兒茶素，峰6為順式二苯乙烯苷，峰8為反式二苯乙烯苷，峰14為大黃素8OβD葡萄糖苷，峰16為大黃素甲醚8OβD葡萄糖苷，峰17為大黃素。并且通過相似度的比較發(fā)現(xiàn)同一規(guī)格的樣品的相似度高于不同規(guī)格的樣品。

34主成分分析

在222項(xiàng)的方法下進(jìn)行分析，得到R2X=0944，Q2=0879，其中R2X越接近1，表示模型越穩(wěn)定，Q2>05表示預(yù)測(cè)率高，由此可知，該模型穩(wěn)定可靠。主成分分析的PCA得分圖見圖4，對(duì)其進(jìn)行整體性的差異性分析，以平均值為中心，可以看出同一規(guī)格的4個(gè)何首烏樣本之間差異較小，不同規(guī)格何首烏樣品能明顯區(qū)分；并且2種塊狀飲片的化學(xué)成分較為相似，而粗粉和極細(xì)粉何首烏樣品相似。上述研究表明，塊狀飲片之間化學(xué)成分類似，不同于粉狀飲片，兩類飲片在煎煮60 min后的化學(xué)指紋圖譜存在較大差異。

35HPLC指紋圖譜聚類分析

采用歐式距離對(duì)16個(gè)何首烏樣品進(jìn)行聚類，見圖5，16個(gè)何首烏樣本可以分為兩大類，第一類為塊狀飲片（Ⅰ），第二類為粉狀飲片（Ⅱ）。第一大類塊狀飲片中分為兩小類，①樣品S1～S4號(hào)聚為一類，均為大塊飲片，②樣品S5～S8號(hào)聚為一類，均為

小塊飲片。第二大類粉狀飲片中分為2小類，①樣品S9～S12號(hào)聚為一類，均為粗粉，②樣品S13～S16號(hào)聚為一類，均為極細(xì)粉。

36不同規(guī)格何首烏樣品的肝細(xì)胞毒性

通過比較不同規(guī)格何首烏樣品的肝細(xì)胞毒性發(fā)現(xiàn)，規(guī)格大小對(duì)其肝細(xì)胞的毒性有影響。粉狀飲片毒性強(qiáng)于塊狀飲片，見圖6，與大塊樣品比較，小塊樣品無顯著性差異，而粗粉和極細(xì)粉樣品與大塊樣

品具有極顯著性差異（P<001），粉狀藥材之間區(qū)別不明顯。

37多元相關(guān)分析

將煎煮60 min后的不同規(guī)格何首烏7種主要成分的含量，見表2，與肝細(xì)胞毒性進(jìn)行多元線性回歸分析，采用逐步回歸方法，擬合得到方程：Y=0025+2986X2+6043X3-2865X6+3501X7（F=2 160206，P<005），相關(guān)系數(shù)r=0912，其中X2代表兒茶素、X3代表順式二苯乙烯苷、X6代表大黃素甲醚8OβD葡萄糖苷、X7代表大黃素。多元回歸擬合方程中自變量的系數(shù)大小表示該變量

對(duì)因變量的影響程度大小，其中正負(fù)值分別表示正負(fù)相關(guān)性。從得到的擬合方程可以明顯看出兒茶素、順式二苯乙烯和大黃素與細(xì)胞毒性間具有正相關(guān)性，以順式二苯乙烯苷最為相關(guān)，其次為大黃素，兒茶素相關(guān)性較弱，而大黃素甲醚葡萄糖苷則呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)性。分析結(jié)果提示，順式二苯乙烯苷、大黃素、兒茶素可能為導(dǎo)致L02肝細(xì)胞損傷的物質(zhì)基礎(chǔ)。

4討論

目前，在《中國(guó)藥典》中何首烏含量測(cè)定方法項(xiàng)下關(guān)于二苯乙烯苷類和蒽醌類的含量測(cè)定是分開進(jìn)行的，而且結(jié)合型蒽醌的含量是經(jīng)過水解成游離型蒽醌后計(jì)算得出。本研究建立了同時(shí)測(cè)定何首烏8種主要化學(xué)成分的含量測(cè)定方法，能夠快速簡(jiǎn)便的將二苯乙烯苷類和蒽醌類化合物同時(shí)測(cè)出，節(jié)約了實(shí)驗(yàn)時(shí)間與成本。

本實(shí)驗(yàn)研究表明不同規(guī)格何首烏樣品對(duì)肝細(xì)胞毒性有較大影響，粉末狀飲片>塊狀飲片，其中粗粉的水提物毒性最大，說明何首烏經(jīng)打粉后肝細(xì)胞毒性增強(qiáng)。而臨床上很多何首烏致肝損傷患者是采用打粉服用方式，增加了何首烏用藥的風(fēng)險(xiǎn)，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。事實(shí)上，盡管何首烏致肝損傷報(bào)道病例逐年增多，根據(jù)國(guó)家藥品不良反應(yīng)中心和多家醫(yī)院對(duì)不良反應(yīng)報(bào)告、臨床病例和文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，大部分人合理服用何首烏及其制劑是相對(duì)安全的，除了

特異質(zhì)肝損傷[35]，大多數(shù)患者是由于不合理用藥引起的，如沒有醫(yī)生指導(dǎo)下自行超大劑量服藥。因此，建議對(duì)廣大群眾加強(qiáng)合理用藥知識(shí)的普及，臨床上強(qiáng)化何首烏合理用藥管理，規(guī)范何首烏飲片的使用規(guī)格，以確保何首烏臨床用藥安全，避免肝損傷。

本研究經(jīng)過多元相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)順式二苯乙烯苷、大黃素、以及兒茶素與其肝毒性的相關(guān)性較強(qiáng)。何首烏中的主要二苯乙烯類成分2，3，5，4′tetrahydroxystilbene2Oβglucoside是白藜蘆醇的一種類似物，在陽光及紫外燈照射下同樣會(huì)產(chǎn)生其順式異構(gòu)體。有報(bào)道稱白藜蘆醇具有細(xì)胞毒性作用。同時(shí)，白藜蘆醇等某些二苯乙烯類化合物還具有光學(xué)敏感性，在紫外照射下會(huì)出現(xiàn)順反異構(gòu)轉(zhuǎn)換現(xiàn)象，其順式結(jié)構(gòu)細(xì)胞毒性強(qiáng)于反式結(jié)構(gòu)[36]。因此，二苯乙烯苷類化合物要避光保存，何首烏泡酒時(shí)也要避光保存。另外，蒽醌類化合物也是目前推測(cè)與肝毒性相關(guān)的一類物質(zhì)，在何首烏生品中，蒽醌類化合物的含量比蓼科其他常用藥材如大黃、虎杖等低很多。但大黃等其他藥材關(guān)于肝損傷報(bào)道卻很少，所以推測(cè)何首烏的毒性可能并不只是蒽醌類或二苯乙烯類某一種成分的貢獻(xiàn)，可能是不同類物質(zhì)協(xié)同作用的結(jié)果。因此，不同成分以不同配伍比例聯(lián)合后是否協(xié)同增加肝細(xì)胞毒性有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)采用正常人肝細(xì)胞檢測(cè)的細(xì)胞抑制率與臨床肝損傷具有較密切的相關(guān)性，但是，體外肝細(xì)胞培養(yǎng)與體內(nèi)肝細(xì)胞在藥物轉(zhuǎn)化、免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)等方面還存在一定的差異，故篩選確認(rèn)何首烏肝毒性物質(zhì)時(shí)仍需進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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[責(zé)任編輯孔晶晶]