楊 芬,劉金鑫,韋朝陽

HPLC-(UV)-HG-AFS聯(lián)用技術(shù)測定市售紫菜中砷形態(tài)

楊 芬1,2,3,劉金鑫1,2,3,韋朝陽1,2

(1.中國科學(xué)院地理科學(xué)與資源研究所,北京 100101;2.中國科學(xué)院陸地表層格局與模擬重點實驗室，

北京100101;3.中國科學(xué)院大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，北京100049)

為優(yōu)化高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜(HPLC-HG-AFS法)同時測定As(III)、DMA、MMA、As(V)和AsB五種砷形態(tài)的方法，選用不同提取劑和流動相測定了市售紫菜中砷的形態(tài)，考察不同比例甲醇-水溶液作為提取劑、不同流動相對測定紫菜中砷形態(tài)的影響。試驗結(jié)果表明：流動相選擇5 mmol/L (NH4)2HPO4，在pH值為9.0時能有效分離五種砷形態(tài)；市售紫菜中的總砷含量為7.9～13.0 mg/kg，未檢測到As(III)、As(V)、MMA和DMA；通過對比不同比例甲醇-水溶液的提取效果，發(fā)現(xiàn)1∶9甲醇-水溶液和3∶1甲醇-水溶液提取紫菜中砷形態(tài)的提取效果較好。該試驗結(jié)果可為紫菜等植物樣品中砷形態(tài)的提取提供參考。

紫菜；砷形態(tài)；總砷含量；HPLC-HG-AFS；甲醇-水；流動相

砷(As)是一種有毒的類金屬，在環(huán)境中無處不在。研究表明，砷的毒性和其存在形態(tài)密切相關(guān)。毒性最強的砷化氫(AsH3)等氣態(tài)砷在自然界中存在較少，而無機態(tài)的亞砷酸鹽(As(III))和砷酸鹽(As(V))為毒性較強的兩種主要形態(tài)，一甲基胂酸(MMA)和二甲基胂酸(DMA)的毒性較弱，而在一些生物體內(nèi)存在的砷甜菜堿(AsB)、砷膽堿(AsC)以及砷糖類等砷形態(tài)被認為基本無毒[1]。紫菜因富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、不飽和脂肪酸、維生素和礦物質(zhì)，具有重要的營養(yǎng)價值，而深受人們的喜愛而食用，如紫菜湯、壽司等[2]。由于不同形態(tài)砷的毒性差異較大，用總砷含量來評估砷暴露的健康風險還不夠全面，所以對環(huán)境介質(zhì)中不同形態(tài)的砷進行分析具有重要意義。

目前，分析環(huán)境介質(zhì)中砷形態(tài)的方法主要有高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜(或原子吸收光譜)法(HPLC-HG-AFS法、HPLC-HG-AAS法)、高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法(HPLC-ICP-MS法)、高效液相色譜-有機質(zhì)譜法(HPLC-ES-MS法)等聯(lián)用技術(shù)[3]。由于HPLC-HG-AFS法具有分離能力強、操作簡單、價格相對低廉等優(yōu)點，在實驗室比較普及。前人已采用該方法對As(III)、DMA、MMA、As(V)四種砷形態(tài)測定方法進行了研究，但對AsB測定方法的研究較少。另外，隨著砷形態(tài)分析要求的提高，樣品前處理技術(shù)也越來越受到重視，通常對于不同基質(zhì)的砷形態(tài)，提取劑使用不同。為此，本文以紫菜為研究對象，采用不同比例甲醇-水作為提取劑，利用HPLC-(UV)-HG-AFS聯(lián)用技術(shù)，建立了一種同時測定As(III)、DMA、MMA、As(V)和AsB五種砷形態(tài)的分析方法。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品及其前處理

試驗樣品購自北京華潤萬家超市，主要為浪奇、潤之家、新陽洲、塞翁福和富昌五種不同品牌的紫菜，其樣品詳細信息見表1。將購買的紫菜拆封，用高速萬能粉碎機多次磨碎至粉末狀，過0.15 mm篩，編號裝入自封袋放入冰箱冷藏備用。

表1 紫菜樣品相關(guān)信息

1.2 試驗試劑

試驗所用試劑均為分析純或更高純度，超純水(18 MΩ·cm)由超純水機(美國)制得。所用的試管及容器均用10%的硝酸泡制過夜，使用之前用超純水沖洗干凈。主要的化學(xué)藥品為HNO3(優(yōu)級純)、HCl(超純)、H2O2(30%、分析純)、KBH4(分析純)、KOH(優(yōu)級純)、硫脲(分析純)、(NH4)2HPO4(分析純)、甲醇(色譜純，99.9%)。

試驗所用標準物質(zhì)均購自中國計量科學(xué)研究院。測定總砷含量以GSV-2灌木枝葉(GBW07603)為標準物質(zhì)；砷形態(tài)標準物質(zhì)分別為砷酸根溶液標準物質(zhì)[As(V)，GBW08667]、亞砷酸根溶液標準物質(zhì)[As(III)，GBW08666]、一甲基砷溶液標準物質(zhì)(MMA ，GBW08668)、二甲基砷溶液標準物質(zhì)(DMA ，GBW08669)、砷甜菜堿溶液標準物質(zhì)(AsB，GBW08670)。

1.3 試驗方法

1.3.1 總砷含量測試方法

稱取待測樣品200～300 mg放入25 mL試管中，加入高純濃硝酸4 mL，加帶孔玻璃塞，室溫靜置過夜；取下玻璃塞，用電熱板80℃緩慢加熱1～2 h，加入約1 mL雙氧水，加熱電熱板至140℃，消煮至溶液變?yōu)闇\黃透明狀，取出靜置冷卻；用超純水定容到25 mL，4℃貯存待測；取5 mL待測液加入5 mL還原劑(10%HCl+5%硫脲)，混合均勻后(0.5～1 h)上機測試?？偵楹坎捎脷浠锇l(fā)生-原子熒光光譜法(HG-AFS法，北京吉天)測定；樣品砷濃度采用砷濃度標準曲線-熒光強度峰面積法進行計算。1.3.2 砷形態(tài)測試方法

稱取400～500 mg紫菜樣品于50 mL離心管中，分別加入甲醇-水提取劑，在室溫下超聲提取15 min，并以8 000 r/min轉(zhuǎn)速離心分離10 min，轉(zhuǎn)移上清液，每個樣品重復(fù)2次上述提取步驟；合并兩次提取的上清液，用氮吹儀吹趕提取液中的甲醇，并分別濃縮至15 mL，用超純水定容至25 mL；上機測試前過0.22 μm微孔濾膜，取5 mL左右提取液放入冰箱待測。砷形態(tài)采用北京吉天儀器公司S20原子熒光形態(tài)分析儀(HPLC-(UV)-HG-AFS)進行測定，儀器相關(guān)參數(shù)配置見表2。由于AsB需要消解之后才能與還原劑生成可被原子熒光檢測器檢測的砷化物，因此本試驗選用(無)在線紫外消解連接系統(tǒng)。

1.4 HPLC-HG-AFS法測定砷形態(tài)

1.4.1 總砷標準曲線

分別取5 mL的10 ppb、20 ppb、40 ppb、60 ppb、80 ppb、100 ppb的標準溶液，分別加入5 mL的還原劑，混合均勻后(0.5～1 h)上機測試。由標準系列砷濃度與熒光強度所得的總砷含量的回歸方程為I=30.2704C+23.206 7，相關(guān)系數(shù)r=0.998 9[其中，I為熒光強度(mV);C為砷濃度(mg/kg)]?？梢?，在標準系列砷濃度范圍內(nèi)，熒光強度與砷濃度的線性相關(guān)性良好。

表2 HPLC-(UV)-HG-AFS儀器相關(guān)參數(shù)配置

1.4.2 砷形態(tài)標準曲線

圖1 標準系列四種砷形態(tài)的色譜流出圖Fig.1 Chromatograms of the four standard As species

分別取5 mL的10 ppb、40 ppb、80 ppb、100 ppb的標準溶液上機測試，色譜流出圖如圖1所示。由圖1可見，四種形態(tài)砷化合物在陰離子交換柱下能完全分離，并以As(III)、DMA、MMA、As(V)的次序流出色譜柱。由標準系列砷濃度與對應(yīng)的峰面積的回歸方程分別為：As(III)標準系列，S=9 387.8C+3 866.6，相關(guān)系數(shù)r=0.998 7；MMA標準系列，S=9 522.8C+2 996.9，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9；DMA標準系列，S=7 467.6C+3 629.9，相關(guān)系數(shù)r=0.999 3；As(V)標準系列，S=5 407.4C+1 366.3，相關(guān)系數(shù)r=1.000[其中，S為峰面積;C為砷濃度(mg/kg)]。可見，在標準系列砷濃度范圍內(nèi)，峰面積與砷濃度的線性相關(guān)性良好。

1.5 樣品分析質(zhì)量控制

本試驗采用空白值、標準物質(zhì)和平行樣對試驗數(shù)據(jù)進行分析質(zhì)量控制。選用國家標準物質(zhì)(GSV-2 灌木枝葉，GBW07603)進行分析精度驗證，同時選擇富昌紫菜做兩組平行樣進行同步消解測試，并對上機測試的溶液選擇性重復(fù)測定，3次測試結(jié)果的相對標準偏差<5%為合格?？偵楹糠治鲑|(zhì)量控制結(jié)果見表3。

表3 總砷含量分析質(zhì)量控制結(jié)果

2 結(jié)果與分析

2.1 總砷含量分析

對五種不同品牌的紫菜中總砷含量測試結(jié)果見圖2。由圖2可見，紫菜中總砷含量在10 mg/kg左右，幾種品牌紫菜中總砷含量相差不大，其中以新陽洲牌紫菜中砷濃度最低，僅為7.9 mg/kg，而浪奇牌紫菜中砷濃度則最高，為13.0 mg/kg。王亞等[4]用HPLC-HG-AFS法測定了南通產(chǎn)紫菜中總砷含量，其含量范圍為14.0～ 42.1 mg/kg；方軍等[5]用ICP-MS法測定了廣東產(chǎn)紫菜中的總砷含量為33.8 mg/kg；Almela等[6]對在西班牙出售的紫菜中總砷含量進行了研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)來自中國、日本、韓國、西班牙的紫菜產(chǎn)品中總砷含量在18.4～58.3 mg/kg范圍內(nèi)。本試驗測試的紫菜樣品中總砷含量均低于以上文獻報道的總砷含量范圍，可能與紫菜的來源地有關(guān)。

圖2 紫菜樣品中總砷含量Fig.2 Concentrations of total As in porphyra samples

2.2 砷形態(tài)分析

2.2.1 HPLC-(UV)-HG-AFS法測定砷形態(tài)時流動相的選擇

圖3 在線紫外消解下不同pH值流動相五種砷 形態(tài)的色譜流出圖Fig.3 Chromatograms of five As species digested by on-line UV and detected by using mobile phases with different pH values

采用HPLC-(UV)-HG-AFS法，為實現(xiàn)更好地分離As(III)、DMA、MMA、As(V)和AsB五種砷形態(tài)，試驗選用5 mmol/L (NH4)2HPO4(用氨水調(diào)節(jié)pH值分別為8.45、8.65、8.85、9.00)作為流動相，探討不同pH值對砷形態(tài)的分離效果，其五種砷形態(tài)的色譜流出圖見圖3。由圖3可見，在不同pH值下，AsB、As(III)、DMA、MMA和As(V)的峰依次分離，后三種形態(tài)(DMA、MMA、As(V))在不同pH值下均能有效分離，其中AsB的出峰時間與As(III)相近，峰高明顯低于其他四種砷形態(tài)，同時As(V)峰高次之，但其出峰時間可長達24 min；當流動相pH值為8.45、8.65、8.85時As(III)和AsB的分離效果差，而流動相pH值為9.00時則能實現(xiàn)兩者的有效分離。因此，試驗選取5 mmol/L (NH4)2HPO4(用氨水調(diào)節(jié)pH值至9.00)作為流動相，五種砷形態(tài)可依次完全分離，且峰形尖銳、對稱性好。由于As(III)、DMA、MMA和As(V)極易轉(zhuǎn)化，而其他砷形態(tài)(AsB、AsC、三甲基胂氧化物、TETRA、胂糖等)化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，能在低溫下保持形態(tài)多年不變[7]，因此建議在實際砷形態(tài)分析時，待測樣品應(yīng)在第一時間測定As(III)、DMA、MMA和As(V)。2.2.2 不同比例甲醇-水提取劑對砷形態(tài)測試的影響

影響砷形態(tài)測定結(jié)果的因素有很多，主要有提取劑的類型、輔助提取方法、提取時間和溫度等[8]。通常對于不同基質(zhì)，砷形態(tài)提取劑類型選擇有所不同。一般來說，由于許多砷形態(tài)都是水溶性的，因此用純水提取即可，或者用不同比例的甲醇-水提取[9]。對于生物樣品的砷形態(tài)的提取，由于樣品中有機物較多，砷的賦存形式又以有機砷為主，因此最常用的方法就是用不同比例的甲醇-水混合體系(如1∶9、1∶1、9∶1)進行提取，其中以1∶1的甲醇-水體系運用得最多[10]。

本試驗選用不同比例的甲醇-水(純水、1∶9、1∶3、1∶1、3∶1、9∶1)等作為富昌紫菜中砷形態(tài)提取劑，并按照砷形態(tài)測試方法進行測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用不同比例甲醇-水的提取劑，幾種品牌紫菜只在5.6 min時色譜圖就出現(xiàn)一明顯高峰，但可以判定均不是As(III)、DMA、MMA、As(V)和AsB其中的任何一種。按照未知砷形態(tài)的峰形，本試驗紫菜中未知砷形態(tài)部分的數(shù)據(jù)均為HPLC-HG-AFS法測試結(jié)果。不同國家和地區(qū)紫菜產(chǎn)品中砷形態(tài)檢測出無機砷的報道較少，二甲基砷( DMA) 亦有報道，報道最多的是砷糖，其含量一般在90%～98%[5]。目前還缺少砷糖的標準物質(zhì)，相關(guān)文獻報道中基本采用的是將實驗室中從天然物質(zhì)中提取出的四種砷糖化合物(磷酸砷糖PO4-sug、甘油砷糖Gly-sug、硫酸砷糖SO4-sug和磺酸砷糖SO3-sug)作為標準物質(zhì)，對紫菜中的砷形態(tài)進行定性定量分析[11]。采用上述方法，Wei等[12]測得中國紫菜中的砷形態(tài)主要為磷酸砷糖和甘油砷糖，其含量分別為0.3～13.9 mg/kg (干重)和 0.7～6.2 mg/kg；李衛(wèi)華等[13]測得中國不同海域紫菜中砷糖為主要砷形態(tài)，且以磷酸砷糖為主要化合物(0.4～12.7 mg/kg),其次為甘油砷糖(1.0～7.8 mg/kg)。因此，本試驗紫菜中的砷形態(tài)應(yīng)以砷糖形式為主。由于缺少該物質(zhì)的商業(yè)標準物質(zhì)，對其中的砷糖絕對含量無法量化，因而本文只能采用單位質(zhì)量砷糖峰面積來比較幾種品牌紫菜之間砷糖的含量變化。為便于比較，采用極差標準化方法對砷糖峰面積進行歸一化處理，處理后的結(jié)果見表4。通過對比，初步選擇出提取液準確度相對較高的提取劑，即1∶9甲醇-水溶液和3∶1甲醇-水溶液，在此基礎(chǔ)上對所有紫菜樣品進行砷形態(tài)測試。

表4 超純水及不同比例甲醇-水提取下紫菜中砷形態(tài)的分析結(jié)果

注：紫菜樣品為富昌牌；砷糖峰面積標準化后數(shù)據(jù)依據(jù)X’= (X-Xmin)/(Xmax-Xmin)進行標準化計算后得到。

對于甲醇-水不同比例提取劑的選擇，1∶9甲醇-水溶液和3∶1甲醇-水溶液采用HPLC-HG-AFS法測試的色譜圖中砷糖的峰形略有不同，見圖4。總體來說，3∶1甲醇-水溶液在提取過程中比較簡便，但是砷糖的峰形不夠尖銳，峰寬較寬；而1∶9甲醇-水溶液提取后砷糖的峰形較好，但是氮吹過程較長，有可能造成砷的損失。因此，這兩種提取劑各有所長，可根據(jù)實際情況進行選擇使用。

圖4 1∶9和3∶1甲醇-水溶液提取下的砷糖的 色譜流出圖Fig.4 HPLC-HG-AFS chromatograms of As species by using 1∶9 methanol-water and 3∶1 methanol-water mixture

2.2.3 不同品牌紫菜中的砷形態(tài)

本試驗分別用1∶9和3∶1甲醇-水溶液作為提取劑測試不同品牌紫菜中的砷形態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：五種不同品牌紫菜中均沒有檢測出As(III)、DMA、MMA、As(V)，同時砷形態(tài)圖譜與富昌紫菜也完全一致，可判斷也均為砷糖；但是不同品牌紫菜中砷糖相對含量(峰面積)有所差異(見圖5)，對兩組平行數(shù)據(jù)求平均值后發(fā)現(xiàn)，富昌、潤之家、塞翁福和新陽洲四種品牌紫菜中砷糖相對含量并沒有明顯差異，均在550左右，而浪奇牌紫菜中砷糖相對含量最低，僅達到250左右。

圖5 1∶9和3∶1甲醇-水溶液提取下砷糖相對含量 (峰面積)對比Fig.5 Comparison of relative content (peak areas) of arsenosugars by using 1∶9 methanol-water and 3∶1 methanol-water mixture

2.3 紫菜中總砷含量與砷形態(tài)分析

對五種不同品牌紫菜中總砷含量以及1∶9和3∶1甲醇-水溶液提取砷形態(tài)所得的砷糖相對含量分別進行標準化(1-2型)處理，即代入公式X’=1+(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)后，其計算結(jié)果見圖6。由圖6可見，富昌、潤之家、塞翁福三種品牌紫菜中總砷含量與砷糖相對含量呈現(xiàn)很好的一致性，指示這三種品牌紫菜中砷形態(tài)主要以砷糖形式存在；而浪奇牌紫菜中總砷含量相對最高，但是砷糖相對含量卻最低，新陽洲牌紫菜中砷糖相對含量較高，但是其總砷含量卻是五種紫菜中最低的，因此浪奇牌紫菜中除砷糖外，還應(yīng)該存在有其他形態(tài)的砷。本試驗未在幾種紫菜樣品中測出無機砷和甲基砷，采用HPLC-HG-AFS法對這幾種形態(tài)砷的檢測限較低，本試驗也進行了可靠的分析質(zhì)量控制，因此不能排除浪奇牌紫菜中還存在其他形態(tài)砷的可能性；而總砷含量最低的新陽洲品牌紫菜，其砷糖相對含量并不是最低的，反映各來源紫菜樣本中砷糖形態(tài)的比例有很大的不同。

圖6 標準化(1-2型)處理后不同提取劑下5種品牌紫菜中 總砷含量與砷糖相對含量的對比Fig.6 Comparison of relative content of total arsenic and arsenosugars after standardization in five bands of Porphyra by different extractants

3 結(jié)論與討論

砷元素長期以來一直被視為是一種對人體有害的毒性元素，從本試驗檢測結(jié)果來看，紫菜中砷含量在10 ppb左右，并且主要是以無毒的砷糖形式存在。浪奇牌紫菜中可能存在除無機砷、甲基砷以及砷糖以外的砷形態(tài)，還有待進一步研究。本試驗采用不同提取劑提取幾種品牌紫菜中砷形態(tài)均未檢測出無機砷和甲基砷，而食品中對人體有害的砷形態(tài)主要為無機砷和甲基砷，尤其是無機的亞砷酸[1]，因此長期食用這幾種品牌紫菜不會對人體健康造成危害。由于砷形態(tài)的提取受多種因素的影響，本試驗通過不同比例的甲醇-水溶液提取紫菜中的砷形態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1∶9甲醇-水溶液和3∶1甲醇-水溶液對砷形態(tài)的提取效果相對較好，對于今后的紫菜等植物樣中砷形態(tài)的提取等研究具有參考價值。另外，本文嘗試利用HPLC-UV-HG-AFS法同時測定As(III)、DMA、MMA、As(V)、AsB五種砷形態(tài)，并取得了一定的效果，可以推廣應(yīng)用。

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Arsenic Speciation in Commercial Porphyra by HPLC-(UV)-HG-AFS

YANG Fen1,2,3,LIU Jinxin1,2,3,WEI Chaoyang1,2

(1.InstituteofGeographicSciencesandNaturalResourcesResearch,ChineseAcademyofSciences,Beijing100101,China;2.KeyLaboratoryofLandSurfacePatternandSimulation,ChineseAcademyofSciences,Beijing100101,China;3.CollegeofResourcesandEnvironment,ChineseAcademyofSciences，Beijing100049,China)

In order to optimize the method of high performance liquid chromatography and hydride generation atomic fluorescence spectrometry (HPLC-HG-AFS) for simultaneous determination of five arsenic species including AsB, As (III), As (V), MMA, DMA and AsB,this paper uses different extractants and mobile phases to detect arsenic speciation in commercialPorphyra,and investigates the influence of different extractants in various methanol-water ratios and different mobile phases on the arsenic speciation detection.The experimental results indicate that the five arsenic compounds can be effectively separated when the samples are digested by on-line UV with a mobile phase of 5 mmol/L (NH4)2HPO4and pH being 9.0;the total arsenic concentration varies from 7.9 mg/kg to13.0 mg/kg, while As (III)，As (V)，MMA and DMA are not found in allPorphyrasamples;the extraction effect is relatively good when extracting arsenic species fromPorphyrawith 1∶9 (v/v) methanol-water and 3∶1 methanol-water mixture. The experimental results can provide a reference for extracting arsenic species from botanic samples such asPorphyra.Key words:porphyra;arsenic speciation;total arsenic content;HPLC-HG-AFS;methanol-water mixture;mobile phase

1671-1556(2016)02-0060-06

2015-08-18

2016-01-09

國家自然科學(xué)基金項目(41271477、41571470)

楊 芬(1989—)，女，博士研究生，主要研究方向為環(huán)境中砷的遷移轉(zhuǎn)化與生態(tài)效應(yīng)。E-mail:yangf.13s@igsnrr.ac.cn

X836；O65

A

10.13578/j.cnki.issn.1671-1556.2016.02.012