陳柳萌，桂 倫,馬吉平，陳慶隆，陳 葵，李婉晴，張 誠*

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)應(yīng)用微生物研究所，江西 南昌 330200；2.江西省山江湖開發(fā)治理委員會(huì)辦公室，江西 南昌 330046；

3.江西中醫(yī)藥大學(xué) 附屬醫(yī)院,江西 南昌 330004)

基于厭氧生物制氣的糙皮側(cè)耳預(yù)處理甘蔗葉工藝

陳柳萌1，桂 倫1,馬吉平1，陳慶隆1，陳 葵2，李婉晴3，張 誠1*

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)應(yīng)用微生物研究所，江西 南昌 330200；2.江西省山江湖開發(fā)治理委員會(huì)辦公室，江西 南昌 330046；

3.江西中醫(yī)藥大學(xué) 附屬醫(yī)院,江西 南昌 330004)

為獲得基于厭氧發(fā)酵發(fā)酵產(chǎn)沼氣為目標(biāo)的糙皮側(cè)耳預(yù)處理甘蔗葉工藝，以糙皮側(cè)耳對甘蔗葉的降解特性試驗(yàn)為基礎(chǔ)，研究了堿處理、接種量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)濕度等因素對菌絲生長的影響，確定了預(yù)處理工藝，并通過厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明：當(dāng)預(yù)處理?xiàng)l件為1% Ca(OH)2浸泡1 h、接種量50%、培養(yǎng)溫度28 ℃、培養(yǎng)濕度60%時(shí)；甘蔗葉經(jīng)糙皮側(cè)耳預(yù)處理25 d，可有效改善甘蔗葉的厭氧產(chǎn)氣性能，沼氣總量為33957 mL、發(fā)酵物料的木質(zhì)素降解率為52.1%，分別較對照組提高了28.9%、26.2%。

厭氧制氣；糙皮側(cè)耳；甘蔗葉；預(yù)處理；工藝

農(nóng)作物秸稈問題被認(rèn)為是比較突出的農(nóng)業(yè)環(huán)境問題，特別是隨著作物產(chǎn)量的連年提高，農(nóng)作物秸稈量超過9億t，其中可以收集的秸稈量達(dá)8億t。秸稈中的3種主要成分——纖維素、半纖維素和木質(zhì)素均為具有復(fù)雜空間結(jié)構(gòu)的高分子聚合物，它們相互結(jié)合形成復(fù)雜的超分子復(fù)合物，并進(jìn)一步形成各種各樣的植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)[1]，這些復(fù)雜的三維空間結(jié)構(gòu)使植物體得以避免微生物及各種物理、化學(xué)因素的傷害。這種復(fù)雜結(jié)構(gòu)帶來的難降解性也正是木質(zhì)纖維素材料一直未得到有效利用的主要原因[2]。

沼氣作為一種重要的生物質(zhì)能源，是可再生能源的重要組成部分[3]。多原料混合制氣是未來沼氣工程的發(fā)展趨勢，可有效解決當(dāng)前沼氣工程因原料單一(目前以畜禽糞便為主)而無法實(shí)現(xiàn)規(guī)?；⒅苣昊\(yùn)行。因此，強(qiáng)化農(nóng)作秸稈的可消化性，打破木質(zhì)素對纖維素和半纖維素的保護(hù)，是秸稈類物質(zhì)進(jìn)行厭氧發(fā)酵制沼氣的關(guān)鍵。

本文以實(shí)驗(yàn)室收集的糙皮側(cè)耳(H8)為預(yù)處理菌株，開展甘蔗葉(一種主要的熱帶作物秸稈)預(yù)處理工藝研究。即在糙皮側(cè)耳對甘蔗葉的降解特性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，研究堿處理、接種量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)濕度等因素對菌絲生長的影響，以此建立預(yù)處理工藝，最終通過厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣試驗(yàn)分析預(yù)處理效果。

1 材料與方法

1.1 材料

甘蔗葉收集自中國熱帶農(nóng)科院加工所，為自然風(fēng)干、無霉變，剪碎至1～2 cm后備用。糙皮側(cè)耳(Pleurotusostreatus)由江西省農(nóng)科院農(nóng)業(yè)應(yīng)用微生物研究所食用菌研究室提供，編號(hào)H8。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 試劑 所用試劑：蔗糖、硫酸二氫鉀、七水合硫酸鎂、乙酸、乙酸鈉、酒石酸、酒石酸鈉、藜蘆醇、乳酸、乳酸鈉、硫酸錳、雙氧水、ABTS、鹽酸、硫酸、十六烷基三甲基溴化銨、十二烷基硫酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉、硼酸鈉、乙二醇乙醚、無水磷酸氫二鈉。

1.2.2 儀器 UV 765紫外可見光光度計(jì)、電熱鼓風(fēng)干燥箱、馬弗爐、立式壓力蒸汽滅菌器、人工氣候培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、H/T16MM臺(tái)式高速離心機(jī)、沼氣厭氧發(fā)酵裝置、燒杯、錐形瓶、接種針、電子天平、培養(yǎng)皿、打孔器、搖床。

1.2.3 培養(yǎng)基 PDA固體培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂16 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，ddH2O 1000 mL，pH自然。

PDA液體培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，ddH2O 1000 mL，pH自然。

Krik培養(yǎng)基[4]：酒石酸銨0.22 g，K2HPO40.2 g，MgSO40.05 g，CaCl20.01 g，VB10.001 g，微量元素溶液10 mL，ddH2O 990 mL，pH 7.0。

微量元素溶液：MgSO43.0 g，MnSO40.5 g，NaCl 1 g,CoSO4100 mg，CaCl283 mg,ZnSO4100 mg,CuSO4·5H2O 100 mg，F(xiàn)eSO4·5H2O 100 mg，AlK(SO4)210 mg，H3BO310 mg，NaMoO410 mg，ddH2O 1000 mL,pH 7.0。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 糙皮側(cè)耳對已滅菌甘蔗葉的木質(zhì)纖維素降解特性試驗(yàn) 用無菌接種針將糙皮側(cè)耳菌株從保存的斜面上挑出，轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基平板上活化，28 ℃下培養(yǎng)7 d；然后用已滅菌的打孔器截取已長滿菌絲的菌塊(Φ=9 mm)，備用。

將5 g剪碎至1～2 cm長的甘蔗葉與7.5 mL的Krik液體培養(yǎng)基攪拌均勻后，裝入250 mL的錐形瓶中；121 ℃下滅菌30 min；隨即接入已制備好的糙皮側(cè)耳菌塊6個(gè)，28 ℃下靜置培養(yǎng)，濕度保持在60%。從第3天起，每隔4 d測定錐形瓶中樣品的木質(zhì)素含量[5-6]、木質(zhì)素酶活力、纖維素酶活力，連續(xù)監(jiān)測7次，即第27天結(jié)束。本次試驗(yàn)共制作21個(gè)樣品瓶，每次取樣時(shí)隨機(jī)挑選3個(gè)樣品瓶進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果取平均值。

公式中mn為第n天時(shí)的木質(zhì)素含量，n=3,7,11,15,19,23,27。

木質(zhì)素酶活力包括漆酶(Lac)[7]、錳過氧化物酶(MnP)[8]和木質(zhì)素過氧化物酶(Lip)的酶活力[9]。纖維素酶活力包括濾紙酶(FPase)[10]、內(nèi)切酶(CMCase)[10]、β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)[10]和半纖維素酶(Xylanase)[11]的酶活力。

1.3.2 堿處理未滅菌甘蔗葉對糙皮側(cè)耳菌絲生長的影響 取已長滿菌絲的菌塊(見1.3.1)3個(gè)，接入PDA液體培養(yǎng)基，28 ℃下?lián)u瓶(轉(zhuǎn)速為120 r/min)培養(yǎng)7 d后，過濾，獲得球狀菌絲體，備用。

取30 g剪碎至1～2 cm的甘蔗葉(未滅菌)分別采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% NaOH、1% Ca(OH)2、H2O(對照組)浸泡處理1 h，后用蒸餾水洗至中性，55～60 ℃烘干。隨后與45 mL的Krik液體培養(yǎng)基攪拌均勻，裝入1 L的燒杯中；按70%的接種量(菌絲體按濕重計(jì)算)接入糙皮側(cè)耳菌絲體，并攪拌均勻；最后采用塑料薄膜封口(薄膜上扎孔)，在人工氣候箱中28 ℃下靜置培養(yǎng)，濕度控制在60%左右，試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。連續(xù)培養(yǎng)25 d，每天觀察糙皮側(cè)耳菌絲的生長情況；并檢測分析甘蔗葉在堿處理前、后及第25天甘蔗葉中木質(zhì)素、纖維素、半纖維素的含量。

1.3.3 糙皮側(cè)耳預(yù)處理甘蔗葉的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 糙皮側(cè)耳預(yù)處理甘蔗葉單因素試驗(yàn)方法見1.3.2，其中甘蔗葉處理采用1% Ca(OH)2浸泡1 h。針對影響糙皮側(cè)耳菌絲生長繁殖的3個(gè)因素：接種量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)濕度，分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)。(1)接種量單因素試驗(yàn)：固定培養(yǎng)溫度28 ℃、培養(yǎng)濕度60%，分別觀察接種量為30%、50%、70%、90%條件下，糙皮側(cè)耳菌絲的萌發(fā)及生長情況。(2)培養(yǎng)溫度單因素試驗(yàn)：固定接種量70%、培養(yǎng)濕度60%，分別觀察培養(yǎng)溫度為23、28、33、38 ℃條件下，糙皮側(cè)耳菌絲的萌發(fā)及生長情況。(3)培養(yǎng)濕度(相對濕度)單因素試驗(yàn)：固定接種量70%、培養(yǎng)溫度28 ℃，分別觀察培養(yǎng)濕度為45%、60%、75%、90%條件下，糙皮側(cè)耳菌絲的萌發(fā)及生長情況。統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)重復(fù)性，即在3次重復(fù)中，糙皮側(cè)耳菌絲完全長滿甘蔗葉培養(yǎng)基的個(gè)數(shù)。

1.3.4 糙皮側(cè)耳預(yù)處理對甘蔗葉厭氧產(chǎn)沼氣特性的影響 甘蔗葉經(jīng)1% Ca(OH)2浸泡1 h后，接種量按50%比例接入糙皮側(cè)耳菌絲體，在培養(yǎng)濕度60%、28 ℃的條件下靜置培養(yǎng)25 d，備用。

取已預(yù)處理25 d的甘蔗葉與豬糞混合均勻(控制C∶N=25∶1、固形物含量(TS%)為20%,按接種量30%的比例混入接種污泥，攪拌均勻后裝入2 L的厭氧反應(yīng)瓶。在38 ℃條件下，進(jìn)行厭氧產(chǎn)沼氣試驗(yàn)。以沼氣總產(chǎn)量、甲烷含量、木質(zhì)素降解率為評價(jià)指標(biāo)，并結(jié)合日產(chǎn)沼氣速率綜合評價(jià)糙皮側(cè)耳對甘蔗葉的預(yù)處理效果。對照組甘蔗葉不作預(yù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 糙皮側(cè)耳對已滅菌甘蔗葉的木質(zhì)纖維素降解能力的測定

糙皮側(cè)耳能夠利用甘蔗葉為底物進(jìn)行生長繁殖，說明其能夠分泌木質(zhì)纖維素降解酶類。從前27 d的酶活力檢測數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)(表1)：在甘蔗葉培養(yǎng)基上，可檢測出3種木質(zhì)素降解酶活力，且3種木質(zhì)素降解酶活力均表現(xiàn)出先升高、后降低的變化趨勢，其中錳過氧化物酶(MnP)和木質(zhì)素過氧化物酶(Lip)的酶活力表現(xiàn)較為突出，在第11天達(dá)到產(chǎn)酶高峰，酶活力分別為32.42、46.52 U/g；而漆酶(Lac)的活力表現(xiàn)較弱，在第7天達(dá)到產(chǎn)氣酶高峰，酶活力僅為2.88 U/g。同時(shí)，隨著降解時(shí)間的延長，甘蔗葉中木質(zhì)素降解率逐漸提高，在第23天時(shí)達(dá)到55.31%，隨后降解率變化趨于穩(wěn)定；并且在降解過程中，木質(zhì)素降解率的增幅與木質(zhì)素過氧化物酶(Lip)、錳過氧化物酶(MnP)的活力變化存在顯著正相關(guān)性(圖1)，R2分別為0.892、0.629，說明甘蔗葉中木質(zhì)素的降解主要依賴于上述2種酶。因此，本研究在后續(xù)試驗(yàn)中確定糙皮側(cè)耳的預(yù)處理周期為25 d。

表1 糙皮側(cè)耳降解甘蔗葉過程中各項(xiàng)指標(biāo)的檢測結(jié)果

注：/表示未檢測出酶活力。

圖1 木質(zhì)素降解率的增幅與MnP、

此外，3種纖維素酶活力未被檢出，而半纖維素酶(Xylanase)在第23天檢出，但酶活力較低，為3.1 U/g，表明糙皮側(cè)耳在降解甘蔗葉的前期以木質(zhì)素降解酶類分泌為主，具有優(yōu)先降解木質(zhì)素的能力，這與孫江慧[12]、王宏勛[13]等的試驗(yàn)結(jié)論一致。

2.2 堿處理未滅菌甘蔗葉對糙皮側(cè)耳菌絲生長的影響試驗(yàn)

由表2可知，甘蔗葉的堿處理對糙皮側(cè)耳菌絲的生長發(fā)育有促進(jìn)作用，無論是菌絲生長情況還是木質(zhì)素含量的降低幅度均優(yōu)于對照組。其中，NaOH+H8處理的影響最為明顯，第2天就出現(xiàn)菌絲萌發(fā)點(diǎn)；第5天甘蔗葉表面均長滿菌絲體，較H8組提前了5 d。Ca(OH)2+H8處理的影響次之，菌絲萌發(fā)和長滿菌絲體的時(shí)間點(diǎn)分別為第3天、第7天。這可能是由于甘蔗葉的物質(zhì)結(jié)構(gòu)(包括秸稈表面的蠟質(zhì)層)在堿處理后遭到破壞，強(qiáng)化了糙皮側(cè)耳菌絲在甘蔗葉表面的附著和生長；同時(shí)，甘蔗葉表面的土著微生物在堿性環(huán)境下又遭受不同程度的抑制或滅活，極大地削弱其對糙皮側(cè)耳菌絲生長的拮抗作用。

對比分析纖維素、半纖維素含量還可發(fā)現(xiàn)(表3)：(1)纖維素含量在試驗(yàn)過程中無明顯變化，這說明纖維素的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)對堿性環(huán)境在短時(shí)間內(nèi)有一定的耐受力；此外，糙皮側(cè)耳在菌絲生長前期，不會(huì)產(chǎn)生纖維素降解酶類。(2)半纖維素含量的下降幅度較大，這說明木質(zhì)素結(jié)構(gòu)在遭到破壞同時(shí)，包裹的纖維素和半纖維素得到釋放。半纖維素溶于堿性溶液的特性，使其在堿處理過程中，含量發(fā)生了不同程度的下降；并在隨后的培養(yǎng)過程中被糙皮側(cè)耳菌絲分解利用，因此，第25天的半纖維素含量不足堿處理前的50%。

綜合上述分析結(jié)果，本研究選擇成本更為低廉、環(huán)境承載壓力更小的Ca(OH)2進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。主要因素：一是對分析第25天木質(zhì)素、纖維素和半纖維素含量的差異可知，2種堿處理方式所產(chǎn)生的最終效果無明顯差異；二是使用Ca(OH)2帶來的環(huán)境污染和運(yùn)行成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于NaOH。

表2 堿處理對糙皮側(cè)耳菌絲生長繁殖的影響

注：+、++、+++分別表示甘蔗葉培養(yǎng)基表面出現(xiàn)5個(gè)以下、≥5個(gè)、完全長滿菌絲萌發(fā)點(diǎn)，-表示沒有菌絲萌發(fā)點(diǎn)。

表3 堿處理對甘蔗葉中木質(zhì)素、纖維素、半纖維素降解效果的影響

%

2.3 影響糙皮側(cè)耳菌絲生長的單因素試驗(yàn)

由表4可知：當(dāng)接種量≥50%、培養(yǎng)溫度在23～33 ℃、培養(yǎng)濕度在60%～75%時(shí)，糙皮側(cè)耳菌絲生長良好，均能在7～10 d長滿整個(gè)甘蔗葉固體培養(yǎng)基，而且試驗(yàn)重復(fù)性好。此外，我國甘蔗主產(chǎn)區(qū)地處亞熱帶地區(qū)，預(yù)處理甘蔗葉所需的溫度(23～33 ℃)和濕度(60%～75%)等條件無需過高能耗即可實(shí)現(xiàn)，這表明預(yù)處理成本可控，具備規(guī)?；瘧?yīng)用的潛力。

表4 影響糙皮側(cè)耳菌絲生長的單因素試驗(yàn)結(jié)果

注：/表示試驗(yàn)處理未達(dá)成目標(biāo)。試驗(yàn)重復(fù)性：在3個(gè)試驗(yàn)重復(fù)中，菌絲完全長滿培養(yǎng)基的個(gè)數(shù)。

2.4 糙皮側(cè)耳預(yù)處理對甘蔗葉厭氧產(chǎn)沼氣特性的影響

由表5可知：糙皮側(cè)耳預(yù)處理對甲烷平均含量無顯著性影響(P>0.05)，但對沼氣總產(chǎn)量(33957 mL)和木質(zhì)素降解率(52.1%)影響比較明顯，較對照組分別提高了28.9%、26.2%。

表5 糙皮側(cè)耳預(yù)處理甘蔗葉產(chǎn)沼氣總產(chǎn)量及甲烷含量

此外，從日產(chǎn)沼氣速率數(shù)據(jù)還可發(fā)現(xiàn)(圖2)：糙皮側(cè)耳預(yù)處理主要影響厭氧發(fā)酵過程的前半段(前30 d)，盡管H8和對照兩組的日產(chǎn)氣趨勢基本一致，分別在第7、25天出現(xiàn)2次產(chǎn)氣峰。但H8組的日產(chǎn)氣量要明顯高于對照組，且基本維持在600 mL/d以上，而對照組在2個(gè)產(chǎn)氣峰之間(第8～22天)出現(xiàn)一個(gè)較為明顯的產(chǎn)氣低谷。這說明糙皮側(cè)耳預(yù)處理甘蔗葉可有效地破壞木質(zhì)素結(jié)構(gòu)，將纖維素和半纖維素提前釋放，進(jìn)而提高發(fā)酵物料的利用率，改善了甘蔗葉的厭氧產(chǎn)沼氣性能。

圖2 糙皮側(cè)耳預(yù)處理甘蔗葉對其產(chǎn)沼氣特性的影響

3 討論

產(chǎn)酶試驗(yàn)表明，糙皮側(cè)耳在降解甘蔗葉的前期以木質(zhì)素降解酶類分泌為主，具有優(yōu)先降解木質(zhì)素的能力，符合以厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣為目標(biāo)的預(yù)處理工藝需求。厭氧發(fā)酵試驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)：糙皮側(cè)耳預(yù)處理，可有效地提高甘蔗葉的利用率和厭氧產(chǎn)沼氣能力。預(yù)處理?xiàng)l件：甘蔗葉經(jīng)1% Ca(OH)2浸泡1 h后，接種量按50%比例接入糙皮側(cè)耳菌絲體，在培養(yǎng)濕度60%、28 ℃條件下靜置培養(yǎng)25 d，其厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣總量為33957 mL、發(fā)酵物料的木質(zhì)素降解率為52.1%，分別較對照組提高了28.9%、26.2%。此外，我國甘蔗主產(chǎn)區(qū)地處亞熱帶地區(qū)，預(yù)處理甘蔗葉所需的溫度和濕度等條件無需過高能耗和特殊設(shè)備即可實(shí)現(xiàn)，預(yù)處理成本可控、適應(yīng)性廣，且具備規(guī)?；瘧?yīng)用的潛力。

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Pretreatment Technology of Sugarcane Leaf withPleurotusostreatusBased on Anaerobic Biogasification

CHEN Liu-meng1, GUI Lun1, MA Ji-ping1, CHEN Qing-long1,CHEN Kui2, LI Wan-qing3, ZHANG Cheng1*

(1. Institute of Applied Agricultural Microorganism, Jiangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanchang 330200, China; 2. Office of the Mountain-River-Lake Development Committee of Jiangxi Province, Nanchang 330046, China; 3. Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine Affiliated Hospital, Nanchang 330004, China)

In order to obtain anaerobic fermentation biogas production of sugarcane leaves pretreated byPleurotusostreatus, based on the degradation characteristics ofPleurotusostreatuson sugarcane leaves, the effects of alkali treatment, inoculation amount, temperature, humidity and other factors on the growth of mycelia were studied, determined the pretreatment process, and verified the biogas test by anaerobic fermentation. The results showed that the pretreatment conditions were soaked 1 hour in 1% Ca(OH)2, inoculation amount 50%, culture temperature 28 ℃, and humidity 60%, sugarcane leaves pretreated byPleurotusostreatusfor 25 days, which improved the anaerobic biogasification efficiency, the biogas production was 33957 mL and degradation rate of volatile subtract was 52.1%, which increased by 28.9% and 26.2% respectively compared with the control group.

Anaerobic biogasification;Pleurotusostreatus; Sugarcane leaf; Pretreatment; Technology

2015-09-06

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201203072)；科技部國際科技合作項(xiàng)目(2012DFA91160、SQ2013Z0C500005)；國家科技支撐

計(jì)劃項(xiàng)目(2014BAC04B02)；江西省科技廳對外合作技術(shù)項(xiàng)目(20141BDH80018)。

陳柳萌(1981─)，男，江西贛州人，副研究員，碩士，主要從事農(nóng)村能源方面的研究。*通訊作者：張誠。

S216.4

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1001-8581(2016)03-0082-05

曾小軍)