華智銳,李小玲

(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院,陜西 商洛 726000)

商洛野生蕨菜多糖提取及其抗氧化特性研究

華智銳,李小玲

(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院,陜西 商洛 726000)

以商洛野生蕨菜為實驗材料，通過單因素實驗和正交實驗研究了用堿提法提取多糖的最佳條件，比較了3種方法提取多糖的效果，并測定了蕨菜多糖的抗氧化性。研究結(jié)果表明：堿提法的最優(yōu)條件為溫度75 ℃、時間80 min、料液比1∶13、氫氧化鈉濃度0.4 mol/L；水提法、堿提法和超聲波提取法的多糖提取率分別為7.37%、20.436%和25.694%;商洛野生蕨菜多糖對超氧陰離子和羥基自由基的清除能力隨著其濃度的升高而增強。

商洛；野生蕨菜;多糖;提取;抗氧化特性

蕨菜(Pteridiumaquilinum)屬于蕨類植物門蕨綱鳳尾蕨科的多年生草本植物,別名拳芽、拳頭菜、如意菜等,生長于陽光充足的山坡或濕度較高的叢林茂密地區(qū)。蕨菜廣泛分布于全球亞熱帶、暖溫帶和溫帶地區(qū),在我國分布極其廣泛,東北、華北、西北地區(qū)都有分布,且產(chǎn)量較高,是我國傳統(tǒng)的大宗森林野生蔬菜之一,有“山菜之王”之美譽[1]。

蕨菜有很高的營養(yǎng)價值,含有多種維生素、氨基酸、蛋白質(zhì)以及對人體有重要作用的微量元素。除此之外,蕨菜還有藥用價值,其全草入藥,具有清熱利濕、消腫、安神的功效[2]。將蕨菜制成茶飲品,其還具有止嘔、殺菌、滋補、開胃等作用[3-5]。蕨菜的食用部分為其幼嫩莖,其多糖含量豐富,具有多種積極作用。多糖可作為免疫調(diào)節(jié)劑激活巨噬細胞、T淋巴細胞、LAK細胞等多種免疫細胞,促進生產(chǎn)細胞因子,活化補體,而且具有抗腫瘤、抗感染、抗氧化、抗消化性潰瘍、降血糖血脂等作用[6-7]。

近年來國內(nèi)學(xué)者對多糖的研究較多,例如：周林珠等[8]綜述了多糖抗氧化性進展；李粉玲等[9]研究了紅豆多糖抗氧化性；孟思彤等[10]研究了多糖的生物活性。商洛地處秦嶺南脈,處于北亞熱帶與暖溫帶交接地區(qū),氣候溫和,雨量充沛,因得天獨厚的自然環(huán)境和氣候條件而盛產(chǎn)蕨菜[11]。商洛蕨菜“商芝”是地方傳統(tǒng)名菜,歷史悠久。但迄今有關(guān)蕨菜資源開發(fā)利用方面的研究甚少,僅張云等[11]研究了商洛野生蕨菜資源的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)；朱小強等[12]研究了商洛蕨菜的采收與加工；李彬[13]研究了蕨菜的護色工藝。筆者通過比較蕨菜多糖的不同提取方法,篩選出商洛蕨菜多糖的最佳提取方法,并進一步研究了其多糖濃度與抗氧化特性的關(guān)系,旨在為今后合理開發(fā)商洛蕨菜的食用和藥用價值提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試蕨菜于4月14日早上采于商洛市商州區(qū)紅升村。將新鮮蕨菜用保鮮膜小心包好,裝入紙箱中快速運回實驗室,經(jīng)過生物學(xué)院中心實驗室鑒定為蕨類植物門蕨綱真蕨目鳳尾蕨科蕨菜種。

1.2 方法

1.2.1 葡萄糖標準曲線的制作 稱取0.1175 g葡萄糖,用蒸餾水溶解，定容到1000 mL,即配制成0.1175 g/L的葡萄糖標準液。取6支試管(編號為1～6號),分別加葡萄糖標準液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL,蒸餾水1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8 mL,6%苯酚溶液各1.0 mL，濃硫酸各5.0 mL，配制成6個濃度。搖勻后靜置20 min,在490 nm處測量各試管中溶液的吸光度值(A490),再根據(jù)葡萄糖濃度和吸光度值(A490)做出葡萄糖標準曲線。

1.2.2 材料預(yù)處理 將采集回來的新鮮蕨菜去除木質(zhì)化老莖,取其頂芽以下15 cm部分,清洗干凈,使其自然晾干。切成5 cm左右的小段,于干燥箱中70 ℃過夜烘干以去除細胞內(nèi)自由水。用萬能粉碎機打成粉末,過40目篩后置于干燥箱中105 ℃烘制4 h,以除去細胞內(nèi)的結(jié)合水。置于干燥環(huán)境保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 用水提法提取商洛野生蕨菜多糖 稱取5 g蕨菜干粉置于250 mL燒杯中,加入94 mL蒸餾水,于水浴鍋中62.5 ℃水浴5.9 h。將提取液離心2次,轉(zhuǎn)速為4000 r/min,時間10 min,保留上清液。吸取上清液1 mL定容至20 mL,取2 mL，加入1.0 mL 6%的苯酚和5.0 mL濃硫酸,搖勻后靜置30 min后在490 nm處測量吸光度。根據(jù)吸光度得到多糖濃度,再利用以下公式求出提取率：提取率(%)=[(C×V×N)/M樣],其中C為供試品溶液的多糖濃度,V為多糖提取液體積,N為稀釋倍數(shù),M樣為蕨菜粉末的質(zhì)量。

1.2.4 通過單因素實驗和正交實驗優(yōu)化堿提法

1.2.4.1 NaOH濃度對堿提法提取率的影響 取5支試管,編號1～5,分別加入濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L的NaOH溶液7 mL,加入蕨菜粉末0.5 g,在40 ℃水浴鍋中保溫1 h。將各試管提取液離心2次,轉(zhuǎn)速為4000 r/min,時間為10 min,保留上清液。吸取上清液1 mL定容至20 mL,再取1.0 mL，加5 mL相應(yīng)濃度的NaOH，搖勻。取2 mL稀釋液，加入1.0 mL 6%的苯酚和5.0 mL濃硫酸,搖勻后靜置30 min,然后在490 nm處測量吸光度。根據(jù)1.2.3中的提取率公式算出提取率。

1.2.4.2 料液比對堿提法提取率的影響 取5支試管,編號6～10,分別加入濃度為0.2 mol/L的氫氧化鈉5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 mL,加入蕨菜粉末0.5 g,在40 ℃水浴鍋中保溫1 h。將提取液離心2次,轉(zhuǎn)速為4000 r/min,時間為10 min,保留上清液。吸取上清液1 mL,定容至20 mL,再取1.0 mL,加5 mL相應(yīng)濃度的NaOH,搖勻。取2 mL稀釋液,加入1.0 mL 6%的苯酚和5.0 mL濃硫酸,搖勻后靜置30 min,然后在490 nm處測量吸光度。根據(jù)1.2.3中的提取率公式算出提取率。

1.2.4.3 保溫時間對堿提法提取率的影響 取5支試管,編號10～15,均加入濃度為0.2 mol/L的氫氧化鈉溶液7.0 mL,加入蕨菜粉末0.5 g,在40 ℃水浴鍋中分別保溫0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h,將各試管提取液離心2次,轉(zhuǎn)速為4000 r/min,時間為10 min,保留上清液。吸取上清液1 mL，定容至20 mL,再取1.0 mL，加5 mL相應(yīng)濃度的NaOH，搖勻。取2 mL稀釋液，加入1.0 mL 6%的苯酚和5.0 mL濃硫酸,搖勻后靜置30 min，然后在490 nm處測量吸光度。根據(jù)1.2.3中的提取率公式算出提取率。

1.2.4.4 溫度對堿提法提取率的影響 取5支試管,編號16～20,均加入濃度為0.2 mol/L的氫氧化鈉溶液7.0 mL,加入蕨菜粉末0.5 g,分別在40、50、60、70、80 ℃水浴鍋中保溫 1 h, 將各試管提取液離心2次,轉(zhuǎn)速為4000 r/min,時間為10 min,保留上清液。吸取上清液1 mL,定容至20 mL,再取1.0 mL,加5 mL相應(yīng)濃度的NaOH,搖勻。取2 mL稀釋液,加入1.0 mL 6%的苯酚和5.0 mL濃硫酸,搖勻后靜置30 min,然后在490 nm處測量吸光度。

根據(jù)以上單因素實驗結(jié)果,選取各個因素的最佳水平附近的3個水平進行正交實驗。因素與水平設(shè)計見表2。設(shè)計的正交實驗表如表3。對9組試管中的提取液均以4000 r/min離心10 min，共離心2次。保留上清液,在490 nm處測量吸光度。根據(jù)吸光度得到多糖濃度,再利用1.2.3中的公式求出提取率。最后根據(jù)正交實驗所獲得的最優(yōu)條件結(jié)果進行實驗，并求出提取率。

1.2.5 用超聲波法提取商洛野生蕨菜多糖 稱取2.5 g蕨菜干粉于燒杯中,加入75 mL蒸餾水,在超聲波清洗器中以功率100 W、溫度75 ℃超聲提取70 min；對提取液離心2次,4000 r/min,10 min。保留上清液。在490 nm處測量吸光度。根據(jù)吸光度得到多糖濃度,再計算出提取率。

1.2.6 用硫酸-苯酚法測定商洛野生蕨菜多糖含量 常用的多糖測定方法有硫酸-蒽酮法和硫酸-苯酚法,兩種方法的原理大致相同,都是利用濃硫酸將多糖水解成單糖后,迅速脫水生成糠醛衍生物,其中蒽酮與單糖生成藍綠色糠醛衍生物,而苯酚與其反應(yīng)可生成黃色化合物[14]。這兩種方法相比較,苯酚-硫酸法操作步驟簡單，反應(yīng)后較穩(wěn)定，所使用的儀器也簡單,所以應(yīng)用范圍較廣[15-17]。

將以上3種方法得到的各組提取液稀釋后各取2 mL，加入6%的苯酚1 mL和5 mL濃硫酸,搖勻后靜置30 min,在490 nm下測量吸光度值。分別算出各組的供試多糖的濃度和提取率。

1.2.7 商洛野生蕨菜多糖抗氧化特性的研究 將提取到的多糖進行梯度稀釋,取5支試管,分別加提取液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,蒸餾水0.8、0.6、0.4、0.2、0 mL，則5支試管中的多糖濃度分別為0.214、0.0428、0.0642、0.0859、0.10706 g/L。吸取各試管中的稀釋液各1.0 mL，測定吸光度,再根據(jù)吸光度求出清除率。

1.2.7.1 多糖對超氧陰離子的清除能力測定 取1.2.7中5組提取液各0.1 mL,分別加入Tris-HCl 3 mL,在25 ℃水浴鍋中保溫20 min后加入鄰苯三酚3.0 mL,待其反應(yīng)5 min后再加入0.5 mL HCl,搖勻后以蒸餾水作對照,在420 nm處測量吸光度值。根據(jù)以下公式求出清除率：清除率(%)=(A0-A1)/A0×100%,式中A0為鄰苯三酚自養(yǎng)化平均吸光度,A1為加入樣品后的吸光度。

1.2.7.2 多糖對羥基自由基的清除能力測定 取1.2.7中5組提取液各1 mL,分別加入1 mL硫酸亞鐵、1 mL水楊酸-乙醇溶液,再加入1 mL過氧化氫溶液,在37 ℃水浴鍋中水浴30 min。以蒸餾水作對照,在510 nm處測量吸光度值。利用公式:清除率(%)=[A0-(Ax-Ax0)]/A0×100%算出商洛野生蕨菜多糖的清除率。式中A0為對照組吸光度,Ax為各組稀釋液的吸光度值,Ax0為不加過氧化氫的吸光度。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理方法 采用Excel對實驗數(shù)據(jù)進行處理、作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線

根據(jù)葡萄糖標準溶液的濃度梯度測定的吸光度見表1。最終繪制的標準曲線見圖1。以葡萄糖濃度(g/L)為橫坐標x,吸光度值(A490)為縱坐標y,采用最小二乘法進行線性回歸,得到的線性回歸方程為y=4.5050x+0.0474。

表1 葡萄糖溶液的濃度梯度及其吸光度測定結(jié)果

圖1 葡萄糖的標準曲線

2.2 水提法的多糖提取率

測得水提法提取液的吸光度值(A490)為0.1357。將其代入2.1中的線性回歸方程,得到水提法提取的商洛野生蕨菜的多糖濃度為0.0196 g/L。根據(jù)1.2.3中的提取率公式求出提取率為7.37%。

2.3 堿提法的最優(yōu)條件和提取率

2.3.1 氫氧化鈉濃度 由圖2可以看出,吸光度隨著氫氧化鈉濃度的升高呈現(xiàn)先升后降的趨勢,當氫氧化鈉濃度為0.4 mol/L時吸光度值最大。隨后,隨著氫氧化鈉濃度的增加,吸光度值逐漸下降。因此可以確定氫氧化鈉濃度0.4 mol/L為最佳提取濃度。

圖2 氫氧化鈉濃度對吸光度的影響

2.3.2 料液比 由圖3可知,吸光度隨著料液比的升高呈現(xiàn)先升后降再升高的趨勢,當料液比為1∶12時吸光度最大,因此可以選擇料液比1∶12作為最佳條件。

2.3.3 時間 由圖4可以看出,吸光度隨時間延長呈現(xiàn)先升后降的趨勢，當時間為1 h時,吸光度達到最大值,因此可以確定時間1 h為最佳條件。

2.3.4 溫度 由圖5可以看出,吸光度隨著溫度的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢,當溫度為70 ℃時有最大吸光度值,因此可以選擇70 ℃為最佳溫度條件。

圖3 料液比對吸光度的影響

圖4 時間對吸光度的影響

2.3.4 溫度 由圖5可以看出,吸光度隨著溫度的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢,當溫度為70 ℃時有最大吸光度值,因此可以選擇70 ℃為最佳溫度條件。

圖5 溫度對吸光度的影響

2.3.5 正交實驗結(jié)果 根據(jù)上述的4組單因素實驗結(jié)果,對氫氧化鈉濃度(A)、料液比(B)、時間(C)和溫度(D)4個因素進行正交試驗。參考單因素的最佳條件并考慮到實驗效率和節(jié)約材料,將上述4個因素各設(shè)置3個水平(見表2)，制定L934正交實驗表(表3)。

表2 正交實驗因素的水平設(shè)置

從表3可以看出，因素A、B、C、D的極差R值分別為1.332、3.336、4.460、6.628,因此可以得出這4個因素對蕨菜多糖提取的影響順序為:溫度>時間>料液比>氫氧化鈉濃度。比較各因素的K1～K3值可知，各因素的最優(yōu)水平分別為A2、B3、C3、D3，因此這4個因素的最優(yōu)組合為D3C3B3A2，即蕨菜多糖提取的最優(yōu)條件組合為：溫度75 ℃、時間80 min、料液比1∶13、氫氧化鈉濃度0.4 mol/L。在這種最優(yōu)條件下吸光度為0.484,按提取率公式算得提取到的商洛野生蕨菜多糖濃度為0.0969 g/L,提取率為20.436%。

2.4 超聲波提取法的多糖提取率

測得超聲波提取液的吸光度值(A490)為0.5297。代入圖1回歸方程,可知提取到的多糖濃度為0.10706 g/L。根據(jù)1.2.3中的公式算得多糖提取率為25.694%。

2.5 多糖的抗氧化性

2.5.1 清除超氧陰離子的能力 各試管提取液的吸光度值(A490)見表4,利用1.2.7.1中的清除率公式算出各組多糖的提取率。以多糖濃度(mg/mL)為橫坐標,以多糖提取率(%)為縱坐標,用Excel作圖見圖6。

2.5.2 清除羥基自由基的能力 各試管提取液的吸光度值(A510)見表5。以多糖濃度(mg/mL)為橫坐標,以多糖提取率(%)為縱坐標,用Excel作圖見圖6。

由圖6可知,商洛野生蕨菜多糖對超氧陰離子和羥基自由基的清除率隨著其濃度的增加而增加,當多糖濃度為0.0856 mg/mL時,其對超氧陰離子的清除率為71.78%,此后其抗氧化能力增加的幅度減緩。當多糖濃度為0.0642 mg/mL時,其對羥基自由基的清除率為71.73%,此后增長幅度減弱。 圖6中兩條曲線交點處的多糖濃度為0.0627 mg/mL，在此之前,商洛野生蕨菜多糖對超氧陰離子的清除率大于對羥基自由基的清除率；在此之后,其對羥基自由基的清除率大于對超氧陰離子的清除率。

3 結(jié)論與討論

水提法是植物多糖提取方法中較為傳統(tǒng)的一種,此方法操作容易,成本較低,設(shè)備簡單,但不足的是,提取時間較長,所需溫度較高,而且還會引起多糖降解；此外,材料的粒度、料液比、不同部位等因素也會影響最終的提取率。黃勁松等[18]、許文濤等[19]研究了蕨菜多糖提取工藝,優(yōu)化了水提法的提取條件,得出最佳溫度為62.5 ℃，最佳料液比為1∶18.8，最佳提取時間為5.9 h,最終其提取率為6.06%。筆者參照上述最優(yōu)條件提取2次,實際提取率為7.37%,其中的差異可能與蕨菜的生長條件和幼嫩程度有關(guān)。

表3 堿提法單因素優(yōu)化正交設(shè)計及實驗結(jié)果分析

表4 多糖對超氧陰離子的清除率

表5 多糖對羥基自由基的清除率

圖6 不同濃度多糖對超氧陰離子

薛丹等[20]綜述了近年來國內(nèi)外對植物多糖提取分離純化的研究,其中指出堿水提取法可用于酸性多糖和含有糖醛酸的多糖的提取分離。堿提法的常用溶液有NaOH、KOH、Ca(OH)2等,堿的濃度不宜太高,否則會破壞多糖的結(jié)構(gòu),進而影響多糖的提取率。關(guān)于用堿提法提取蕨菜多糖的研究不多,因此本實驗對堿提法的條件進行了優(yōu)化。向東等[21]研究得出堿提法提取南瓜多糖的最優(yōu)條件為:提取溫度80 ℃、提取時間2 h、料液比1∶5、氫氧化鈉濃度0.4 mol/L。楊云等[22]優(yōu)化了堿提法提取大棗渣多糖的條件:溫度為80 ℃,時間為3 h,Na2CO3濃度為0.5 mol/L。本實驗綜合各種研究,設(shè)計了預(yù)實驗及正交試驗，最終得出的最優(yōu)條件為:溫度75 ℃、時間80 min、料液比1 g∶13 mL、氫氧化鈉濃度0.4 mol/L。在此最優(yōu)組合條件下，多糖提取率為20.436%。如果料液比過小則不利于蕨菜粉末與堿溶液的充分反應(yīng),若過大則不利于多糖結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。當氫氧化鈉濃度過高時,會破壞多糖的結(jié)構(gòu),進而影響吸光度值。

超聲波提取法利用超聲波的空化效應(yīng)、機械效應(yīng)和熱效應(yīng)對植物組織產(chǎn)生很大的壓力,使細胞壁及生物組織瞬間破裂,破碎時間大大縮短。超聲波產(chǎn)生的震動作用和較強的穿透力還會促進胞內(nèi)物質(zhì)的釋放和擴散,從而提高提取率[23]。然而,超聲波提取法會受到料液比、功率、時間和溫度等不同因素的影響。張芝維等[24]研究了用超聲波法提取野生蕨菜多糖，并對該方法進行了優(yōu)化,最終得出的最優(yōu)參數(shù)為:料液比1∶30、超聲功率100 W、時間70 min、溫度75 ℃。本實驗參考上述條件,最終超聲波法的多糖提取率為25.694%。與上述研究結(jié)果基本相同。

在本研究中采用的水提法、堿提法和超聲波提取法的多糖濃度分別為0.01967、0.0969、0.10706 mg/mL，提取率分別為7.37%、20.436%和25.694%；無論是多糖濃度還是提取率,超聲波法都得到了最大值,堿提法次之,浸泡法最小。所以可以確定商洛野生蕨菜多糖的最佳提取方法為超聲波法。

本文對蕨菜多糖的抗氧化特性研究表明,隨著多糖濃度的增加,多糖清除超氧陰離子和羥基自由基的能力增加。該結(jié)果與陳玉琴等[25]的研究結(jié)果大致相同。本實驗用鄰苯三酚自氧化反應(yīng)研究多糖對超氧陰離子的清除能力。在堿性(pH=8.2)條件下,鄰苯三酚發(fā)生自氧化反應(yīng),產(chǎn)生超氧陰離子和有色的中間產(chǎn)物,該產(chǎn)物在波長420 nm處有一特征吸收峰,當加入清除劑時,超氧陰離子的生成受阻,溶液在420 nm處的吸光度值減少。通過測定A420可以算出多糖對超氧陰離子的清除作用[26-27]。研究結(jié)果(圖6)顯示：當多糖濃度為0.0856 mg/mL時,其對超氧陰離子的清除率為71.78%,此后的清除能力增加緩慢。

在本研究中,用Fenton反應(yīng)測定多糖對羥基自由基的清除能力。過氧化氫與Fe2+反應(yīng)后產(chǎn)生OH-,其反應(yīng)活性很高,且存在時間短；在反應(yīng)體系中加入的水楊酸會捕捉OH-并產(chǎn)生有色物質(zhì),該物質(zhì)在波長510 nm處有特征吸收峰,如果加入能清除OH-的物質(zhì),就會與水楊酸競爭OH-,從而使有色物質(zhì)減少,吸光度值降低，這樣即能測定多糖對羥基自由基的清除能力[28-29]。今后有關(guān)商洛野生蕨菜多糖的提取方法及多糖的抗氧化特性都還有待深入研究；結(jié)合商洛蕨菜富含的真實多糖濃度積極開展相關(guān)抗氧化特性研究,能為人類合理食用蕨菜,從而發(fā)揮其多糖的最佳功效提供參考。

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Study on Extraction Technology and Antioxidant Activity of Polysaccharide fromPteridiumaquilinumin Shangluo

HUA Zhi-rui, LI Xiao-ling

(College of Biology Pharmacy and Food Engineering, Shangluo University, Shangluo 726000, China)

Taking Shangluo bracken (Pteridiumaquilinum) as the material, the best method of polysaccharide extraction and the determination of antioxidant concentration of polysaccharide were studied through the single factor experiment and orthogonal experiment, The effect of the three methods to extract polysaccharide was compared, and the oxidation resistance of bracken polysaccharide was measured. The results showed that the optimum extraction procedure was as following: the temperature was 75 ℃, the time was 80 min, the ratio of material to liquor was 1∶13, the contention of NaOH was 0.4 mol/L. The extraction rate of water, alkali and ultrasonic was 7.37%, 20.436% ,and 25.694% , respectively. The removal ability to O2-and OH-of polysaccharide increased with the increasing of polysaccharide concentration.

Shangluo city;Pteridiumaquilinum; Polysaccharide; Extraction; Antioxidant activity

2015-09-03

陜西省科技廳項目(2011K01-18)。

華智銳(1980─),男,湖北黃石人,講師,碩士,主要從事園藝生物技術(shù)研究。

Q914.85

A

1001-8581(2016)03-0047-06

黃榮華)