連文力，楊勝男，賈宏昉，崔 紅

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，河南 鄭州 450002)

施用有機(jī)肥對(duì)成熟期烤煙碳氮代謝關(guān)鍵基因表達(dá)的影響

連文力，楊勝男，賈宏昉，崔 紅*

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，河南 鄭州 450002)

為了探明有機(jī)肥用量對(duì)烤煙碳氮代謝途徑關(guān)鍵基因表達(dá)的影響，設(shè)置3種有機(jī)肥施用量(0、200、600 kg/667 m2)來分析烤煙成熟期葉片碳氮代謝相關(guān)關(guān)鍵基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明：施用有機(jī)肥顯著降低了碳代謝途徑中蔗糖合成酶基因(SUS)、蔗糖磷酸合成酶基因(SPS)、顆粒結(jié)合型淀粉合成酶基因(GBSSI)和淀粉分支酶基因(SBE)的表達(dá)水平，3個(gè)處理表現(xiàn)為：CK>C200>C600。通過對(duì)氮代謝途徑關(guān)鍵基因硝酸還原酶(NITR)、亞硝酸還原酶(NIR)、谷氨酸脫氫酶(GDH)和谷氨酰胺合成酶(GS)中一個(gè)重要家族成員(GLN1-3)的表達(dá)分析表明：施用適量(200 kg/667 m2)有機(jī)肥對(duì)氮代謝途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)量影響不顯著，僅在高用量(600 kg/667 m2)有機(jī)肥條件下表現(xiàn)出抑制。因此，通過添加不同有機(jī)肥用量對(duì)烤煙碳氮代謝關(guān)鍵基因的表達(dá)分析可以看出，有機(jī)肥處理下的碳氮代謝基因表達(dá)量明顯受到抑制，且與有機(jī)肥的施用量呈正相關(guān)性，有機(jī)肥對(duì)碳代謝途徑的影響大于氮代謝。

有機(jī)肥；碳代謝；氮代謝；基因表達(dá)；烤煙

煙草是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，因此對(duì)其品質(zhì)要求較為嚴(yán)格。在栽培生產(chǎn)中，常常為了片面地追求經(jīng)濟(jì)效益而忽略了其品質(zhì)，過量地施用化肥而忽略有機(jī)肥的使用，造成植煙土壤酸化、板結(jié)，有機(jī)質(zhì)含量低，土壤微生物數(shù)量有所降低，引起了烤煙煙葉營養(yǎng)養(yǎng)分比例不協(xié)調(diào)，油分相對(duì)少，香氣量不足，進(jìn)而限制了烤煙煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)的提高[1-3]。針對(duì)這種情況可以通過增施有機(jī)肥來代替化肥的施用。本試驗(yàn)混合使用生物炭與草炭，可以明顯提高土壤肥力，減少養(yǎng)分損失，穩(wěn)定肥效，從而改善土壤理化性狀，提高煙葉的品質(zhì)[4-9]。

碳氮代謝是烤煙最基本的代謝過程，碳氮代謝活動(dòng)的強(qiáng)弱、協(xié)調(diào)程度及其變化規(guī)律直接或間接地影響煙葉的物質(zhì)成分，對(duì)煙葉的品質(zhì)影響較大。有機(jī)肥的種類很多，包括生物炭、草炭等。關(guān)于有機(jī)肥在煙草上施用已有大量報(bào)道：王樹會(huì)等的研究結(jié)果表明增施草炭可以在一定程度上促進(jìn)煙株生長，提高煙葉產(chǎn)量，降低煙葉淀粉含量，改善煙葉品質(zhì)[10]，且與草炭用量呈負(fù)相關(guān)；王林虹等研究表明生物炭可以改善煙葉品質(zhì)[11]。與作物碳氮代謝途徑相關(guān)的關(guān)鍵基因有蔗糖合成酶基因(SUS)、蔗糖磷酸合成酶基因(SPS)、顆粒結(jié)合型淀粉合成酶基因(GBSSI)、淀粉分支酶(SBE)、硝酸還原酶(NITR)、亞硝酸還原酶(NIR)、谷氨酸脫氫酶(GDH)和谷氨酰胺合成酶(GS)中一個(gè)重要家族成員(GLN1-3)。目前，大多數(shù)研究的關(guān)注點(diǎn)是通過施用有機(jī)肥來促進(jìn)土壤微生物新陳代謝，活化土壤養(yǎng)分，改善土壤結(jié)構(gòu)，提高土壤肥力，改善作物品質(zhì)；而如何從分子水平研究施用有機(jī)肥對(duì)作物碳氮代謝途徑的影響還未見報(bào)道。因此，本文通過草炭和生物炭混合組成的有機(jī)肥來研究對(duì)烤煙碳氮代謝的影響，從碳氮代謝關(guān)鍵基因表達(dá)水平上進(jìn)行研究，從分子手段入手，以期為以后研究施用有機(jī)肥對(duì)烤煙品質(zhì)的影響提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試烤煙品種為云煙87。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于河南南陽金葉園——濃香型特色優(yōu)質(zhì)煙葉開發(fā)項(xiàng)目產(chǎn)區(qū)進(jìn)行。試驗(yàn)田土壤為黃壤土，肥力均勻適中，pH值為7.42，土壤有機(jī)質(zhì)含量11.42 g/kg，堿解氮含量57.40 mg/kg，速效磷含量20.12 mg/kg，速效鉀含量121.18 mg/kg。供試有機(jī)肥由草炭和生物炭組成，其中生物炭占30%，草炭占70%。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)處理，對(duì)照CK依照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)進(jìn)行管理；處理1在對(duì)照的基礎(chǔ)上施用有機(jī)肥200 kg/667 m2(C200)；處理2在對(duì)照的基礎(chǔ)上施用有機(jī)肥600 kg/667 m2(C600)。各處理面積200 m2，重復(fù)3次。各項(xiàng)管理措施與當(dāng)?shù)刈顑?yōu)措施保持一致。

1.3 樣品采集

采集中部葉(10～12葉位)，打頂日期為移栽后62 d，在移栽后62 d第1次取樣，以后每隔8 d取1次樣，整個(gè)成熟期共取5次樣。選擇5株長勢一致的煙株，混合取樣5 g。每個(gè)時(shí)期3個(gè)重復(fù)，迅速置于液氮中，于-80 ℃冰箱凍存，用于基因表達(dá)研究和代謝組學(xué)分析。

1.4 碳氮代謝基因的RT-PCR檢測

選取生長發(fā)育良好的中部葉，將來源于不同煙株的5片葉樣品混合以減少試驗(yàn)誤差，并迅速置于液氮中冷凍保存。采用Trizol法提取煙草總RNA，樣品通過隨機(jī)引物法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)Genbank發(fā)布的蔗糖合成酶(SUS)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)、顆粒型淀粉合成酶(GBSSI)、淀粉分支酶(SBE)、硝酸還原酶(NITR)、亞硝酸還原酶(NIR)、谷氨酸脫氫酶(GDH)、谷氨酰胺合成酶家族成員(GLN1-3)和內(nèi)參基因L25的序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，進(jìn)行RT-PCR(表1)。

表1 擴(kuò)增引物序列

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Image J軟件對(duì)RT-PCR檢測所得半定量圖片進(jìn)行量化，提取各個(gè)基因表達(dá)的亮度相對(duì)值進(jìn)行對(duì)比，每個(gè)基因均以內(nèi)參L25為基準(zhǔn)，再使用Excel 2013進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同有機(jī)肥處理對(duì)碳代謝關(guān)鍵基因表達(dá)的影響

由圖1和圖2可以看出，SUS基因在不同有機(jī)肥處理下的表達(dá)量不同，隨著生育期的推進(jìn)CK處理下的基因表達(dá)量呈遞減的趨勢，C200和C600處理下的基因表達(dá)量則呈現(xiàn)遞增的趨勢。對(duì)照CK和C600處理下的表達(dá)量要強(qiáng)于C200處理下的。SPS基因在移栽后68 d C600處理下的表達(dá)量隨著生育期的推進(jìn)有逐漸增強(qiáng)的趨勢，但SPS基因在CK和C200處理下的表達(dá)量要強(qiáng)于C600處理下的。顆粒結(jié)合型淀粉合成酶(GBSSI)是與直鏈淀粉合成直接有關(guān)的酶，它位于淀粉粒內(nèi)部，使合成的直鏈淀粉保持未分支狀態(tài)[12]。GBSSI基因的表達(dá)量在移栽后68 d CK和C600處理下先下降再升高，但CK和C200處理下的表達(dá)量相對(duì)值明顯高于C600處理下的。淀粉分支酶(starch branching enzyme，SBE)是淀粉合成的限速酶，它能切開α-1，4-糖苷鍵連的寡糖片段，又能把切下的短鏈通過α-1，6-糖苷鍵連接于受體鏈上，形成分支結(jié)構(gòu)。SBE基因在移栽后76 d CK下的基因表達(dá)量有增強(qiáng)的趨勢，而C200處理下的基因表達(dá)量則表現(xiàn)為先降低再升高，CK和C200處理下的基因表達(dá)量明顯強(qiáng)于C600下的。由以上的分析結(jié)果表明，施用有機(jī)肥處理對(duì)烤煙碳代謝的基因表達(dá)的影響為：CK>C200>C600。

2.2 不同有機(jī)肥處理對(duì)氮代謝關(guān)鍵基因表達(dá)的影響

如圖3、圖4所示，NITR基因在CK和C200處理下的表達(dá)量隨著生育期的推進(jìn)有遞增的趨勢，C600處理下的變化規(guī)律不明顯；在同一時(shí)期不同處理下的NITR基因表達(dá)量相比，均是CK和C200處理要強(qiáng)于C600處理。NIR基因在CK和C200處理下的表達(dá)量隨著生育期的推進(jìn)有逐漸增加的趨勢，而C600處理下的基因表達(dá)量則剛好相反，呈遞降的趨勢，除移栽后60 d外，NIR基因表達(dá)量在同一時(shí)期不同處理下，均是CK>C200>C600。谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase，GDH)在植物體內(nèi)的作用主要是催化ɑ-酮戊二酸的氨化和谷氨酸的脫氨這一可逆反應(yīng)。GDH在NH4+的合成及谷氨酸的代謝中具有十分獨(dú)特的作用，它在NH4+的合成和再合成中起初始性作用，并在谷氨酸合成循環(huán)中起補(bǔ)充作用。GDH基因在CK處理下的基因表達(dá)量隨著生育期的推進(jìn)呈逐漸增強(qiáng)的趨勢，而在C200處理下的基因表達(dá)量在移栽后84 d達(dá)到最大值后又開始下降；相反，GDH基因在C600處理下的表達(dá)量則是隨著生育期的推進(jìn)呈遞降的趨勢。移栽后60 d和68 d的GDH基因表達(dá)量表現(xiàn)為C600略高于CK和C200，其它均表現(xiàn)為CK>C200>C600。GLN1-3為谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)家族的重要成員，谷氨酰胺合成酶(GS)是處于氮代謝中心的多功能酶，參與多種氮代謝的調(diào)節(jié)[13]，GS常與谷氨酸合酶(glutamate synmase，GOGAT)協(xié)同作用，組成GS/GOGAT循環(huán)，該循環(huán)承擔(dān)著氮代謝的中心作用。GLN1-3基因在CK處理下的表達(dá)量隨著生育期的推進(jìn)有逐漸增強(qiáng)的趨勢，在C200處理下的表達(dá)量自移栽后68 d開始亦是逐漸增加，相反，C600處理下的基因表達(dá)量隨著生育期的推進(jìn)有逐漸降低的趨勢。以上的分析結(jié)果表明，氮代謝的關(guān)鍵基因表達(dá)量表現(xiàn)為CK>C200>C600。

圖1 不同有機(jī)肥處理下碳代謝關(guān)鍵基因表達(dá)檢測

圖2 不同有機(jī)肥處理下碳代謝關(guān)鍵基因的表達(dá)量

圖3 不同有機(jī)肥處理下氮代謝關(guān)鍵基因表達(dá)檢測

3 結(jié)論與討論

在煙葉生長發(fā)育過程中，煙葉碳氮代謝平衡影響煙葉的最終品質(zhì)[14]。施用有機(jī)肥顯著降低了碳代謝途徑中蔗糖合成酶基因(SUS)、蔗糖磷酸合成酶基因(SPS)、顆粒結(jié)合型淀粉合成酶基因(GBSSI)和淀粉分支酶基因(SBE)的表達(dá)水平，3個(gè)處理表現(xiàn)為：CK>C200>C600。對(duì)氮代謝途徑中關(guān)鍵基因硝酸還原酶(NITR)、亞硝酸還原酶(NIR)、谷氨酸脫氫酶(GDH)和谷氨酰胺合成酶(GS)中一個(gè)重要家族成員(GLN1-3)的表達(dá)分析表明施用適量(200 kg/667 m2)有機(jī)肥對(duì)氮代謝途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)量影響不顯著，僅在高用量(600 kg/667 m2)有機(jī)肥條件下表現(xiàn)出抑制。因此，從分子水平通過添加不同有機(jī)肥用量對(duì)烤煙碳氮代謝的研究結(jié)果可以看出，有機(jī)肥處理下的碳氮代謝基因表達(dá)量明顯受到抑制，且與有機(jī)肥的施用量呈正相關(guān)；有機(jī)肥對(duì)碳代謝途徑的影響大于氮代謝。

圖4 不同有機(jī)肥處理下氮代謝關(guān)鍵基因的表達(dá)量

淀粉和全氮是衡量煙葉品質(zhì)的重要指標(biāo)，與碳氮代謝途徑密切相關(guān)。大量研究表明碳氮代謝與有機(jī)肥的施用密切相關(guān)。王樹會(huì)等研究表明增施草炭可以有效降低煙葉的淀粉含量[7]。本研究從分子水平研究碳代謝途徑關(guān)鍵基因與有機(jī)肥施用量的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)成熟期隨著有機(jī)肥施用量的增加，從碳代謝途徑基因表達(dá)上來看，基因表達(dá)顯著降低，與前人報(bào)道的淀粉含量降低相一致。生物炭有很強(qiáng)的吸附性能，被認(rèn)為可以吸附和保持土壤礦質(zhì)營養(yǎng)元素，有效減少雨水沖刷造成的氮、磷流失，從而相應(yīng)提高留存于土壤中的養(yǎng)分。Lehmann等指出當(dāng)生物炭和肥料配施后，生物炭可以通過吸附NO3-、NH4+，減少土壤的氨揮發(fā)與土壤氮素流失，來提高氮肥利用率[15]。曲晶晶等得出相似結(jié)論，認(rèn)為施用生物炭提高水稻的氮肥吸收利用率達(dá)20.33%[16]。王麗淵在對(duì)煙草的研究中發(fā)現(xiàn)，在正常供氮條件下，中部葉總氮含量隨生物炭的施用量增加而顯著提高[17]。本研究發(fā)現(xiàn)成熟期隨著有機(jī)肥施用的增加，從氮代謝途徑基因表達(dá)上來看，該途徑關(guān)鍵基因表達(dá)也有降低趨勢，尤其是在C600處理下，基因表達(dá)顯著降低。前人研究表明使用有機(jī)肥可以提高總氮含量，這可能與生物炭可以提高土壤的養(yǎng)分含量密切相關(guān)，雖然氮代謝降低，但是土壤中的氮素利用率提高了，所以導(dǎo)致最終葉片全氮含量隨著生物炭用量的增加而提高。

綜上所述，施用不同用量的有機(jī)肥對(duì)烤煙碳氮代謝的影響較為明顯，增施有機(jī)肥后碳氮代謝減弱，尤其是C600處理影響較大，表達(dá)量明顯低于CK和C200處理。

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Effect of Organic Fertilizer Application on Expression of Key Genes Related to Carbon and Nitrogen Metabolism in Flue-cured Tobacco at Maturity Stage

LIAN Wen-li, YANG Sheng-nan, JIA Hong-fang, CUI Hong*

(College of Tobacco Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

In order to determine the effects of organic fertilizer application on carbon and nitrogen metabolism key genes expressions of flue-cured tobacco, different organic fertilizer applications(0, 200, 600 kg/667 m2) were set in this study, which analyzed carbon and nitrogen metabolism related genes expressions of flue-cured tobacco in maturity. The results showed that sucrose synthase (SUS), sucrose phosphate synthase (SPS), granule-bound starch synthase (GBSSI) and starch branching enzyme (SBE) were decreased conspicuously by applying organic fertilizer and three treatments were as follows: CK>C200>C600. The expressions of nitrogen metabolism related genes nitrate reductase (NITR), nitrite reductase(NIR), glutamate dehydrogenase(GDH) and an important family members(GLN1-3) of glutamine synthesis enzymes(GS) were elucidated that nitrogen metabolism related genes expressions were not significant in applying appropriate organic fertilizer (200 kg/667 m2) and inhibited in higher organic fertilizer (600 kg/667 m2). Therefore, which could be found that expressions of carbon and nitrogen related gene of flue-cured tobacco were inhibited significantly and positive correlation with organic fertilizer application by applying different organic fertilizer, the effect of organic fertilizer on carbon metabolism was more than that of nitrogen metabolism.

Organic fertilizer; Carbon metabolism; Nitrogen metabolism; Gene expression

2015-11-04

中國煙草總公司特色優(yōu)質(zhì)煙葉開發(fā)重大專項(xiàng)(110200902045 TS-01)。

連文力(1991─)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)闊煵萆锛夹g(shù)。*通訊作者：崔紅。

S572

A

1001-8581(2016)03-0020-04

許晶晶)