張嘉煒,楊永霞,馮小虎,賈宏昉,張松濤,張洪映,崔 紅*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.江西省煙草公司 撫州市公司,江西 撫州 344000)

添加生物炭對(duì)烤煙碳氮代謝的影響

張嘉煒1,楊永霞1,馮小虎2,賈宏昉1,張松濤1,張洪映1,崔 紅1*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.江西省煙草公司 撫州市公司,江西 撫州 344000)

為探究添加生物炭對(duì)烤煙碳氮代謝的影響，以煙草品種K326為材料，從細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)以及物質(zhì)代謝3個(gè)層面進(jìn)行了系統(tǒng)研究。超微結(jié)構(gòu)分析表明：中部葉成熟早期，不施生物炭處理的煙葉淀粉粒積累較多，隨著葉片成熟降解更快?；虮磉_(dá)分析顯示：打頂后，糖、淀粉代謝相關(guān)基因表達(dá)逐漸增強(qiáng)，氮代謝相關(guān)基因的表達(dá)減弱。中部葉成熟后期，添加生物炭越多，相關(guān)基因表達(dá)越強(qiáng)。物質(zhì)代謝分析表明：打頂后，添加生物炭處理的總糖、還原糖含量降低，調(diào)制后，糖含量較高。打頂及調(diào)制后，添加600 kg/hm2生物炭處理的淀粉含量較高。添加生物炭后，總氮、煙堿含量增加，調(diào)制后差異變小，這說(shuō)明添加生物炭對(duì)煙葉碳氮代謝有較大影響，進(jìn)而影響煙葉品質(zhì)。

烤煙；碳氮代謝；生物炭；基因表達(dá)

在煙株生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中,碳氮代謝是最基本的代謝過(guò)程,尤其是在成熟過(guò)程中,煙葉各種化學(xué)成分的組成、比例及含量受碳氮代謝的強(qiáng)度、動(dòng)態(tài)變化模式和協(xié)調(diào)程度的影響很大[1]。淀粉、總糖和還原糖含量既是碳代謝的關(guān)鍵指標(biāo)，又是重要的致香物前體物。氮素調(diào)控?zé)熑~內(nèi)的能量代謝和物質(zhì)轉(zhuǎn)化，同時(shí)也是烤煙生產(chǎn)的重要營(yíng)養(yǎng)元素之一，對(duì)煙葉品質(zhì)具有很大的影響[2-4]。因此，優(yōu)質(zhì)煙葉的生產(chǎn)必須調(diào)控碳氮代謝的平衡，控制碳氮代謝相關(guān)物質(zhì)在適宜的范圍內(nèi)。煙草碳氮代謝受多種因素影響，如品種、發(fā)育時(shí)期、栽培措施、肥料、生態(tài)環(huán)境、成熟度等都會(huì)影響碳氮代謝的強(qiáng)度[5-14]。

生物炭(Biochar)是以自然界廣泛存在的木材、家禽糞便和秸稈等生物質(zhì)資源為基礎(chǔ)，在相對(duì)較低的溫度(<700 ℃)和無(wú)氧或限氧的條件下炭化熱解而得到的一種細(xì)粒、多孔的碳質(zhì)材料[15]，具有良好的綜合生物效應(yīng)[16]。研究表明，添加生物炭能夠提高根系生理活性、改良根系形態(tài)、增強(qiáng)土壤肥力、維持較為適宜的根冠比，從而提高作物產(chǎn)量[17-21]。此外，添加生物炭還能影響土壤微生物群落的組成、氮循環(huán)尤其是銷(xiāo)態(tài)氮的代謝、減輕重金屬積累[22-25]。目前，生物炭在煙草上的研究主要集中在對(duì)植煙土壤的理化性質(zhì)及經(jīng)濟(jì)性狀的影響上[26-27]。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)植煙土壤添加不同量的生物炭，從細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)、分子機(jī)理以及物質(zhì)代謝3個(gè)層面，系統(tǒng)地研究了生物炭對(duì)煙株生長(zhǎng)發(fā)育及調(diào)制后碳氮代謝的影響，為優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)提供了一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和設(shè)計(jì)

2013年在江西省撫州市廣昌縣長(zhǎng)橋鎮(zhèn)種植煙草品種K326。按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙栽培技術(shù)規(guī)范實(shí)施管理。行距1.3 m，株距50～55 cm，試驗(yàn)地為水田砂壤土，土壤有機(jī)質(zhì)為25.8 g/kg、堿解氮210 mg/kg、速效磷10 mg/kg、速效鉀76 mg/kg、pH值5.2。在初花期進(jìn)行打頂，足量留葉。并對(duì)中部葉(第12葉位)進(jìn)行掛牌標(biāo)記。試驗(yàn)添加的生物炭原材料為花生殼，加工時(shí)，首先將風(fēng)干的花生殼粉碎，然后裝入炭化爐中，在500 ℃密封低氧狀態(tài)下連續(xù)炭化，而后過(guò)篩，制成直徑為3～5 mm的顆粒狀生物炭。

試驗(yàn)田分為4個(gè)處理:常規(guī)施肥(CK)；T1：在常規(guī)施肥的基礎(chǔ)上，增施生物炭肥300 kg/hm2；T2：在常規(guī)施肥的基礎(chǔ)上，增施生物炭肥600 kg/hm2；T3：在常規(guī)施肥的基礎(chǔ)上，增施生物炭肥900 kg/hm2。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 煙草葉片超微結(jié)構(gòu)觀察 分別在打頂后10、20、30、40 d，按照文獻(xiàn)[5]的方法取樣。取中部葉第6～8條側(cè)脈間1 mm×3 mm的葉肉組織切片，于5%戊二醛溶液中4 ℃條件下固定保存。經(jīng)固定、脫水、包埋、切片及雙重染色后，于Hitachi 600透射電鏡下觀察并拍照。

1.2.2 碳氮代謝關(guān)鍵基因表達(dá)分析 分別在打頂后10、20、30、40 d，取中部葉片，每個(gè)樣品取自3株不同煙株的中部葉去除主脈后混合，迅速用錫箔紙包裹放入液氮冷凍，帶回實(shí)驗(yàn)室于-80 ℃冰箱中保存。煙葉總RNA的提取采用Trizol法，反轉(zhuǎn)錄采用隨機(jī)引物法。查詢Genbank發(fā)布的煙草碳氮代謝關(guān)鍵基因序列，采用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物，以L25為參考序列，具體引物序列見(jiàn)表1，采用半定量RT-PCR進(jìn)行基因表達(dá)差異研究。PCR反應(yīng)體系為20 μL，PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，50 ℃(退火溫度根據(jù)基因不同而變化)復(fù)性30 s；72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。采用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行PCR產(chǎn)物的檢測(cè)。

表1 引物序列

1.2.3 化學(xué)成分分析 在煙草生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的取樣時(shí)期同上，每個(gè)樣品取自3株不同煙株的中部葉，并混合，液氮保存，備用?？竞髽悠酚蓪?zhuān)職評(píng)級(jí)人員按照國(guó)標(biāo)進(jìn)行煙葉分級(jí)，采用定等級(jí)取樣法采集C3F(中橘三)。每個(gè)樣品取3 kg用于化學(xué)成分測(cè)定，煙樣烘干、粉碎后過(guò)60目篩備用。

采用德國(guó)Seal-AA3流動(dòng)分析儀(德國(guó)BRAN & LU-EBBE公司生產(chǎn))測(cè)定煙葉常規(guī)化學(xué)成分，樣品的前處理過(guò)程如下：于50 mL磨口三角瓶中，精確稱(chēng)取0.25 g試樣，加入25 mL 5%醋酸溶液后在振蕩器上震蕩萃取30 min。用定性濾紙過(guò)濾后采用Seal-AA3連續(xù)流動(dòng)分析儀按YC/T 159─2002、YC/T 216─2002標(biāo)準(zhǔn)分別測(cè)定煙葉煙堿、總糖、還原糖和淀粉含量?？偟臏y(cè)定采用YC/T 161─2002標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。測(cè)定前，于0.1 g樣品中加入1 g K2SO4、0.1 g HgO和5 mL濃硫酸，消化3 h，用定性濾紙過(guò)濾后定容到100 mL即可進(jìn)行總氮的測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體超微結(jié)構(gòu)

圖1超微結(jié)構(gòu)顯示，添加不同量生物炭處理的細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)變化規(guī)律趨于一致，中部葉成熟前期，煙葉淀粉粒積累相對(duì)較少、體積變化較小，且未添加生物炭處理的淀粉粒體積相對(duì)較小。隨著葉片成熟，淀粉顆粒逐漸積累，至打頂后40 d，不添加生物炭處理的淀粉積累較多。成熟后期，類(lèi)囊體片層消失，嗜鋨顆粒增加，細(xì)胞表現(xiàn)出衰老降解的特點(diǎn)。不施生物炭處理(CK)的降解更充分、發(fā)育更快。

CK、T1、T2、T3的1～4分別表示CK、T1、T2、T3打頂后10、20、30、40 d(х10000)，ST:淀粉粒，DO：嗜鋨顆粒，Ch:葉綠體

2.2 碳氮代謝途徑關(guān)鍵基因表達(dá)規(guī)律

由圖2可知，打頂后10和40 d，與糖代謝過(guò)程中庫(kù)結(jié)構(gòu)的膨大生長(zhǎng)密切相關(guān)的液泡轉(zhuǎn)化酶(Vacuolar invertase,Vi)、與糖積累有關(guān)的磷酸合成酶(Sucrosephosphatesynthase,SPS)、蔗糖磷酸化酶(Sucrose-6-phosphate phosphatase,SPP，催化蔗糖和磷酸分解)和蔗糖合成酶(Sucrose synthase,SuS，降解蔗糖，提供合成淀粉等多糖的葡萄糖供體)，以及與淀粉代謝有關(guān)的基因ADPG焦磷酸化酶(ADP Glucose Pyrophosphorylase，AGPase)和顆粒結(jié)合型淀粉合成酶(Granule-bound starch synthase，GBSSI，控制直鏈淀粉的合成)均表現(xiàn)為CK和T3處理表達(dá)較強(qiáng)。打頂后20 d，T1處理的基因表達(dá)較強(qiáng)；打頂后30 d，T2處理的煙葉基因表達(dá)最強(qiáng)，這說(shuō)明中部葉成熟后期，添加生物炭越多，糖、淀粉代謝相關(guān)基因表達(dá)越強(qiáng)。隨著葉片成熟氮代謝相關(guān)基因表達(dá)呈現(xiàn)逐漸減弱的趨勢(shì)。打頂后，與氮代謝有關(guān)的硝酸還原酶(Nitrate reductase,Nitr，主要作用是把NO3-離子還原成NO2-離子，是氮代謝的第一個(gè)關(guān)鍵酶和限速酶)總體表現(xiàn)為T(mén)2處理的基因表達(dá)較強(qiáng)，亞硝酸還原酶(Nitrite reductase,NIR，主要作用是把NO2-離子還原成NH4+離子)和催化產(chǎn)生谷氨酰胺合成的氨酰胺合成酶(Glutamine synthase，GS，N素轉(zhuǎn)移酶)則表現(xiàn)為T(mén)2和T3處理的表達(dá)較強(qiáng)。

圖2 不同處理的碳氮代謝相關(guān)基因表達(dá)差異比較

2.3 不同生物炭處理常規(guī)化學(xué)成分分析

由圖3可知，打頂后隨著煙株的生長(zhǎng)，各處理的總糖和還原糖含量變化趨勢(shì)基本相同，均呈現(xiàn)出在打頂后含量下降，而在打頂后30 d開(kāi)始上升。CK的總糖、還原糖含量高于施用生物炭的處理。T1與T3的含量變化趨勢(shì)相似，兩者的總糖含量在打頂后20 d略微下降，之后上升，打頂后40 d上升明顯。T2在打頂后30 d的含量最低，之后明顯上升。調(diào)制后，添加生物炭越多，總糖、還原糖含量也越高。

圖3 不同處理的糖含量變化趨勢(shì)

由圖4可知，打頂后，隨著煙株的生長(zhǎng)，除T2外，其余各處理的淀粉含量變化趨勢(shì)基本相同，均呈現(xiàn)出淀粉含量逐漸增加的趨勢(shì)，打頂后40 d煙葉采收期達(dá)到最高。其中，CK的含量最高。而T2處理在打頂后40 d的淀粉含量有所降低。調(diào)制后，以T2處理的淀粉含量最高。

圖4 不同處理的淀粉含量變化趨勢(shì)

如圖5所示，打頂后，除T3外，其余各處理的煙堿含量大體呈上升趨勢(shì)。且CK的煙堿含量均低于其他處理。調(diào)制后，各處理的煙堿含量相差較小，而T3的煙堿含量略低于其余各處理。打頂后，總氮含量總體呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。在煙葉生長(zhǎng)發(fā)育期間，總氮含量較低。調(diào)制后，各處理的差異不大。

圖5 不同處理的煙堿和總氮含量變化趨勢(shì)

3 小結(jié)與討論

碳氮代謝是煙草生長(zhǎng)發(fā)育的基本過(guò)程，煙葉品質(zhì)在很大程度上受煙株碳氮代謝的平衡和協(xié)調(diào)程度的影響。生物炭作為一種新型的材料，因其綜合生物效應(yīng)良好，目前在生產(chǎn)上應(yīng)用較廣。添加生物炭可以改善土壤理化性質(zhì)、持留土壤養(yǎng)分、促進(jìn)植物生長(zhǎng)[16]。通過(guò)對(duì)細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)的分析表明：中部葉成熟早期，不施生物炭處理的煙葉淀粉粒積累較多，但淀粉粒較小。而對(duì)碳氮代謝相關(guān)基因的表達(dá)分析顯示：打頂后，糖、淀粉、代謝相關(guān)基因表達(dá)逐漸增強(qiáng)，氮代謝相關(guān)基因的表達(dá)逐漸減弱。添加300 kg/hm2和600 kg/hm2生物炭處理的相關(guān)基因表達(dá)整體較強(qiáng)。這說(shuō)明添加生物炭后，糖、淀粉代謝相關(guān)基因表達(dá)更活躍。而對(duì)應(yīng)的物質(zhì)代謝分析表明，打頂及調(diào)制后，添加600 kg/hm2生物炭處理的淀粉含量較高。打頂后，添加生物炭后總糖、還原糖含量較低，但調(diào)制后，添加生物炭越多，總糖、還原糖含量也越高，由此說(shuō)明添加生物炭有利于煙葉淀粉的積累和轉(zhuǎn)化。添加生物炭后，煙葉的總氮、煙堿含量增加，且調(diào)制后的差異變小，這可能是添加生物炭后，活化了土壤養(yǎng)分，更利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收及轉(zhuǎn)化，進(jìn)而最終改善煙葉品質(zhì)。

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Effects of Biochar on Carbon and Nitrogen Metabolism of Flue-cured Tobacco

ZHANG Jia-wei1, YANG Yong-xia1, FENG Xiao-hu2, JIA Hong-fang1,ZHANG Song-tao1, ZHANG Hong-ying1, Cui Hong1*

(1. Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China;2. Fuzhou Tobacco Company of Jiangxi Province, Fuzhou 344000, China)

:In order to identify the effects of biochar on carbon and nitrogen metabolism of flue-cured tobacco, taking the tobacco variety (NicotianatabacumL, K326) as material, conducted the systematic research from the cell tissue structure, gene expression and metabolism in three levels. Results showed that the starch were more at the earlier stages, and degraded more completely in the treatment of no applying biochar with leaf maturity. The analysis of gene expression displayed that the expression of the genes related to carbon metabolism increased gradually after topping, while the expression of the genes related to nitrogen metabolism reduced. The expression of the genes were higher by applying more biochar at the later stages. The analysis of substance contents indicated that the contents of total sugar and reducing sugar reduced after applying biochar, the contents were higher after cured. The starch contents were higher after applying 600 kg/hm2. The contents of total nitrogen and nicotine increased after applying biochar, the difference was diminished after cured, these results showed that the metabolism of tobacco carbon and nitrogen were affected by applying biochar, thus affected the quality of flue-cured tobacco.

Flue-cured tobacco; Carbon and nitrogen metabolism; Biochar; Gene expression

2015-10-26

中國(guó)煙草總公司特色優(yōu)質(zhì)煙葉開(kāi)發(fā)重大專(zhuān)項(xiàng)濃香型項(xiàng)目(110201101001 TS-01);江西煙葉物質(zhì)代謝規(guī)律及調(diào)控研究(201201003)。

張嘉煒(1990─)，女，河南鄭州人，碩士研究生，研究方向：煙草生物技術(shù)。*通訊作者：崔紅。

S572

A

1001-8581(2016)03-0001-06

曾小軍)