焦淑娟， 鄭士奇， 王世雯， 阿仙姑·哈斯木， 尼加提·熱合木

(新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院1病理解剖學(xué)教研室， 2法醫(yī)學(xué)2012-2班， 烏魯木齊　830011)

?

·民族腫瘤學(xué)·

Nrf2蛋白在維吾爾族婦女宮頸鱗癌中的表達及意義

焦淑娟1， 鄭士奇2， 王世雯2， 阿仙姑·哈斯木1， 尼加提·熱合木1

(新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院1病理解剖學(xué)教研室，2法醫(yī)學(xué)2012-2班， 烏魯木齊830011)

摘要:目的探究Nrf2蛋白在維吾爾族宮頸鱗癌組織中的表達以及對宮頸癌細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡等生物學(xué)行為的影響。方法運用免疫組織化學(xué)方法檢測宮頸鱗癌組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)和正常宮頸組織中Nrf2與Keap1蛋白的表達。在細胞水平，運用基因沉默技術(shù)下調(diào)SiHa細胞中NFE2L2基因的表達，并通過qRT-PCR和蛋白印跡法檢測NFE2L2 mRNA和蛋白水平相應(yīng)變化；Transwell小室實驗及流式細胞術(shù)等技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染NFE2L2-siRNA后SiHa細胞遷移、侵襲、凋亡及細胞周期的改變。結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示維吾爾族宮頸鱗癌組織中Nrf2蛋白的陽性表達率(66.3%)明顯高于CIN組織(56.5%)和正常宮頸組織(27.3%)(P<0.001)；轉(zhuǎn)染NFE2L2-siRNA下調(diào)宮頸癌SiHa細胞中NFE2L2基因的表達后，NFE2L2 mRNA水平和蛋白水平表達下降，同時SiHa細胞的遷移的細胞數(shù)目(103.00±37.58/125.33±34.67)和侵襲數(shù)目(82.25±23.56/54.75±9.07)較空白對照組和陰性對照組明顯減少(P<0.01)，細胞周期阻滯在G0/G1期，SiHa細胞凋亡率顯著增加(P<0.01)。結(jié)論維吾爾族宮頸鱗癌組織中存在Keap1-Nrf2通路的激活，NFE2L2基因沉默可明顯抑制宮頸癌SiHa細胞的增殖、遷移及侵襲能力，并促進細胞凋亡。

關(guān)鍵詞：宮頸鱗癌； Nrf2； RNA干擾

宮頸癌(cervical cancer,CC)是女性最常見的惡性腫瘤之一，具有惡性程度高、病死率高的特點。尤其在新疆南疆地區(qū)，維吾爾族婦女宮頸癌發(fā)病率明顯高于同地區(qū)的其他民族，是當(dāng)?shù)貪h族人群的3～4倍，患病率約527/10萬，病死率居全國少數(shù)民族之首，約15.78/10萬[1-3]，而且發(fā)病趨勢更加年輕化[4]。目前復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是宮頸癌治療失敗和死亡的主要原因，且大多數(shù)患者對化療藥物抵抗，對初始的化療通常沒有反應(yīng)[5]。因此，尋找宮頸癌早期診斷敏感可靠的分子標(biāo)志物并降低化療藥物的耐藥性臨床意義重大。

核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor,NFE2L2)是一個重要的保護性轉(zhuǎn)錄因子，其編碼的蛋白為Nrf2，在氧化應(yīng)激應(yīng)答中起核心調(diào)控作用。Nrf2蛋白通過與胞漿蛋白Kelch樣環(huán)氧氮丙烷相關(guān)蛋白1(kelch-like ECH2 associated protein 1,Keap1)以及抗氧化反應(yīng)原件(antioxidant response elements,ARE)相互作用，啟動下游編碼抗氧化蛋白和二相解毒酶的基因表達，發(fā)揮細胞保護作用。由于Nrf2-ARE信號通路在抗腫瘤、抗炎、抗凋亡等方面可發(fā)揮重要的細胞保護作用，并與抗腫瘤藥物的耐藥性有關(guān)，逐漸引起人們的重視[6]。Nrf2蛋白在人類肺癌、食管癌、卵巢癌等腫瘤中過表達，被認為腫瘤發(fā)生發(fā)展的“催化分子”[7-11]。但目前對于Nrf2蛋白在宮頸癌中是否存在表達異常，也可作為一個催化分子觸發(fā)和加強HPV的致癌性的報道較少。因此，本研究旨在探討Nrf2蛋白在維吾爾族宮頸癌組織中的表達及在宮頸癌發(fā)生與發(fā)展過程中的作用，進一步揭示宮頸癌浸潤、轉(zhuǎn)移的分子調(diào)控機制，為宮頸癌生物學(xué)治療提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞系人子宮頸癌SiHa細胞株購自Procell公司，人子宮頸癌Hela和C33a細胞株由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心提供。

1.1.2組織標(biāo)本收集新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科2013年1月—2015年6月門診及住院手術(shù)患者的石蠟包埋組織標(biāo)本，所有標(biāo)本入組前均由病理科確診。宮頸鱗狀細胞癌石蠟包埋組織89例，術(shù)前未接受放化療或其他特殊處理。其中高分化38例，中分化23例，低分化28例；按照臨床分期(FIGO，2009)分為：ⅠB期以下54例，ⅡB期以上35例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠處轉(zhuǎn)移58例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠處轉(zhuǎn)移31例。另選取宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)Ⅱ～Ⅲ組織46例，正常宮頸組織66例。所有患者的臨床病理學(xué)資料收集前均征得患者本人及家屬同意，并簽署知情同意書。實驗經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)通過。

1.1.3主要儀器PCR 擴增儀(Thermo)，酶標(biāo)儀(Bio-Rad)，蛋白轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad)，Real Time PCR instrument(ABI)，Transwell小室(Coming)，化學(xué)發(fā)光成像儀(上海勤祥公司Chemiscope 3000)，手動單道移液器(Eppendorf)。

1.1.4主要試劑DMEM(高糖)、0.25%胰酶、胎牛血清均購自Gibco，青霉素-鏈霉素雙抗(美國Hyclone公司)，Nrf2鼠抗人多克隆抗體、Keap1鼠抗人多克隆抗體均購自美國Abcam公司，β-actin(BOSTER)，SYBR Select Master Mix(ABI)，LipofectamineRNAiMAX試劑、Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒、Negative RNAi均購自美國Life technologies公司。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué)法用免疫組織化學(xué)檢測宮頸鱗癌組織、CIN組織以及正常宮頸組織中Nrf2和Keap1蛋白的表達。按照免疫組織化學(xué)SP法進行染色，Nrf2和Keap1工作液濃度分別為1∶300和1∶5000。每張切片隨機選取5個高倍視野，按陽性細胞數(shù)占同類細胞的百分比進行判斷，陽性細胞數(shù)<10%定義為陰性，≥10%定義為陽性。

1.2.2NFE2L2 siRNA細胞轉(zhuǎn)染SiHa細胞生長至貼壁80%～90%時準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染，胰酶消化，接種于6孔培養(yǎng)板，孵育24 h。實驗選取2條NFE2L2siRNA靶序列，分別命名為siRNA1和siRNA2，siRNA1的靶序列為5′-CAAACUGACAGAAGUUGACAAUUAU-3′，siRNA2的靶序列為5′-UGAAGCUCAACUUGCAUUAAUU-3′。以正常生長的SiHa細胞作為空白對照，陰性對照為轉(zhuǎn)染隨機序列。按照說明書制備siRNA/lipofectamin3000復(fù)合物后將其加到含有細胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)板的孔中，細胞在CO2培養(yǎng)箱中37℃溫育48 h后，進行轉(zhuǎn)染后的其他檢測步驟。

1.2.3蛋白印記法檢測取≥1×106的細胞，加入500 μL RIPA裂解液，充分混勻。冰上放置20 min，4℃，1 2000 r/min離心15 min，收集上清，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。蛋白經(jīng)凝膠進行電泳分離后，穩(wěn)壓冰浴電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗孵育4℃過夜(Nrf2的抗體稀釋比為1∶500，β-actin抗體稀釋比為1∶500)，二抗孵育后，AP法顯色，化學(xué)發(fā)光儀檢測、拍照，與β-actin比較，計算目的蛋白的表達豐度。

1.2.4RNA提取及qRT-PCR檢測收集細胞，加入1 mLTrizol，室溫靜置15 min，加入200 μL氯仿，室溫靜置5 min離心15 min后取上清加入等體積異丙醇，顛倒混勻，-20℃靜置30 min，離心15 min后棄上清，加入75%乙醇清洗RNA沉淀，離心棄上清保留沉淀，室溫干燥2～3 min后用RNase-free H2O溶解RNA，檢測RNA濃度和純度。NFE2L2cDNA引物：正義鏈：5′-TCAGCGACGGAAAGAGTATGA -3′，反義鏈：5′-CCACTGGTTTCTGACTGGATGT-3′。β-actincDNA引物：正義鏈：5′-ATGATGATATCGCCGCGCTC -3′，反義鏈：5′-TCGATGGGGTACTTCAGGG -3′。利用SYBR Green染料檢測目的基因的表達情況，并將β-actin作為內(nèi)參照。總反應(yīng)體積為20 μL，反應(yīng)條件：50℃ 2 min ，95℃ 2 min預(yù)變性后，95℃變性15 s，60℃退火60 s，共進行 40個循環(huán)擴增。采用相對定量公式2-△△Ct計算目的基因的相對表達量。

1.2.5細胞凋亡實驗取處于對數(shù)生長期SiHa細胞，消化、收集細胞，用4℃預(yù)冷的PBS洗細胞2次，以1 mL結(jié)合緩沖液重新懸浮細胞，使其濃度為1×106個/mL，將100 μL的細胞懸液加入5 mL流式管中，每管加入10 μL的碘化丙啶，避光均勻15 min后，流式細胞儀上機檢測。

1.2.6Transwell小室體外遷移實驗待測細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，消化細胞，在下室加入600 μL含10%血清的培養(yǎng)基，上室加入100 μL細胞懸液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后用鑷子取出小室移到4%的甲醛室溫固定10 min，后轉(zhuǎn)入甲醇中，室溫透化20 min Giemsa染液的孔中室溫染色15～30 min，移至載玻片上，顯微鏡下取5個隨機視野計數(shù)，統(tǒng)計結(jié)果。

1.2.7Transwell小室體外侵襲實驗Matrigel在4℃過夜融化，用4℃無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel至終濃度1 mg/mL，在小室的上室底部中央加入100 μL稀釋后的Matrigel，37℃溫育4～5 h使其干成膠狀；后續(xù)步驟同遷移實驗。

2結(jié)果

2.1免疫組織化學(xué)檢測及臨床病理學(xué)特征分析免疫組化結(jié)果顯示：在宮頸正常組織中Nrf2陽性表達主要定位于細胞漿中(圖1a)，在CIN和宮頸癌組織中Nrf2陽性表達主要定位在細胞胞核(圖1b、1c)；在宮頸正常組織和CIN組織中Keap1陽性表達主要定位于細胞核中(圖1d、1e)，在癌組織中Keap1陽性表達主要定位在細胞胞漿(圖1f)。在89例維吾爾族宮頸鱗狀細胞癌組織中，Nrf2蛋白的陽性表達率為66.3%(59/89)，顯著高于CIN組織(56.5%)和正常宮頸組織(27.3%)中的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；Keap1蛋白的陽性表達率為22.5%(20/89)，顯著低于CIN組織(41.3%)和正常宮頸組織(57.6%)中的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。在維吾爾族婦女宮頸鱗癌中Nrf2蛋白的表達與腫瘤的臨床分期(P<0.001)、分化程度(P<0.05)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)有關(guān)；在維吾爾族婦女宮頸鱗癌中Keap1的表達與腫瘤的臨床分期(P<0.05)有關(guān)(表1)。

a: 正常宮頸組織 b: CIN組織 c:宮頸鱗癌組織

d: 正常宮頸組織 e: CIN組織 f:宮頸鱗癌組織

圖1　免疫組化檢測Nrf2、Keap1蛋白在維吾爾族宮頸病變組織中的表達(×200)

2.2Nrf2蛋白在宮頸癌細胞株SiHa、Hela、C33a中的表達qRT-PCR結(jié)果顯示，SiHa、Hela及C33a細胞中NFE2L2 mRNA的相對表達量分別為(1.058±0.408)、(0.843±0.086)、(0.695±0.073)。SiHa細胞中NFE2L2 mRNA的表達量顯著高于Hela和C33a細胞(P<0.05)，故選用SiHa細胞作為后續(xù)的實驗對象。

2.3Nrf2表達的鑒定蛋白印跡法結(jié)果顯示，Nrf2蛋白條帶在90 KDa處顯色，內(nèi)參β-actin蛋白條帶在42 KDa處顯色(圖2a)。經(jīng)軟件分析各條帶的灰度值，以β-actin蛋白為內(nèi)參，對Nrf2蛋白的相對表達量進行統(tǒng)計學(xué)分析，在SiHa細胞中，siRNA1組中Nrf2蛋白的相對表達量為(0.417±0.068)，siRNA2組中Nrf2蛋白的相對表達量為(0.350±0.046)，均顯著低于空白對照組(1.283±0.086)中Nrf2蛋白的相對表達量(圖2b，P<0.001)。qRT-PCR結(jié)果顯示，siRNA1組中NFE2L2 mRNA水平相對表達量為(0.263±0.090)， siRNA2組中NFE2L2 mRNA水平相對表達量為(0.319±0.098)，均顯著低于空白對照組的(1.058±0.408)和陰性對照組的(0.965±0.223)表達(P<0.05)。

a: SiHa細胞中Nrf2及β-actin蛋白表達 b: 各組SiHa細胞中Nrf2蛋白相對表達量

注: 與正常對照組比較,*P<0.001。

圖2蛋白印跡法檢測SiHa細胞中各組Nrf2蛋白的表達

2.4下調(diào)Nrf2對SiHa細胞遷移和侵襲的影響Transwell遷移結(jié)果顯示，siRNA1組中細胞遷移的數(shù)目為(103.00±37.58)個，siRNA2組中細胞遷移的數(shù)目為(125.33±34.67)個，明顯少于空白對照組的(194.00±33.85)和陰性對照組的(216.75±12.28)(表2、圖3)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。Transwell侵襲結(jié)果顯示，siRNA1中穿過小室基質(zhì)膠的細胞數(shù)目為(82.25±23.56)個，siRNA2中穿過小室基質(zhì)膠的細胞數(shù)目為(54.75±9.07)個，明顯少于空白對照組的(159.00±7.55)和陰性對照組的(170.67±12.86)(表2、圖4)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表2NFE2L2siRNA轉(zhuǎn)染SiHa細胞48h后各組細胞

組別SiHa細胞遷移數(shù)目/個SiHa細胞侵襲數(shù)目/個空白對照組194.00±33.85159.00±7.55陰性對照組216.75±12.28170.67±12.86siRNA1組103.00±37.58*#82.25±23.56*#siRNA2組125.33±34.67*#54.75±9.07*#

注： 與空白對照組比較,*P<0.01; 與陰性對照組比較,#P<0.01。

a: 空白對照組

b： 陰性對照組

c： siRNA1組

d：siRNA2組

圖3Transwell遷移實驗檢測NFE2L2-siRNA轉(zhuǎn)染SiHa后細胞遷移能力變化

a: 空白對照組

b： 陰性對照組

c： siRNA1組

d：siRNA2組

圖4Transwell侵襲實驗檢測NFE2L2-siRNA轉(zhuǎn)染SiHa后細胞侵襲能力變化

2.5下調(diào)NFE2L2表達對細胞周期的影響細胞周期結(jié)果顯示， NFE2L2-siRNA轉(zhuǎn)染SiHa細胞48 h后，siRNA1組中G0/G1期細胞數(shù)為(63.83±3.2)%，siRNA2組中細胞G0/G1期細胞數(shù)為(64.60±4.06)%，明顯多于陰性對照組的(53.27±2.11)%和空白對照組的(54.47±3.01)%(表3、圖5)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。siRNA1組中S期細胞數(shù)為(35.87±2.79)%，siRNA2組中細胞S期細胞數(shù)為(33.97±1.82)%，明顯少于陰性對照組的(42.93±1.95)%和空白對照組的(41.60±1.56)%(表3、圖5)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

表3NFE2L2siRNA轉(zhuǎn)染SiHa細胞48 h后細胞周期時

組別G0/G1SG2/MSiHa細胞凋亡率空白對照組54.47±3.0141.60±1.563.93±3.192.93±0.67陰性對照組53.27±2.1142.93±1.953.73±3.612.678±0.38siRNA1組63.83±3.29*35.87±2.79*0.27±0.4613.73±0.50*#siRNA2組64.60±4.06*33.97±1.82*1.40±2.4214.13±0.51*#

注： 與空白對照組比較，*P<0.001; 與陰性對照組比較#P<0.001。

a: 空白對照組

b： 陰性對照組

c： siRNA1組

d：siRNA2組

圖5流式細胞術(shù)檢測NFE2L2-siRNA轉(zhuǎn)染SiHa后細胞周期時相的改變

2.6下調(diào)NFE2L2表達對細胞凋亡的影響細胞凋亡結(jié)果顯示，siRNA1組中細胞早期凋亡率為(13.73±0.50)%，siRNA2組中細胞早期凋亡率為(14.13±0.51)%，均顯著高于空白對照組的(2.93±0.67)%和陰性對照組的(2.678±0.38)%(表3、圖6)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

a: 空白對照組

b： 陰性對照組

c： siRNA1組

d：siRNA2組

圖6流式細胞術(shù)檢測NFE2L2-siRNA轉(zhuǎn)染SiHa后細胞凋亡率的改變

3討論

Nrf2蛋白是Moi等[12]于1994年首次報道，屬CNC(cap’N’collar)轉(zhuǎn)錄因子家族，是位于細胞質(zhì)中的可溶性蛋白，碳端有一個亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)蛋白的DNA結(jié)合區(qū)。Nrf2蛋白是外源性有毒物質(zhì)和氧化應(yīng)激的感受器，在參與細胞抗氧化應(yīng)激和外源性有毒物質(zhì)誘導(dǎo)的主要防御機制中發(fā)揮重要的作用。近年來研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Keap1-Nrf2通路在氧化應(yīng)激應(yīng)答中起核心調(diào)控作用，其一方面保護正常細胞免受致癌作用發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，另一方面又促進惡性轉(zhuǎn)化細胞的生存。動物研究發(fā)現(xiàn)敲除NFE2L2基因的小鼠更易受到化學(xué)性致癌因子的影響[13-14]。靜脈注射Lewis肺癌細胞系的小鼠敲除NFE2L2基因后肺癌轉(zhuǎn)移的結(jié)節(jié)增加[15]。表明NFE2L2在防止原發(fā)性腫瘤的生長和抗腫瘤轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。另一方面Nrf2蛋白與肺癌、食管癌、卵巢癌等腫瘤的研究都證實了增加Nrf2蛋白的活化與腫瘤的增殖和化療藥物的抵抗有關(guān)，這可能是通過誘導(dǎo)抗氧化基因?qū)崿F(xiàn)的，病人的生存和多元統(tǒng)計分析也進一步證實在腫瘤患者中Nrf2蛋白是一個不良的預(yù)后因素[16-20]，上述研究提示Nrf2蛋白在腫瘤中有雙面性，有關(guān)Nrf2蛋白對宮頸癌細胞的增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移和凋亡的影響，國內(nèi)外尚無相關(guān)報道，其作用機制尚需進一步研究。

Ma等[21]報道在宮頸癌組織中Nrf2蛋白表達量顯著增加，Ⅱ期和Ⅲ期宮頸鱗癌組織中Nrf2蛋白的表達量明顯高于Ⅰ期，并與患者的生存期呈負相關(guān)，與宮頸癌的病理分級、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性。毛景濤等[22]報道Nrf2蛋白在食管癌中陽性率為78.13%，顯著高于癌旁組織，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。Kawasaki等[16]研究也表明在胃癌中Nrf2蛋白高表達與腫瘤的大小、分化程度、病理分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，Nrf2蛋白陽性患者比陰性患者預(yù)后差。本研究的免疫組化結(jié)果顯示，宮頸癌及CIN組織中Nrf2蛋白陽性表達主要定位于細胞核，而正常宮頸組織中Nrf2蛋白陽性表達主要定位于細胞漿，提示在宮頸癌中Nrf2被激活，入核發(fā)揮作用。Nrf2蛋白的表達與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及病理分期相關(guān)(P<0.05)。這一結(jié)果與Ma等[21]的研究結(jié)果并不完全一致，盡管都是針對國內(nèi)宮頸鱗癌人群的研究，可能是由民族差異導(dǎo)致的，后期需要進一步擴大樣本量進行驗證?；谠谡m頸組織、CIN和宮頸癌中Nrf2蛋白的表達存在顯著差異，且隨著宮頸病變的進展Nrf2的表達量逐漸升高，因此檢測Nrf2蛋白的表達可以作為宮頸癌的早期篩查的指標(biāo)。

本研究選用SiHa、Hela、C33a 3株宮頸癌細胞株，運用qRT-PCR技術(shù)檢測NFE2L2在宮頸癌不同細胞株的本底表達，結(jié)果顯示NFE2L2在SiHa細胞中呈相對高表達，而在Hela和C33a細胞中表達量相對較低。提示在不同細胞類型的腫瘤中，NFE2L2可能通過不同的作用機制對細胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生不同的影響。

多項研究表明Nrf2下游抗氧化基因血紅素氧合酶1(hemeoxygenase-1,HO-1)與NAD(P)H苯醌氧化還原酶-1(NAD(P)H-quinoneoxidoreductase 1,NOQ1)通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平協(xié)同性地促進腫瘤增殖，抑制腫瘤凋亡[23]。Singh等[24]的研究發(fā)現(xiàn)在非小細胞肺癌的模型中，通過siRNA抑制NFE2L2的表達并聯(lián)合卡鉑可以顯著抑制腫瘤的生長。Ma等[21]研究結(jié)果顯示,在宮頸癌Caski細胞中通過shRNA下調(diào)NFE2L2的表達后，顯著抑制腫瘤細胞增殖，并增加對化療藥物的敏感性。張鈞等[25]報道抑制食管癌細胞中NFE2L2的表達后，細胞增殖能力明顯減弱，細胞凋亡增加，抗凋亡蛋白Bcl-2和HO-1表達量明顯下調(diào)。本研究結(jié)果也證實了沉默NFE2L2表達后促進細胞凋亡，SiHa細胞G0/G1細胞數(shù)顯著增加，S期細胞數(shù)顯著減少，細胞周期阻滯在G0/G1期，細胞增殖受阻。由于HO-1有促進細胞增殖和抗凋亡作用，推測Nrf2可能通過上調(diào)HO-1抑制細胞凋亡，具體機制有待進一步研究。

Shen等[9]的研究發(fā)現(xiàn)在缺氧微環(huán)境下，抑制食管癌中NFE2L2的表達后MMP2、HIF-1ɑ和HO-1的表達降低，而E-cadherin mRNA表達上調(diào)，細胞的遷移和侵襲能力受到明顯抑制。本研究首次發(fā)現(xiàn)，抑制NFE2L2 表達后細胞的侵襲和遷移能力明顯下降，這與Zhang等[26]在肝癌中的研究報道是一致的，表明NFE2L2可促進宮頸癌細胞的遷移和侵襲能力。NFE2L2促進腫瘤侵襲和遷移的機制目前尚不完全清楚，結(jié)合NFE2L2在不同腫瘤中的研究報道推測，NFE2L2可能通過上調(diào)MMPs的表達降解細胞外基質(zhì)，促進腫瘤細胞進入血管，侵襲鄰近正常組織或遠處轉(zhuǎn)移。

綜上所述，維吾爾族宮頸鱗癌組織中存在Keap1-Nrf2通路激活，下調(diào)宮頸癌SiHa細胞中NFE2L2的表達可以抑制細胞增殖、侵襲和遷移能力，并促進細胞凋亡。本課題組后期將對與細胞增殖、遷移、侵襲及細胞周期、凋亡等相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及分子機制進行深入研究，力求為宮頸癌的靶向治療提供新的理論依據(jù)。

參考文獻：

[1]拉萊·蘇祖克,彭玉華,周康，等. 新疆不同民族宮頸癌發(fā)病趨勢分析[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2006,29(7):569-571.

[2]張國慶,劉開江,賴小軍,等.新醫(yī)大附屬腫瘤醫(yī)院1989～2002年住院病人惡性腫瘤分布[J]. 新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2003,26(4):393-395.

[3]古扎麗努爾·阿不力孜,彭芝蘭.HPV及其亞型在四川西北地區(qū)漢族及新疆南部地區(qū)維吾爾族婦女宮頸癌組織中的差異表達[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2004,24(5):408-408.

[4]彭玉華,拉萊·蘇祖克,周康,等.子宮頸癌4505例臨床分析[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2003,38(12):764-765.

[5]Pectasides D, Kamposioras K, Papaxoinis G, et al. Chemotherapy for recurrent cervical cancer[J].Cancer Treat Rev,2008,34(7):603-613.

[6]Kim SK,Yang JW,Kim MR,et al.Increased expression of Nrf2/ARE dependent anti-oxidant proteins in tamoxifen-resistant breast cancer cells[J]. Free Radic Biol Med,2008,45(4):537-546.

[7]Anju S,Vikas M, Thimmulappa RK, et al. Dysfunctional KEAP1-NRF2 Interaction in Non-Small-Cell Lung Cancer[J].PLoS Med,2006,3(10):e420.

[8]Kawasaki Y,Okumura H,Uchikado Y,et al.Nrf2 is useful for predicting the effect of chemoradiation therapy on esophageal squamous cell carcinoma[J].Ann Surg Oncol,2014,21(7):2347-2352.

[9]Shen H,Yang Y,Xia S,et al.Blockage of Nrf2 suppresses the migration and invasion of esophageal squamous cell carcinoma cells in hypoxic microenvironment[J].Dis Esophagus,2014,27(7):685-692.

[10]Bao LJ,Jaramillo MC,Zhang ZB,et al.Nrf2 induces cisplatin resistance through activation of autophagy inovariancarcinoma[J].Int J Clin Exp Pathol,2014,7(4):1502-1513.

[11]Konstantinopoulos PA,Spentzos D,Fountzilas E,et al. Keap1 mutations and Nrf2 pathway activation in epithelial?ovarian cancer[J]. Cancer Res,2011,71(15):5081-5089.

[12]Moi P, Chan K, AsunisI, et al. Isolation of NF-E2-related factor 2 (Nrf2), a NF-E2-like basic leucine zipper transcriptional activator that binds to the tandem NF-E2/AP1 repeat of the beta-globin locus control region[J].Proc Natl Acad Sci USA,1994,91(21):9926-9930.

[13]Ramos GM,Kwak MK,Dolan PM,et al. Sensitivity to carcinogenesis is increased and chemoprotective efficacy of enzyme inducers is lost in Nrf2 transcription factor-deficient mice[J].Proc Natl Acad,2001, 98 (6):3410-3415.

[14]Iida K,Itoh K,Kumagai Y,et al.Nrf2 is essential for thechemopreventive efficacy of oltipraz against urinary bladder carcinogenesis[J].Cancer Res,2004,64 (18):6424-6431.

[15]Satoh H, Moriguchi T, Taguchi K, et al. Nrf2-deficiency creates a responsive microenvironment for metastasis to the lung[J].Carcinogenesis,2010,31(10):1833-1843.

[16]Kawasaki Y,Okumura H,Uchikado Y ,et al.Nrf2 is useful for predicting the effect of chemoradiation therapy on esophageal squamous cell carcinoma[J].Ann Surg Oncol,2014,21(7):2347-2352.

[17]Yang H,Wang W,Zhang Y,et al.The role of NF-E2-related factor2 in predicting chemoresistance and prognosis in advanced non-small-cell lung cancer[J].Clin Lung Cancer,2011,12(3):166-171.

[18]Konstantinopoulos PA,Spentzos D,Fountzilas E,et al.Keap1 mutations and Nrf2 pathway activation in epithelial ovarian cancer[J]. Cancer Res, 2011,71(15):5081-5089.

[19]Hartikainen JM,Tengstrom M,Kosma VM,et al.Genetic polymorphisms and protein expression of NRF2 and sulfuredoxin predict survival outcomes in breast cancer[J]. Cancer Res,2012,72(21):5537-5546.

[20]Hu XF,Yao J,Gao SG,et al.Nrf2 overexpression predicts prognosis and 5-fu resistance in gastric cancer[J]. Asian Pac J Cancer Prev,2013,14(9):5231-5235.

[21]Ma XD,Zhang JF,Liu SJ ,et al.Nrf2 knockdown by shRNA inhibits tumor growth and increases efficacy of chemotherapy in cervical cancer[J].Cancer Chemother Pharmacol,2012,69(2):485-494.

[22]毛景濤,葉爾買克·唐沙哈爾,沈輝,等.Nrf2在食管鱗癌組織中的表達及意義[J].細胞與分子免疫學(xué)雜志,2011,27(11):1231-1233.

[23]Wagner M, Cadetg P, Ruf R, et al.Heme oxygenase-1 attenuates ischemia/reperfusion induced apoptosis and improves survival in rat renal allografts[J].Kidney Int,2003,63(4):1564-1573.

[24]Singh A,Boldin-Adamsky S,Thimmulappa RK,et al.RNAi-mediated silencing of nuclear factor erythroid-2-related factor 2 gene expression in non-small cell lung cancer inhibits tumor growth and increases efficacy of chemotherapy[J].Cancer Res,2008,68(19):7975-7984.

[25]張鈞,孔德友,張艦,等.RNA干擾Nrf2表達對食管癌生物學(xué)行為的影響[J].臨床腫瘤學(xué)雜,2014,19(12):1057-1061.

[26]Zhang MX,Zhang C,Zhang LM,et al.Nrf2 is a potential prognostic marker and promotes proliferation and invasion in human hepatocellular carcinoma[J].BMC Cancer,2015,15:531.

(本文編輯楊晨晨)

Expression and significance of Nrf2 protein in cervical squamous cell carcinoma of Uygur women

JIAO Shujuan1, ZHENG Shiqi2, WANG Shiwen2, Ayshamgul Hasimu1, Nijat Rehemu1

(1DepartmentofPathologyandPathophysiology,2Forensic2012-2Class,CollegeofPrellinialMedicine,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830000,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the expression of Nrf2 protein in cervical squamous cell carcinoma and its affection on the invasion, migration, cell cycle and apoptosis of cervical cancer cells. MethodExpression of Nrf2 and Keap1 protein in carcinoma tissues and CIN and normal cervical tissues were detected by immunohistochemistry. The NFE2L2 gene was down-regulated by gene silencing technology in SiHa cell, and the mRNA and protein expression of NFE2L2 was detected by qRT-PCR and western blot respectively. The cell migration, invasion, apoptosis and cell cycle of SiHa cell which was transfected with NFE2L2-siRNA were analyzed by transwell and flow cytometry. ResultsIn Uighur patients, the results of immunohistochemistry showed that the positive rate of Nrf2 (66.3%) in cervical squamous carcinoma tissue was obviously higher than in CIN (56.5%) and normal cervical tissue (27.3%) (P<0.001) . When the expression of NFE2L2 was down-regulated in SiHa cell, the mRNA and protein expression of NFE2L2 were declined, and the migrated cells (103.00±37.58/125.33±34.67) and invasion cells (82.25±23.56/54.75±9.07) were reduced compared to the blank control and negative control. The cell cycle of SiHa were arrested at G0/G1 phase, and the apoptosis rate of SiHa cell was increased significantly (P<0.01). ConclusionKeap1-Nrf2 pathway was activated in cervical squamous cell carcinoma of Uighur patient. The gene silence of NFE2L2 could obviously inhibit the cell proliferation, migration and invasion ability, and promote cell apoptosis of cervical cancer cell SiHa.

Keywords：Cervical cancer; Nrf2; siRNA

[收稿日期：2016-03-15]

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.04.007

中圖分類號：R737.33

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1009-5551(2016)04-0411-07

作者簡介：焦淑娟(1991-)，女，在讀碩士，研究方向：腫瘤分子病理。通信作者：尼加提·熱合木，男，維吾爾族，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：腫瘤病理基礎(chǔ)研究, E-mail: njt60@sina.com。

基金項目：國家自然科學(xué)基金(81360332)