劉超+支崇遠(yuǎn)+李培林+易婷婷+張立微

摘要： 以浮游硅藻舟形藻（Planktonic diatoms Navicula）為受試藻，研究其在不同濃度Cu2+ 脅迫下生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)變化特征。試驗(yàn)以96 h半致死濃度（EC50）、葉綠素a 含量及綜合運(yùn)動(dòng)等指標(biāo)研究Cu2+ 對(duì)舟形藻的毒性響應(yīng)。Cu2+ 對(duì)舟形藻 96 h EC50 值為 4.510 mg/L；Cu2+ 對(duì)舟形藻葉綠素a 累積最大抑制率為50%；運(yùn)動(dòng)速率在1.127 5 mg/L附近達(dá)到最高，表現(xiàn)出“中毒興奮”，隨后速率線性下降。舟形藻葉綠素a 含量對(duì)Cu2+ 反應(yīng)不敏感，其運(yùn)動(dòng)狀態(tài)可綜合指示Cu2+ 含量。利用舟形藻作為指示種來(lái)反映水體受Cu2+污染程度具有一定的可行性，同時(shí)可為農(nóng)業(yè)、工業(yè)及生活污水中的Cu2+監(jiān)測(cè)及評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 舟形藻；Cu2+ 脅迫；急性毒性；生長(zhǎng)；運(yùn)動(dòng)

中圖分類號(hào)： X52 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）03-0373-03

Cu2+ 是舟形藻生長(zhǎng)必需的微量營(yíng)養(yǎng)元素之一，但當(dāng)其超過正常需求量時(shí)，Cu2+會(huì)對(duì)硅藻產(chǎn)生毒性作用[1-2]。隨著人類對(duì)環(huán)境的各類干預(yù)，環(huán)境中Cu2+ 濃度大大提高[3]。由于重金屬有著毒性大、不易被代謝及易被生物富集等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅著水生生物和人類的生存[4]。硅藻為水生生態(tài)系統(tǒng)的初級(jí)生產(chǎn)者，在整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)與能量流動(dòng)中有著重要的作用[5]。進(jìn)入硅藻中的 Cu2+ 可通過水生食物鏈?zhǔn)澄锞W(wǎng)富集到高等動(dòng)物體內(nèi)，最終進(jìn)入人體危害人類健康，同時(shí) Cu2+ 將影響硅藻細(xì)胞的種群增長(zhǎng)，導(dǎo)致水生生態(tài)系統(tǒng)中初級(jí)生產(chǎn)力下降，進(jìn)而破壞整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的平衡[6-7]。

貴州省貴陽(yáng)市的小車河濕地作為居民飲用水源地之一，水質(zhì)長(zhǎng)期以來(lái)受到Cu2+ 等重金屬的影響，其治理與監(jiān)測(cè)備受關(guān)注。本研究通過 Cu2+ 的急性毒性脅迫對(duì)舟形藻的生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)過程的觀察[8]，對(duì)舟形藻在相同脅迫條件下表現(xiàn)出不同的生長(zhǎng)及運(yùn)動(dòng)特點(diǎn)進(jìn)行了線性相關(guān)分析，為探索舟形藻對(duì)Cu2+ 毒性脅迫的響應(yīng)、舟形藻生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)速率與Cu2+濃度間的變化關(guān)系奠定研究基礎(chǔ)[9]，同時(shí)為舟形藻作為指示種，監(jiān)測(cè)水環(huán)境重金屬污染提供新角度[10]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藻種及培育方法

舟形藻采自貴州省貴陽(yáng)市小車河濕地，應(yīng)用微藻微吸管分離方法分離。原液經(jīng)沉淀、過濾（0.45 μm 微孔濾膜），121.3 ℃滅菌 30 min。采用自制培養(yǎng)液加富的滅菌原液中培養(yǎng)。置于無(wú)菌培養(yǎng)室中培養(yǎng)，溫度（20±1） ℃，光照度 66 μmol/（m2·s），光-暗周期12 h-12 h，pH 值7.5 左右。經(jīng)預(yù)培養(yǎng)和擴(kuò)大培養(yǎng)得到舟形藻純種，在獲得足夠藻液后進(jìn)行試驗(yàn)。微藻培養(yǎng)瓶定時(shí)搖動(dòng)3次/d，預(yù)防附壁生長(zhǎng)。

1.2 試驗(yàn)儀器及設(shè)備

光學(xué)顯微鏡（深圳市新明光學(xué)儀器有限公司，XSP-2CA生物顯微鏡）、光學(xué)顯微鏡物鏡測(cè)微尺（深圳市新明光學(xué)儀器有限公司，C6 物鏡測(cè)微尺）、電子秒表（PC2810）、照相機(jī)（Nikon-COOLPIX5400）、載物片、血球計(jì)數(shù)板。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 藻種擴(kuò)大培養(yǎng) 試驗(yàn)藻種在自制培養(yǎng)液加富的滅菌原液中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，自制培養(yǎng)基各成分質(zhì)量濃度為：NH4Cl 15 mg/L，MgCl2·6H2O 12 mg/L，MgSO4·7H2O 15 mg/L，KH2PO4 2.3 mg/L，NaHPO4 50 mg/L，F(xiàn)eC6H5O7·5H2O 50 mg/L，Na2EDTA·2H2O 45 mg/L，MnCl2·4H2O 160 mg/L，ZnSO4 25 mg/L，CoCl2·6H2O 10 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.007 mg/L，維生素B12 0.5 mg/L，維生素B1 50 mg/L，維生素H 0.5 mg/L。

1.3.2 急性毒性試驗(yàn) 試驗(yàn)設(shè)置 1個(gè)空白組和 4個(gè)試驗(yàn)組，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果各組中Cu2+的質(zhì)量濃度分別為0、1.5、2.5、3.5、4.5 mg/L。硅藻初始含量為70 000 cells/mL。每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置3個(gè)平行組，試驗(yàn)所有容器和培養(yǎng)基均經(jīng)過121 ℃、20 min高壓蒸氣滅菌。試驗(yàn)共進(jìn)行96 h，0、24、48、72、96 h取樣后，使用血球計(jì)數(shù)板觀察及統(tǒng)計(jì)運(yùn)動(dòng)數(shù)據(jù)。觀察時(shí)，搖勻培養(yǎng)瓶至藻液顏色統(tǒng)一，每日定時(shí)取樣，取1 mL充分混勻的藻液，加適量魯格氏固定液（Lugol），混勻后取 200 μL 藻液用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，每個(gè)樣品計(jì)數(shù)3次，取平均值。之后按照下式計(jì)算出抑制率X=（I0-I）/I0×100%，以抑制率作圖，利用加權(quán)直線回歸法建立線性回歸方程，并計(jì)算各時(shí)間段的半致死濃度（EC50）值。

1.3.3 亞急性毒性試驗(yàn) 設(shè)置1個(gè)對(duì)照組和4個(gè)試驗(yàn)組，根據(jù)急性毒性試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置質(zhì)量濃度分別為96 h EC50，96 h EC50/2，96 h EC50/4，96 h EC50/8。硅藻初始含量為7 000 cells/mL。容器為500 mL三角培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)體積為200 mL。共進(jìn)行15 d，其他條件與“1.1”節(jié)相同。在試驗(yàn)的前5 d每天對(duì)各組進(jìn)行取樣，之后每2 d取樣1次，共取樣9次，每次取樣10 mL，其中5 mL 進(jìn)行葉綠素a 含量測(cè)定并對(duì)硅藻細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)進(jìn)行觀察。

1.3.3.1 葉綠素a含量測(cè)定 取5 mL藻液，應(yīng)用文獻(xiàn)[11]中葉綠素a含量的測(cè)定方法，對(duì)硅藻葉綠素a含量進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3.2 舟形藻運(yùn)動(dòng)狀態(tài)觀察與分析 對(duì)舟形藻的運(yùn)動(dòng)過程錄像，利用血球計(jì)數(shù)板上線的交點(diǎn)記錄硅藻的行動(dòng)距離，并用秒表計(jì)時(shí)，對(duì)計(jì)數(shù)框內(nèi)硅藻的最大運(yùn)動(dòng)速率和平均運(yùn)動(dòng)速率進(jìn)行計(jì)算。舟形藻運(yùn)動(dòng)狀態(tài)參數(shù)包括平均運(yùn)動(dòng)速率、最大運(yùn)動(dòng)速率和運(yùn)動(dòng)硅藻占總數(shù)的比率。通過錄像觀察，對(duì)計(jì)數(shù)框內(nèi)硅藻進(jìn)行計(jì)數(shù)，得出硅藻總數(shù)和30 s內(nèi)所有運(yùn)動(dòng)硅藻數(shù)量，并記舟形藻運(yùn)動(dòng)2 μm所耗時(shí)間。以上過程按照計(jì)數(shù)框內(nèi)硅藻的數(shù)量重復(fù)3～5次，其中，最大運(yùn)動(dòng)速率取最大值，平均運(yùn)動(dòng)速率取平均值，運(yùn)動(dòng)硅藻占總數(shù)的比率取各計(jì)數(shù)框中運(yùn)動(dòng)硅藻總數(shù)占所有計(jì)數(shù)框中硅藻總數(shù)的比率。

2 結(jié)果與討論

2.1 Cu2+急性暴露對(duì)舟形藻的影響

在不同質(zhì)量濃度Cu2+脅迫下，舟形藻的生長(zhǎng)曲線見圖1。與空白組相比，添加1.5、2.5 mg/L Cu2+的試驗(yàn)組舟形藻的生長(zhǎng)受到一定的促進(jìn)，且促進(jìn)程度與Cu2+ 質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，表現(xiàn)出明顯的毒性興奮效應(yīng)。在 2.5 mg/L試驗(yàn)組中，在24 h時(shí)抑制率為 -2.44%，之后呈線性增加；而在3.5 mg/L、4.5 mg/L 試驗(yàn)組中，在96 h時(shí)抑制率為0.23%、0.56%，表明其生長(zhǎng)明顯受到抑制。

使用加權(quán)直線回歸法分析計(jì)算，Cu2+對(duì)舟形藻各時(shí)間的EC50和95% 置信區(qū)間見表1。各時(shí)間段EC50 值較為穩(wěn)定，都在4.510 mg/L左右，說(shuō)明隨時(shí)間的延長(zhǎng)Cu2+ 對(duì)舟形藻的毒性無(wú)降低，未產(chǎn)生長(zhǎng)期毒性，不會(huì)對(duì)舟形藻產(chǎn)生持續(xù)性影響。

2.2.1 Cu2+對(duì)舟形藻葉綠素a含量的影響 在不同質(zhì)量濃度Cu2+ 脅迫下的藻液，經(jīng)過 15 d 培養(yǎng)，以葉綠素a 的質(zhì)量濃度為指標(biāo)的曲線見圖2。在開始脅迫的前3 d葉綠素質(zhì)量濃度有明顯的增加趨勢(shì)，與對(duì)照組差距很小，但隨時(shí)間的推移Cu2+ 對(duì)舟形藻葉綠素a含量的抑制作用漸漸增大，5 d時(shí) 4.510 mg/L 的質(zhì)量濃度下對(duì)葉綠素的抑制率達(dá)到50%，最終抑制率持續(xù)下降穩(wěn)定在30%左右。表現(xiàn)出一定的質(zhì)量濃度計(jì)量效應(yīng)。7～13 d葉綠素a含量保持穩(wěn)定，而在15 d時(shí)，各組葉綠素a含量均略有增加，這可能與Cu2+ 被從離子態(tài)代謝固化為相對(duì)穩(wěn)定的化合物有關(guān)。

2.2.2 Cu2+ 對(duì)舟形藻運(yùn)動(dòng)狀態(tài)的影響

2.2.2.1 Cu2+ 對(duì)運(yùn)動(dòng)硅藻數(shù)量占總硅藻數(shù)量比率的影響 添加不同質(zhì)量濃度Cu2+ 脅迫下的舟形藻，各組中運(yùn)動(dòng)硅藻數(shù)量占總硅藻數(shù)量比率見圖3。由圖3可知：在同等條件下隨時(shí)間增長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)硅藻數(shù)量占總硅藻數(shù)量的比率減小，暴露1 d后運(yùn)動(dòng)硅藻數(shù)量占總硅藻數(shù)量的比率未出現(xiàn)明顯變化。在 2～5 d期間，隨Cu2+質(zhì)量濃度增高硅藻占總硅藻的比率出現(xiàn)顯著下降。隨后，雖有一定降低趨勢(shì)，但是變化相對(duì)較小。由此可見Cu2+對(duì)運(yùn)動(dòng)硅藻的數(shù)量有一定影響。

2.2.2.2 Cu2+ 對(duì)硅藻平均運(yùn)動(dòng)速率的影響 經(jīng)過15 d的培養(yǎng)，以最快運(yùn)動(dòng)速率為指標(biāo)的曲線見圖4。前1～3 d 速率變化較穩(wěn)定，兩端相近，中間波動(dòng)較大；之外其他的總體運(yùn)動(dòng)速率都隨質(zhì)量濃度的增高而降低，但是在4 d、2.255 mg/L 以及 7 d、1.127 5 mg/L 時(shí)出現(xiàn) 2 個(gè)異常值，平均運(yùn)動(dòng)速率分別達(dá)到1.0、1.3 μm/s，明顯偏高。但是與該組其他慢速運(yùn)動(dòng)硅藻相比，運(yùn)動(dòng)距離和時(shí)間均較短，快速運(yùn)動(dòng)2～5 s后就停止運(yùn)動(dòng)或轉(zhuǎn)為慢速運(yùn)動(dòng)。

2.2.2.3 Cu2+ 對(duì)硅藻最快運(yùn)動(dòng)速率的影響 經(jīng)過15 d的培養(yǎng)，以最快運(yùn)動(dòng)速率為指標(biāo)的曲線見圖5。除1 d和15 d速

率變化明顯之外其他的總體運(yùn)動(dòng)速率都隨質(zhì)量濃度在0.563 75 mg/L 和1.127 5 mg/L附近增高而增高，在2.255 mg/L 附近轉(zhuǎn)而降低。但是在4 d、1.127 5 mg/L 以及11 d、0.563 75 mg/L 時(shí)出現(xiàn)2 個(gè)異常值運(yùn)動(dòng)速率分別達(dá)到 0.8、1.03 μm/s，速度明顯降低。但是與該組與其他慢速運(yùn)動(dòng)硅藻相比，運(yùn)動(dòng)距離和時(shí)間均較短，快速運(yùn)動(dòng)5～7 s后就停止運(yùn)動(dòng)或轉(zhuǎn)為慢速運(yùn)動(dòng)。

3 結(jié)論

硅藻作為自然界中重要的初級(jí)生產(chǎn)者，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定起著重要作用。通過其在Cu2+脅迫下運(yùn)動(dòng)變化的研究，能為在水環(huán)境評(píng)價(jià)監(jiān)測(cè)、水污染治理等方面提供一定的理論依據(jù)。利用硅藻種類、數(shù)量及變化作為評(píng)價(jià)水生態(tài)環(huán)境質(zhì)量指示物種的做法由來(lái)已久，而利用硅藻運(yùn)動(dòng)速率變化對(duì)水質(zhì)中不同污染離子濃度測(cè)定的研究相對(duì)很少。相關(guān)研究表明，在眾多除藻劑中銅的殺藻作用有效、穩(wěn)定、價(jià)格低廉、且對(duì)人體健康的毒性作用低，目前在國(guó)外已有大量使用[12-14]。

本試驗(yàn)就96 h EC50值（4.51 mg/L）來(lái)看，參照《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》的規(guī)定[11]為中毒，與小球藻（55.62 mg/L）[15]低毒差距較大。原因是不同的藻類由于生存方式、運(yùn)動(dòng)類型及生存環(huán)境不同。另外部分Cu2+可能會(huì)被舟形藻富集代謝為相對(duì)離子態(tài)更為穩(wěn)定的化合物，對(duì)水生生物進(jìn)而對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生直接或間接的影響。

葉綠素a含量對(duì)Cu2+的反應(yīng)呈現(xiàn)一定的梯度變化，1～5 d 和對(duì)照組相比，葉綠素a的累積較快，表現(xiàn)出“促進(jìn)”作用；6～11 d后含Cu2+各組與對(duì)照組出現(xiàn)一定差異（P<0.05），而在同一天含Cu2+各組差異較小（P>0.05）。可見藻細(xì)胞中葉綠素a含量對(duì)Cu2+反應(yīng)敏感，少量Cu2+對(duì)葉綠素a 含量的累積有明顯促進(jìn)作用，但是之后隨質(zhì)量濃度增大葉綠素a含量變化則逐漸降低，表現(xiàn)出一定的抑制作用；11～15 d，葉綠素a含量的累積出現(xiàn)一定的提高，可能與Cu2+被富集代謝而濃度降低有關(guān)[16]。

Cu2+急性毒性脅迫能顯著影響舟形藻的運(yùn)動(dòng)速率。低濃度0.563 75～1.127 5 mg/L 區(qū)間內(nèi) Cu2+脅迫能刺激舟形藻運(yùn)動(dòng)，使其表現(xiàn)出毒物的“興奮效應(yīng)”，隨著脅迫濃度的增大和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，Cu2+對(duì)舟形藻的運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)出明顯的抑制效應(yīng)，在1.127 5 mg/L附近達(dá)到最高之后，速率線性下降，在2.255 mg/L趨近無(wú)脅迫速率。表明隨著脅迫濃度的提高，舟形藻細(xì)胞提高了對(duì)脅迫的適應(yīng)能力，抗性得到一定的增強(qiáng)。

硅藻在受Cu2+污染水質(zhì)處理的治理運(yùn)用方面有一定的可行性，同時(shí)對(duì)農(nóng)業(yè)、工業(yè)及生活污水中的Cu2+監(jiān)測(cè)方面有廣闊的應(yīng)用前景[1，17]。本研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)硅藻數(shù)量占總硅藻數(shù)量的比率和平均運(yùn)動(dòng)速率在2～3 d時(shí)變化較大，所以可以應(yīng)用這2個(gè)指標(biāo)在2～3 d時(shí)的值來(lái)對(duì)Cu2+的毒性進(jìn)行綜合指示。

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