王素平

摘要： 以黃瓜品種津綠11號為試驗材料，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，研究了外源葉面噴施2 mmol/L CaCl2和1 mmol/L SA預(yù)處理對低溫下黃瓜幼苗抗氧化酶同工酶的影響。結(jié)果表明：噴施2 mmol/L CaCl2對低溫處理下的黃瓜幼苗SOD和POD同工酶酶帶的條數(shù)和強度沒有明顯影響，但明顯增強了CAT同工酶酶帶的強度；噴施1 mmol/L SA明顯增強了低溫處理下黃瓜幼苗的SOD1～SOD4、POD1、POD3～POD 6、CAT1和CAT2酶帶。暗示鈣和SA通過影響抗氧化酶同工酶表達參與黃瓜植株低溫耐性的調(diào)節(jié)。

關(guān)鍵詞： 鈣；水楊酸；低溫；黃瓜；抗氧化酶；同工酶

中圖分類號： S642.201 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）03-0168-03

黃瓜（Cucumis sativus L.）是我國溫室栽培的主要蔬菜作物之一，黃瓜屬喜溫性作物，對低溫反應(yīng)很敏感[1]，在冬春設(shè)施栽培期間經(jīng)常遭受不同程度的低溫脅迫，對黃瓜植株的生長、光合、碳和氮的代謝、酶活性和干物質(zhì)積累產(chǎn)生不同程度的影響。植物體內(nèi)存在的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）等有助于植物抵御不良環(huán)境造成的活性氧傷害。Ca2+既是細胞的結(jié)構(gòu)物質(zhì)，又是耦聯(lián)胞外信號與胞內(nèi)生理生化反應(yīng)的第二信使，在調(diào)控溫度、水分以及鹽脅迫下植物防御生理響應(yīng)方面具有重要作用[2]。鈣能提高逆境下植物組織或細胞的抗性，可提高辣椒（Capsicum annuum L.）幼苗的抗寒性[3]，降低低溫脅迫下水稻（Oryza sativa L.）幼苗的丙二醛含量[4]，增強茄子（Sloanum melongena）幼苗抗膜脂過氧化能力[5]。水楊酸（salicylic acid，SA）是植物體內(nèi)普遍存在的一種小分子酚類物質(zhì)，在誘導(dǎo)植物抗病性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、激活植物過敏反應(yīng)和系統(tǒng)獲得性抗性等方面起著重要的調(diào)節(jié)作用[6]。外源SA能夠緩解低溫脅迫對黃瓜植株生長的抑制作用[7]。本試驗以黃瓜幼苗為材料，研究了外源鈣和SA預(yù)處理對低溫下黃瓜幼苗抗氧化酶同工酶的影響，探討鈣和SA對黃瓜幼苗低溫耐性的調(diào)節(jié)機制，以期為提高設(shè)施蔬菜作物低溫耐性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和處理

供試黃瓜品種為津綠11號（天津市綠豐園藝新技術(shù)開發(fā)有限公司），購自河南省商丘市種子公司。在商丘師范學(xué)院玻璃溫室內(nèi)培育黃瓜幼苗。黃瓜種子經(jīng)溫湯浸種并催芽后，于50孔穴盤中育苗，2葉1心時，定植于13 cm×12 cm軟塑料營養(yǎng)缽中，3葉1心時將黃瓜幼苗隨機分成3組，每組30株，分別進行以下不同處理。試驗共設(shè)3個處理：（1）低溫：將黃瓜幼苗放入人工氣候箱進行低溫處理，處理條件為：晝/夜溫度為15 ℃/8 ℃；光/暗時間為12 h/12 h。（2）低溫+2 mmol/L CaCl2：記作2 mmol/L Ca2+，在低溫處理黃瓜幼苗前葉面噴施CaCl2水溶液。（3）低溫+1 mmol/L SA：記作 1 mmol/L SA，在低溫處理黃瓜幼苗前葉面噴施SA水溶液。CaCl2和SA處理：采用葉面噴施法進行預(yù)處理，分別于低溫處理開始前60、48、36、24 h噴施4次，處理（1）同時噴施等體積的水，葉片正反面均噴到。所有處理均添加0.01%吐溫。

低溫處理4 d時，取黃瓜幼苗生長點下面第2張展開葉進行SOD、POD和CAT同工酶電泳。試驗重復(fù)3次。

1.2 同工酶電泳

1.2.1 酶液提取 SOD、POD和CAT同工酶電泳采用同樣的酶提取液。取黃瓜幼苗葉片0.4 g加1.5 mL磷酸鈉緩沖液（0.05 mol/L，pH值7.8，內(nèi)含0.1 mmol/L EDTA和1% PVP），冰浴研磨至勻漿。以4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清液，即得SOD、POD和CAT酶液，用于SOD、POD和CAT同工酶電泳。

1.2. 2 同工酶電泳 SOD、POD和CAT聚丙烯酰胺同工酶電泳采用垂直板電泳槽進行，分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為3.75%，在濃縮膠中穩(wěn)定電壓為90 V，進入分離膠后穩(wěn)定電壓為200 V，3～4 h完成電泳。SOD同工酶電泳采用鄰聯(lián)（二）茴香胺法[8]進行染色；POD同工酶電泳采用醋酸聯(lián)苯胺法[9]進行染色；CAT同工酶電泳在分離膠中加入總體積 0.5% 的可溶性淀粉，并采用H2O2-KI法[10]進行染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 鈣和SA對低溫下黃瓜幼苗SOD同工酶的影響

從圖1可以看出，低溫處理的黃瓜幼苗SOD同工酶顯現(xiàn)出SOD1、SOD2、SOD3、SOD4和SOD5共5條主酶帶，其中SOD2、SOD4和SOD5酶帶出現(xiàn)較早，屬于強帶；SOD1酶帶顯色較晚，著色淺，屬于弱帶。與低溫處理相比，2 mmol/L Ca2+預(yù)處理的黃瓜幼苗SOD同工酶酶帶條數(shù)不變，其著色程度與低溫處理相近；1 mmol/L SA預(yù)處理明顯增強了黃瓜幼苗SOD1～SOD4酶帶，SOD5酶帶著色程度與低溫處理相近。

2.2 鈣和SA對低溫下黃瓜幼苗POD同工酶的影響

由圖2可以看出，低溫處理的黃瓜幼苗POD同工酶顯現(xiàn)出6條主酶帶，分別為POD1、POD2、POD3、POD4、POD5和POD6，其中POD4、POD5和POD6酶帶出現(xiàn)較早，屬于強帶；POD1酶帶顯色較晚，著色淺，屬于弱帶。與低溫處理相比，2 mmol/L Ca2+預(yù)處理的黃瓜幼苗POD同工酶酶帶條數(shù)不變，其著色程度與低溫處理相近；1 mmol/L SA預(yù)處理明顯增強了黃瓜幼苗POD1、POD3～POD6酶帶，POD2酶帶著色程度與低溫處理相近。

2.3 鈣和SA對低溫下黃瓜幼苗CAT同工酶的影響

由圖3可以看出，低溫處理的黃瓜幼苗CAT同工酶顯現(xiàn)2條酶帶，分別為CAT1和CAT2。與低溫處理相比，2 mmol/L Ca2+和1 mmol/L SA預(yù)處理的黃瓜幼苗CAT同工酶酶帶條數(shù)不變，CAT1和CAT2酶帶明顯增強，尤以2 mmol/L CaCl2預(yù)處理的CAT酶帶為最強。

3 討論

活性氧包括超氧陰離子（O-2 · ）、H2O2、羥自由基（·OH）和單線態(tài)氧（1O2）等，植物中活性氧水平受抗氧化酶活性和抗氧化劑的調(diào)節(jié)?？寡趸窼OD以 O-2 · 為底物進行歧化反應(yīng)，起到清 O-2 · 的作用，其酶促反應(yīng)產(chǎn)生的H2O2仍是有毒害的，H2O2可經(jīng)POD和CAT等催化降解為無害的H2O。通過SOD、POD和CAT等抗氧化酶協(xié)同作用，使植株體內(nèi)活性氧維持在一個較低水平，減少對細胞的傷害。同工酶的功能在生理上表現(xiàn)為對代謝的調(diào)節(jié)作用，同工酶分析是認識基因存在和表達的工具[11]。

Ca2+能維持細胞壁、細胞膜及膜蛋白的穩(wěn)定性，在植物感應(yīng)、傳遞抗寒信號、產(chǎn)生生理響應(yīng)過程中起著重要作用[12-13]。Ca2+可以提高低溫脅迫下黃瓜[14]、辣椒[3]、番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）[15]、甜瓜（Cucumis melo L.）[16]和棉花（Gossypium spp.）[17]幼苗葉片SOD、POD、CAT活性，降低丙二醛含量，防止膜脂過氧化，維持膜完整性。本試驗中，葉面噴施 2 mmol/L CaCl2對低溫處理下的黃瓜幼苗SOD和POD同工酶酶帶的條數(shù)和強度沒有明顯影響，但明顯增強了CAT同工酶酶帶的強度。表明Ca2+通過影響抗氧化酶同工酶表達參與黃瓜植株低溫耐性的調(diào)節(jié)。王芳等采用CaCl2營養(yǎng)液澆灌玉米（Zea mays L.）幼苗[18]，姜秀梅等采用CaCl2葉面噴施辣椒幼苗，其研究結(jié)果均以10 mmol/L CaCl2處理緩解低溫傷害的效果最為明顯[19]。李曉明等則采用0.5 mmol/L CaCl2葉面噴施低溫下黃瓜幼苗[14]。由此可知，由于采用的植物材料和品種不同，Ca2+處理的方法、濃度、次數(shù)和時間不同，低溫處理的強度和時間長短不同，導(dǎo)致研究結(jié)果存在差異。

SA被認為是植物在脅迫反應(yīng)中產(chǎn)生的一種信號分子[20]。SA可能直接作為一種抗氧化劑淬滅活性氧或者通過激活抗氧化劑的活性調(diào)節(jié)氧化還原平衡[21-22]，通過增加維生素C和谷胱甘肽的含量，降低錳脅迫對黃瓜植株造成的氧化傷害[23]，通過調(diào)節(jié)抗氧化代謝促進鹽脅迫下蔬菜作物的生長[24]。馬德華等對黃瓜幼苗進行低溫鍛煉，可使葉片游離態(tài)SA含量增加2.5倍以上，表明SA可能與植物的抗低溫脅迫有關(guān)[25]。SA在H2O2參與下，通過減輕逆境下植物細胞的結(jié)構(gòu)變化、調(diào)節(jié)抗氧化酶活性和質(zhì)外體蛋白含量提高植物的抗寒性[26]。劉偉等、常云霞等、王紀忠等的研究表明，SA通過提高低溫脅迫下黃瓜幼苗SOD、POD和CAT活性，增強葉片細胞膜的穩(wěn)定性，緩解低溫脅迫造成的冷害[27-29]。本試驗中，葉面噴施1 mmol/L SA明顯增強了低溫處理下黃瓜幼苗的SOD1～SOD4、POD1、POD3～POD6、CAT1和CAT2酶帶，表明SA通過影響抗氧化酶同工酶表達參與黃瓜植株低溫耐性的調(diào)節(jié)。

綜上所述，葉面噴施2 mmol/L CaCl2明顯增強了低溫處理下黃瓜幼苗CAT同工酶酶帶的強度，葉面噴施1 mmol/L SA明顯增強了黃瓜幼苗SOD1～SOD4、POD1、POD3～POD6、CAT1和CAT2酶帶，表明鈣和SA通過影響抗氧化酶同工酶表達參與黃瓜植株低溫耐性的調(diào)節(jié)。

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