黃洪云

摘要： 分別以He-Ne激光輻照劑量為0.0（空白對(duì)照）、2.6、5.2、10.4、20.8、41.6 J/cm2，輻照時(shí)間為1、2、3 min的條件處理小麥干種子。將處理組幼苗置于4 ℃進(jìn)行低溫脅迫處理，以研究小麥幼苗的相對(duì)電導(dǎo)率、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、丙二醛含量等各項(xiàng)抗寒性指標(biāo)及3種保護(hù)酶（POD、SOD、CAT）活性的變化情況。結(jié)果表明，He-Ne激光預(yù)處理小麥種子不僅可顯著提高幼苗葉片的脯氨酸含量，也可提升幼苗的抗低溫脅迫能力。與對(duì)照組相比，4 ℃低溫脅迫條件下的處理組幼苗具有較高的過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）的活性及可溶性蛋白含量，而激光處理對(duì)幼苗葉片的相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量均有所降低。小麥幼苗各抗寒性指標(biāo)變化的最大幅值均出現(xiàn)在輻照劑量20.8 J/cm2、輻照時(shí)間2 min的處理?xiàng)l件下，可見此條件即為He-Ne激光輻照小麥種子提高幼苗抗寒性的最佳處理?xiàng)l件。

關(guān)鍵詞： He-Ne；激光；小麥；抗寒性指標(biāo)

中圖分類號(hào)： S512.101 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）03-0111-03

小麥?zhǔn)俏覈褪澜绲闹饕Z食作物，幾乎所有冬小麥的種植都有冷害、凍害發(fā)生，成為小麥生產(chǎn)中最大的自然災(zāi)害之一。小麥的整個(gè)生長發(fā)育過程中均需要適宜的環(huán)境溫度，當(dāng)外界氣溫、地溫明顯低于小麥的適宜溫度時(shí)，接近或超過其生理狀態(tài)所能承受的極限最低溫就會(huì)造成脅迫和傷害[1]。目前，對(duì)小麥抗寒性的研究已有可溶性蛋白含量、丙二醛含量、酶的活性等許多度量指標(biāo)。激光作為新的誘變?cè)?，已有學(xué)者采用不同類型和波長的激光輻照作物種子，成功培育出抗逆性強(qiáng)、高品質(zhì)、高產(chǎn)的新作物品種，并對(duì)其誘變機(jī)理進(jìn)行了相關(guān)報(bào)道[2-4]。本研究采用不同劑量和時(shí)間組合的 He-Ne 激光處理小麥干種子，測(cè)試小麥抗寒性方面的重要指標(biāo)，從而得到 He-Ne 激光輻照小麥種子提高幼苗抗寒性的最佳處理?xiàng)l件。

1 材料與方法

1.1 種子處理

試驗(yàn)用小麥品種為“京東8號(hào)”，挑選大小均勻的小麥種子并隨機(jī)分為5組，其中4組進(jìn)行He-Ne激光輻照處理，1組為空白對(duì)照，每組100粒種子，設(shè)3個(gè)重復(fù)。He-Ne激光波長為6 323.8 nm，激光輻照小麥種胚，輻照距離為10 cm，激光功率密度為128 mW/cm2，輻照劑量分別為2.6、5.2、10.4、20.8、41.6 J/cm2，輻照時(shí)間分別為1、2、3 min[5]。

將處理組、對(duì)照組的種子于25 ℃下恒溫培養(yǎng)14 d，使其浸種、發(fā)芽。待小麥生長到三葉期，置于4 ℃培養(yǎng)箱中低溫脅迫處理72 h，取出處理組、對(duì)照組的小麥幼苗子葉，對(duì)其相對(duì)電導(dǎo)率、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、丙二醛含量、酶活性進(jìn)行測(cè)定。

1.2 測(cè)試項(xiàng)目及方法

采用電導(dǎo)法測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率[6]。當(dāng)植物組織受到逆境傷害時(shí)，質(zhì)膜因功能受損或結(jié)構(gòu)被破壞而透性增大，細(xì)胞內(nèi)的鹽類、有機(jī)物將不同程度滲出，從而引起組織浸泡液的電導(dǎo)率發(fā)生變化。通過測(cè)定外滲液電導(dǎo)率的變化，可反映出質(zhì)膜的受損程度和所測(cè)材料抗逆性的大小，受損越重則外滲越多，電導(dǎo)率值也越大。采用磺基水楊酸提取比色法測(cè)定脯氨酸含量；采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定可溶性蛋白含量[7]；采用硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量[8]；采用NBT光化還原法測(cè)定SOD的活性[9]；采用碘量法測(cè)定過氧化氫酶（CAT）活性[9]；采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過氧化物酶（POD）活性[10]。以上試驗(yàn)均取3次重復(fù)測(cè)量的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 激光處理對(duì)葉片相對(duì)電導(dǎo)率的影響

在冷害脅迫條件下，不同激光處理劑量、處理時(shí)間下種子的相對(duì)電導(dǎo)率均呈先升高、后降低、再升高的變化曲線（圖1）。激光處理時(shí)間分別為1、2、3 min的條件下，處理劑量為2.6、5.2 J/cm2時(shí)激光處理對(duì)電導(dǎo)率的影響呈正效應(yīng)；處理劑量為10.4、20.8、41.6 J/cm2時(shí)則呈負(fù)效應(yīng)。電導(dǎo)率最低點(diǎn)均出現(xiàn)在處理劑量為20.8 J/cm2時(shí)，其中處理時(shí)間為1、2、3 min 時(shí)，電導(dǎo)率的最大下降幅度分別為12.3%、15.1%、137%。由此可見，在處理劑量為20.8 J/cm2、處理時(shí)間為 2 min 時(shí)，葉片相對(duì)電導(dǎo)率的下降幅度最大，且3個(gè)處理時(shí)間均達(dá)顯著水平。

2.2 激光處理對(duì)葉片可溶性蛋白含量的影響

不同處理劑量、處理時(shí)間下，葉片可溶性蛋白含量均呈相同變化趨勢(shì)，且曲線的走向與圖1相反（圖2）。處理時(shí)間為1、2、3 min時(shí)，可溶性蛋白含量的增加幅度均在處理劑量為20.8 J/cm2時(shí)達(dá)最大，分別為5.8%、10.5%、4.5%。由此可見，處理劑量為20.8 J/cm2、處理時(shí)間為2 min時(shí)，葉片可溶性蛋白含量的增加幅度最大，并達(dá)顯著水平，其他2個(gè)處理時(shí)間下均未達(dá)到顯著水平。

2.3 激光處理對(duì)葉片脯氨酸含量的影響

不同處理?xiàng)l件下，葉片的脯氨酸含量均呈先升高、后降低、再升高、再降低的振蕩型變化曲線（圖3）。在處理時(shí)間為1、2、3 min時(shí)，與對(duì)照組相比只有處理劑量為5.2 J/cm2時(shí)葉片的脯氨酸含量下降，其他處理劑量下均上升，上升幅度于處理劑量為20.8 J/cm2時(shí)達(dá)到最大，分別為17.9%、27.9%、13.9%，且均達(dá)到顯著水平。

2.4 激光處理對(duì)葉片丙二醛含量的影響

不同處理?xiàng)l件對(duì)葉片丙二醛含量的影響均不同（圖4）。

在各處理時(shí)間下，處理劑量為2.6、5.2 J/cm2時(shí)葉片的MDA含量高于對(duì)照組，但未達(dá)到顯著水平；處理劑量為10.4、208、41.6 J/cm2時(shí)MDA含量低于對(duì)照組，且各處理時(shí)間的最低點(diǎn)均出現(xiàn)在20.8 J/cm2劑量下。處理時(shí)間為1、2、3 min時(shí)最大降幅分別為10.3%、15.3%、7.8%，并于處理劑量為20.8 J/cm2，處理時(shí)間為1、2 min時(shí)與對(duì)照差異達(dá)到顯著水平。

2.5 激光處理對(duì)葉片酶活性的影響

不同處理劑量、處理時(shí)間下，激光處理對(duì)SOD、POD、CAT 3種自由基清除酶活性影響的曲線均呈先減小、后增大、再減小的變化趨勢(shì)（圖5至圖7）。不同激光輻照時(shí)間下，SOD、CAT活性的最低點(diǎn)均出現(xiàn)在劑量5.2 J/cm2；POD活性的最低點(diǎn)出現(xiàn)在劑量2.6 J/cm2。在各處理時(shí)間下，3種酶活性的最高點(diǎn)均出現(xiàn)在劑量20.8 J/cm2。處理時(shí)間為1、2、3 min時(shí)，SOD的增加幅度分別為39.0%、60.0%、30.0%；POD的增加幅度分別為79.5%、130.8%、53.8%；CAT的增加幅度分別為34.9%、46.8%、27.0%。處理劑量為20.8 J/cm2時(shí)，各處理時(shí)間下對(duì)3種酶活性的影響均達(dá)到顯著水平，效果最顯著的處理劑量、處理時(shí)間分別為20.8 J/cm2、2 min。

3 結(jié)論與討論

處理時(shí)間相同而處理劑量不同時(shí)，與植株抗寒性相關(guān)的各項(xiàng)指標(biāo)的最大變化幅值均出現(xiàn)在劑量20.8 J/cm2；處理劑量相同而處理時(shí)間不同時(shí)，低處理劑量下的處理時(shí)間越長，越利于各項(xiàng)生理生化指標(biāo)的變化，因此低劑量時(shí)3 min的輻照效果較明顯。由各組數(shù)據(jù)曲線可知，輻照時(shí)間3 min下隨著輻照劑量的增加，與植物抗冷害相關(guān)的各項(xiàng)指標(biāo)的變化趨勢(shì)卻不利于增強(qiáng)植物的抗逆性，相比之下最好的處理效果出現(xiàn)于2 min的處理時(shí)間。由此可見，He-Ne激光輻照小麥種子提高植株抗寒性的最佳處理?xiàng)l件為：處理劑量20.8 J/cm2、處理時(shí)間2 min。

當(dāng)小麥葉片受到低溫脅迫后，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)遭到破壞且透性增大，使細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)外滲，導(dǎo)致小麥組織浸泡液的電導(dǎo)率增大。所測(cè)得的電導(dǎo)率越大，植物葉片的抗寒性越弱，植物組織所受傷害越大；電導(dǎo)率越小，植物葉片的抗寒性越強(qiáng)，植物組織所受傷害越小[11]。以適宜作用劑量、作用時(shí)間的 He-Ne 激光輻照小麥干種子，可降低小麥幼苗葉片浸出液的相對(duì)電導(dǎo)率，因?yàn)榧す庾饔檬辜?xì)胞膜功能受損或結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致細(xì)胞膜透性增大，電解質(zhì)外滲增強(qiáng)，從而使浸出液電導(dǎo)率增大；而劑量為20.8 J/cm2的激光輻照使浸出液電導(dǎo)率降低，是由于激光對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)的修復(fù)作用[12]?？扇苄缘鞍缀颗c植物的抗寒能力關(guān)系密切，低溫脅迫條件會(huì)使植物體內(nèi)的可溶性蛋白含量降低，而一定劑量的He-Ne激光輻照可有效提高葉片的可溶性蛋白含量，從而提高有機(jī)體的抗寒能力。

植物處于冷害脅迫條件時(shí)，其體內(nèi)的游離脯氨酸起著維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)滲透壓等保護(hù)作用，使植株表現(xiàn)出抗冷害性。適宜作用劑量、作用時(shí)間的激光處理可使植株葉片積累更多的脯氨酸，使水勢(shì)大幅降低，從而增強(qiáng)植物細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)能力，使植株的抗冷害能力更強(qiáng)。MDA是膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，MDA含量是衡量質(zhì)膜受損傷程度的標(biāo)準(zhǔn)。He-Ne激光可影響葉片細(xì)胞膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的完整性，從而大幅降低葉片的MDA含量，并降低膜脂過氧化作用，以維護(hù)質(zhì)膜的完整性，減輕低溫條件對(duì)質(zhì)膜的傷害，使植株具有更強(qiáng)的抗冷害能力。SOD、POD、CAT是植物細(xì)胞防御系統(tǒng)中重要的保護(hù)酶類，可清除超氧物陰離子自由基，在冷害脅迫條件下，3種酶的活性增加越多，植株的防凍害能力越強(qiáng)[11]。He-Ne激光輻照一方面可直接影響植物蛋白、酶作用物復(fù)合體及其生物分子結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)酶的合成，以使酶活發(fā)生改變；另一方面可通過酶直接作用于細(xì)胞DNA，使DNA發(fā)生改變轉(zhuǎn)錄將信息傳給RNA，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活動(dòng)，從而產(chǎn)生新的酶或其他蛋白質(zhì)分子，以增強(qiáng)酶的活性和蛋白含量，提高植物的抗冷害性[13]。條件適宜的激光處理可使植株葉片3種保護(hù)酶的活性大幅提高，在處理劑量20.8 J/cm2、處理時(shí)間2 min時(shí)，SOD、POD、CAT酶活性的最大增幅分別為60.0%、130.8%、46.8%。低溫脅迫條件下，植物細(xì)胞的代謝失調(diào)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧自由基，而激光輻照作用使3種酶的活性大幅增強(qiáng)，從而提高植物體清除自由基的能力。因此，最佳處理?xiàng)l件的激光輻照能有效提高植株的抗寒性。

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